早竹叢枝病的調查及病原菌的分子鑒定

耿顯勝，張 威，仲建平，張守科，舒金平

(1.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省德清縣林業(yè)技術推廣站，浙江 德清 313200)

早竹叢枝病的調查及病原菌的分子鑒定

耿顯勝1，張 威1，仲建平2，張守科1，舒金平1

(1.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省德清縣林業(yè)技術推廣站，浙江 德清 313200)

目的對早竹叢枝病進行調查及病原菌分子鑒定，為早竹叢枝病的病害診斷和防治提供科學依據(jù)。方法采用單株水平和單枝盤水平的2種病害分級標準對早竹叢枝病進行調查。使用植原體16S rDNA和真菌rDNA-ITS序列的特異性PCR引物，對早竹叢枝病的病原菌進行分子鑒定。結果調查的6塊樣地早竹叢枝病的平均發(fā)病率為18.59%，平均病情指數(shù)為6.67。感病的早竹DNA樣品能夠擴增出真菌的rDNA-ITS序列，而不能夠擴增出植原體的16S rDNA序列；擴增出的序列與報道的竹針孢座囊菌的序列同源性達到99.00%，與其它真菌的序列同源性最高僅為94.00%。結論浙江省德清縣早竹叢枝病的病原菌為竹針孢座囊菌。

早竹；竹子叢枝?。恢襻樻咦揖?；分子鑒定；病情指數(shù)

Abstract:[Objective]In this study, the witches’ broom disease ofPhyllostachyspraecoxwas assessed, and the pathogen of the disease was identified through molecular biology techniques. [Method]The disease severity was assessed by grading witches’ broom disease at individual level and branch level. The pathogen of witches’ broom disease ofPh.praecoxwas identified by specific PCR primers of phytoplasmal 16S rDNA and fungal rDNA-ITS sequences. [Result]Disease assessment data showed that the average incidence of the 6 plots was 18.59%, and the average disease index was 6.67. PCR results indicated that all the samples infected were able to amplify rDNA-ITS sequence of fungus, and could not amplify 16S rDNA of phytoplasma. Comparative BLAST analysis determined that the amplicons shared 99.00% similarity with sequences fromAciculosporiumtake, and the highest similarity with other fungi was only 94.00%. [Conclusion]A.takewas the causal agent of witches’ broom disease ofPh.praecoxof Deqing County, Zhejiang Province.

Keywords:Phyllostachyspraecox; bamboo witches’ broom;Aciculosporiumtake; molecular identification; disease index

早竹(PhyllostachyspraecoxC. D. Chu et C. S. Chao)筍期早、產量高、筍味美、營養(yǎng)價值高，是我國南方的重要筍用竹種[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，我國南方早竹的種植面積在6.7萬hm2以上，年產值達10億多元[3]；浙江省是早竹的主要種植區(qū)，僅德清縣種植的早竹就有0.7萬hm2，年產值近億元。早竹在浙江省林業(yè)經濟發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，種植早竹已經成為林農增收致富的重要手段。然而，早竹卻是叢枝病的易感竹種，絕大多數(shù)早竹林地都有叢枝病發(fā)生，發(fā)病嚴重林地的發(fā)病率高達52.2%[4-5]。

竹子叢枝病是竹類植物上的重要病害，發(fā)生普遍，危害嚴重，造成竹子長勢衰弱、出筍減少、嚴重者整株枯死[6-7]，影響竹子生長和竹林的可持續(xù)經營。引起竹子叢枝的原因眾多，有病原菌侵染造成的，有昆蟲取食引起的，也有自然發(fā)生的[8-9]。在我國，已報道的病原菌有竹針孢座囊菌(AciculosporiumtakeMiyake)、植原體(CandidatusPhytoplasma)、竹異香柱菌屬(Heteroepichloё Tanaka)和竹暗球腔菌(PhaeosphaeriabambusaeMiyake et Hara)4類，并且在不同竹種上引起叢枝病的病原菌不同，同一竹種上也可能存在多種病原菌混合侵染[9-11]。這些因素增加了竹子叢枝病病原研究的難度和復雜性，導致當前早竹叢枝病的研究止步不前。本研究采用單株水平和單枝盤水平的病害分級標準對浙江省德清縣的早竹叢枝病進行了調查；利用叢枝病病原細菌和真菌的特異性PCR引物，采用分子生物學的方法對該地區(qū)的早竹叢枝病病原菌的保守序列進行擴增、克隆和序列分析，明確了引起早竹叢枝病的病原菌。本文研究結果可為早竹叢枝病的病害診斷和防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試植物材料 早竹叢枝病的樣品采集于浙江省德清縣的萬畝早竹林。使用高枝剪剪取具有叢枝癥狀的小枝，每株早竹上只取1份樣品，每兩份樣品之間間隔50m以上。剪取的樣品裝于自封袋中，每個自封袋裝1份，樣品采集完后立即帶回實驗室，保存于-80℃超低溫冰箱待用。同時在沒有叢枝病發(fā)生的地塊采集早竹小枝作為陰性對照材料。在中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所試驗林場，使用高枝剪剪取具有叢枝癥狀的泡桐(Paulowniaspp.)枝條作為陽性對照材料。

