草木樨中華根瘤菌CHW10B溶磷特性及其對南方紅豆杉的促生作用

李云玲，侯沁文，劉瑞祥，任嘉紅，張 易

(1.長治學院生物科學與技術(shù)系，山西 長治 046011； 2.太行山生態(tài)與環(huán)境研究所，山西 長治 046011)

草木樨中華根瘤菌CHW10B溶磷特性及其對南方紅豆杉的促生作用

李云玲1, 2，侯沁文1, 2，劉瑞祥1, 2，任嘉紅1, 2*，張 易1

(1.長治學院生物科學與技術(shù)系，山西 長治 046011； 2.太行山生態(tài)與環(huán)境研究所，山西 長治 046011)

目的探討南方紅豆杉根際微生物草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)CHW10B的溶磷特性及促生作用。方法利用液體發(fā)酵試驗比較不同時間、碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)溫度等條件下CHW10B菌株的溶磷量，采用溫室盆栽法研究該菌株對南方紅豆杉生長的影響，并分析該菌株產(chǎn)嗜鐵素、精氨酸脫羧酶、ACC脫氨酶及有機酸等成分的能力。結(jié)果該菌株分別在培養(yǎng)時間4 d、磷酸鈣5.00 g·L-1、初始pH值 7.0、裝液量1/2、NaCl為0.0 g·L-1、溫度30℃、碳源為葡萄糖、氮源為硫酸銨、碳氮比100∶1時溶磷能力最強。將該菌株接種于1年生南方紅豆杉實生苗360 d后，苗木的地徑、苗高、生物量比對照分別增長了19.53%、20.14%、25.39%。該菌株能夠產(chǎn)嗜鐵素、精氨酸脫羧酶、ACC脫氨酶(0.922 U·mg-1)和IAA(8.908 mg·mL-1)，并可分泌大量有機酸—葡萄糖酸(5 704.92 μg·L-1)。結(jié)論草木樨中華根瘤菌CHW10B溶磷能力強，對南方紅豆杉促生作用顯著，適用于多種不同酸堿性土壤，可高效應用于南方紅豆杉的人工栽培，具有被開發(fā)為生物肥料的潛力。

草木樨中華根瘤菌；南方紅豆杉；溶磷；促生作用

Abstract:[Objective] A phosphate-solubilizing bacterium,SinorhizobiummelilotiCHW10B, was selected fromTaxuschinensisvar.mairei. Its phosphate-solubilizing characteristics and growth-promoting effect onT.chinensisvar.maireiwere studied. [Method] The effects of culture time, Ca3(PO4)2concentration, carbon sources, nitrogen sources, initial pH, liquid filling volume, salt ions and other environment factors on phosphate solubilizing ability of strain CHW10B were studied by liquid fermentation experiment. Pot experiment was conducted to evaluate the role of strain CHW10B in promoting the growth ofT.chinensisvar.mairei. Some growth-promoting mechanism such as producing ACC deaminase, siderophore, indoleacetic acid, arginine decarboxylase and organic acid were determined. [Result]The results showed that CHW10B strain displayed the highest phosphate-dissolving capacity when the cultivation period was 4 days, the amount of calcium phosphate