1.1.2試劑和引物 植物基因組DNA提取試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、DNA克隆試劑盒、TOP10感受態(tài)細胞和2×PCR MasterMix購于天根生化科技(北京)有限公司；DNA分子量標準DL2000購于寶生物工程(大連)有限公司。試驗用到的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA測序由鉑尚生物技術(上海)有限公司完成。

1.2早竹叢枝病的調查方法

早竹叢枝病發(fā)生嚴重期，在浙江省德清縣選取6塊樣地進行病害調查。參照陳建寅等[5]的方法在每塊樣地中設置3個小樣方，采用人眼觀察法對每個樣方的每株竹子進行調查，記錄樣方中竹子總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)、發(fā)病株總枝盤數(shù)、感病枝盤數(shù)和感病枝盤的病情等級。

參照陳建寅[5]的方法將竹子單株水平的病情分為5級，依據(jù)觀察和文獻描述的竹子叢枝病病害癥狀的發(fā)展規(guī)律[12-13]，將單枝盤水平上的病情分為5級，具體分級標準見表1。早竹發(fā)病率和病情指數(shù)的計算公式如下：

1.3早竹叢枝病材料的總DNA提取

將保存于超低溫冰箱的樣品取出，使用干凈的剪刀剪碎，置于研缽中，添加液氮研磨成粉末。稱取0.1g左右的粉末，依據(jù)天根生化科技(北京)有限公司的植物材料DNA提取試劑盒的操作步驟進行DNA提取。以具有叢枝癥狀的泡桐枝條作為陽性對照樣品，無叢枝癥狀的早竹小枝作為陰性對照樣品。提取的總DNA采用凝膠電泳法檢測其質量。

1.4早竹叢枝病病原菌的分子鑒定

1.4.1早竹叢枝病植原體病原的16SrDNA序列擴增 以提取的總DNA為模板，采用Duduk等[14]報道的引物對R16mF2/R16mR1(5’-CATGCAAGTC-GAACGGA-3’/5’-TTAACCCCAATCATCGAC-3’)和R16F2n/R16R2(5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’/5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’)進行巢式PCR擴增，擴增的植原體16SrRNA基因片段大小約為1200bp。擴增使用的反應體系為：2×PCRMix10μL，10mmol·L-1的正、反向引物各0.6μL，模板1μL，加ddH2O補足20μL。巢式PCR第1輪的反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，

表1 竹子叢枝病的病情分級

60℃退火30 s，72℃延伸90 s；72℃下延伸10 min，循環(huán)數(shù)為30。第1輪PCR的產物稀釋20倍后取1 μL作為第2輪PCR的模板，PCR擴增的體系同上。第2輪PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s；72℃延伸10 min，循環(huán)數(shù)為38。取5 μL第2輪PCR產物，使用0.9%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。電泳結束后在凝膠成像儀上照相記錄結果。

1.4.2 早竹叢枝病真菌病原的rDNA-ITS序列擴增 以提取的總DNA為模板，采用報道的引物對ITS1-F/ITS4(5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3’/5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增[15-16]，擴增的真菌rDNA-ITS序列片段大小約為600 bp。擴增時使用的反應體系為：2 × PCR Mix 10 μL，10 mmol·L-1的正、反向引物各0.4 μL，模板1 μL，加ddH2O 補足20 μL。PCR的反應條件為：94℃預變性5 min；95℃變性35 s，55℃退火55 s，72℃延伸60 s；72℃下延伸10 min，循環(huán)數(shù)為35。取5 μL的PCR產物，使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。電泳結束后在凝膠成像儀上照相記錄結果。

1.4.3 PCR產物的純化、克隆和序列分析 PCR產物經凝膠電泳檢測，陽性擴增子使用普通DNA產物純化試劑盒純化。純化的PCR產物連接到pLB載體，連接的反應體系為：pLB載體0.5 μL、Insert DNA 0.6 μL、2 × Reaction Solution 0.5 μL、Blunting Enzyme 0.25 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL，最后加ddH2O補足至5 μL。全部連接產物轉移到50 μL的感受態(tài)細胞中進行轉化，轉化的試驗程序參照感受態(tài)細胞使用說明書進行。

1.5數(shù)據(jù)處理

病害調查的原始試驗數(shù)據(jù)使用Excel2010和SPSS13.0軟件進行計算和處理。測定的序列采用NCBI上的BlastN軟件進行在線比對，利用DNAMAN6.0軟件進行多重序列比對和同源性分析。多重比對時使用的其它序列來源于GenBank，其登陸號如下：AB066292、AB066293、AB086846、AB065423、EF363682、EF363683。

2 結果與分析

2.1早竹叢枝病的調查結果

本試驗在浙江省德清縣的萬畝早竹林共調查了6塊樣地的18個樣方，病害調查結果見表2。6塊樣地叢枝病發(fā)病率變化較大，最高發(fā)病率為43.23%，最低為6.08%，平均發(fā)病率為18.59%。樣地病情指數(shù)最高為14.99，最低為1.52，平均病情指數(shù)為6.67。各樣方感病株平均病情指數(shù)最高為31.15，最低為0，平均病情指數(shù)為11.86。

從表2中也可看出，在相同樣方中其樣方病情指數(shù)與感病株平均病情指數(shù)存在差異，絕大多數(shù)樣方病情指數(shù)小于感病株平均病情指數(shù)。而不同樣方間進行比較時，即使樣方病情指數(shù)相同，其感病株平均病情指數(shù)也不同。如6號樣地的樣方2、4號樣地的樣方2和2號樣地的樣方2的樣方病情指數(shù)都為11.36，但其感病株的平均病情指數(shù)分別為31.15、11.16和14.34，表明6號樣地的樣方2與4號樣地的樣方2和2號樣地的樣方2相比，其感病株上的小枝發(fā)病更為嚴重。故將單株水平和單枝盤水平的病情分級同時用于叢枝病的調查，能更好的反映叢枝病在樣地中發(fā)生情況。

表2 早竹叢枝病的病害調查結果

2.2早竹叢枝病材料的總DNA提取結果

本研究提取了表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹材料、健康的早竹材料和表現(xiàn)叢枝癥狀的泡桐材料的總DNA。提取的總DNA樣品進行凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)樣品的總DNA帶大小一致、清晰明亮，無明顯拖尾現(xiàn)象，亦無蛋白質和RNA污染(圖1)。因此，本研究提取的總DNA濃度高、純度好、降解少，可以用于后續(xù)的分子生物學試驗。

M：DL2000；122：表現(xiàn)叢枝癥狀的小枝；23：健康的小枝Lane M: DL2000; lane 122: The twigs showing symptoms of witches' broom disease; lane 23:healthy twigs圖1 早竹小枝提取的總DNA電泳圖Fig.1 Totle DNA extracted from the twigs of Ph. praecox

2.3早竹叢枝病植原體病原的分子鑒定

采用引物對R16mF2/ R16mR1和R16F2n/ R16R2對提取的DNA樣品進行巢式PCR擴增，PCR擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。結果表明，泡桐叢枝病材料的DNA樣品能夠擴增出約1200bp的條帶，而所有早竹的DNA樣品均不能夠擴增出清晰的1200bp的條帶(圖2)。表明樣品中沒有植原體DNA存在，即收集的早竹叢枝病材料的病原菌非植原體。

M: DL2000；122: 感病的早竹小枝；23: 健康的早竹小枝；24: 感病的泡桐小枝Lane M: DL2000; lane 122: Infected Ph. praecox; lane 23: Healthy Ph. praecox; lane 24: Infected paulownia圖2 巢式PCR擴增植原體16S rRNA基因的片段Fig.2 Nested PCR amplification of the partial fragment of 16S rRNA gene

2.4早竹叢枝病真菌病原的rDNA-ITS序列擴增

采用引物對ITS1-F/ITS4對提取的DNA樣品進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。從結果可以看出，所有表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹樣品都能夠擴增出約600bp的DNA條帶，而表現(xiàn)健康的早竹樣品不能夠擴增出相同大小的條帶(圖3)，表明在感病的早竹樣品中存在真菌病原物。

M: DL2000；122: 表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹小枝；23: 健康的早竹小枝Lane M: DL2000; lane 122: Infected Ph. praecox; lane 23: Healthy Ph. praecox圖3 PCR擴增病原真菌的ITS序列Fig.3 PCR amplification of rDNA-ITSsequences of fungus

2.5PCR產物的純化、克隆和序列分析

3 討論

竹子叢枝病是廣泛發(fā)生于亞洲東部竹產區(qū)的重要病害，早在20世紀初，日本學者就對其病原物進行研究，到目前已經鑒定的竹子病原菌有植原體、竹針孢座囊菌、竹暗球腔菌、竹異香柱菌等[9-10]，并且這些病原菌還會以混合侵染的形式存在于某一竹種上。這不僅造成竹林經營中的產量損失，也會給竹子叢枝病病原物的鑒定、致病性研究、抗病育種、病害防治等科學研究帶來困難。而本研究使用植原體16SrDNA和真菌rDNA-ITS序列特異性的引物對竹子叢枝病材料的病原菌進行分子鑒定，能夠全面、準確地鑒定發(fā)病材料的病原菌。

植原體是一類能夠引起1000多種植物發(fā)病的病原細菌，而叢枝癥狀是植原體侵染時產生的典型癥狀之一，故植物出現(xiàn)叢枝癥狀，常被懷疑為植原體侵染。事實上，在中國、韓國、印度、日本等國均有植原體引起的竹子叢枝病的報道[17-20]。本研究在浙江省德清縣萬畝早竹林采集到28份表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹材料，使用試劑盒提取總DNA。利用植原體檢測時使用的引物進行植原體保守序列16SrDNA的擴增，檢測樣品中的植原體病原物。然而，作者只在感病的泡桐DNA樣品(陽性對照)中擴增出了目的片段，在所有感染叢枝病的早竹樣品中均沒有擴增出目的片段，表明早竹叢枝病材料中不存在植原體，即本研究的早竹叢枝病不是由植原體引起。

細胞核DNA中的轉錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer，ITS)既具有保守性，又在科、屬、種水平上具有特異性的自身優(yōu)點；并且在基因庫中存放有超過172000條全長的真菌ITS序列，可以通過在線比對快速確定要鑒定物種的分類信息，故ITS廣泛地用于單個真菌和環(huán)境中的真菌混合物的物種鑒定[21-22]。在本研究中，使用rDNA-ITS序列特異引物對ITS1-F/ITS4進行擴增時，所有感病的早竹DNA樣品均能夠擴增出約600bp的目的條帶，而健康的早竹樣品在該位置沒有擴增出條帶，只在約700bp處出現(xiàn)一條較弱的雜帶，該雜帶可能由竹子內生菌污染造成。擴增出的目的條帶克隆到載體pLB并進行測序、序列分析和在線比對，發(fā)現(xiàn)其與報道的竹針孢座囊菌的序列同源性為99.00%，確證早竹叢枝病的病原物為麥角菌科(Clavicipitaceae)的竹針孢座囊菌。竹針孢座囊菌的主要傳播方式是分生孢子通過春雨傳播[23-24]，因此，可在其分生孢子散發(fā)之前鏟除發(fā)病的竹株，防止病原菌的擴散和蔓延。

通過樣方法對浙江省德清縣的早竹進行叢枝病病害調查，6塊樣地18個樣方的平均發(fā)病率為18.59%，平均病情指數(shù)6.67，表明調查的早竹林輕度發(fā)生叢枝病。本次的早竹叢枝病的調查結果與陳建寅等[5]和劉軍等[25]的調查結果相比，浙江德清的早竹發(fā)病較輕，這可能與目前的早竹林地的經營方式有關。通過比較樣方的病情指數(shù)與各樣方感病株的平均病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩者之間并不完全一致。樣方的病情指數(shù)反映的是樣方的感病水平，表現(xiàn)為樣方的總體感病情況，其在調查統(tǒng)計時只考慮發(fā)病枝條的數(shù)量多少，而忽略了發(fā)病株不同枝條上的叢枝病的嚴重程度的差異性。而本研究依據(jù)竹叢枝病的病害表觀癥狀的發(fā)展進行分級，對感病株的各盤枝條的發(fā)病程度進行逐一統(tǒng)計，并計算樣方中感病株的病情指數(shù)，詳細地記錄病害在單株早竹上的嚴重程度。故兩種病情分級的綜合能夠更全面地反映叢枝病在早竹上的危害狀況和嚴重程度。

4 結論

本研究采用細菌和真菌保守序列的PCR引物對早竹叢枝病的病原物進行分子鑒定，結果表明，早竹叢枝病的病原物為竹針孢座囊菌；通過對病害進行調查和統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)叢枝病在浙江德清集約經營林地的早竹上輕度危害，尚不會對生產經營造成重大的經濟損失。本文研究結果可為早竹叢枝病的病害調查、診斷、防治以及防治效果的評價提供科學依據(jù)。

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(責任編輯：金立新)

DiseaseSeverityAssessingandMolecularIdentificationofPathogenAssociatedwithWitches’BroomDiseaseofPhyllostachyspraecox

GENGXian-sheng1,ZHANGWei1,ZHONGJian-ping2,ZHANGShou-ke1,SHUJin-ping1

(1.Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400, Zhejiang, China;2.Forestry Technology Extension Station of Deqing County, Zhejiang Province, Deqing 313200, Zhejiang, China)

S795.9

A

1001-1498(2017)05-0805-07

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.014

2016-12-15

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(CAFYBB2014QA006)。

耿顯勝(1982—)，男，河南信陽人，助理研究員，博士，研究方向為森林保護學.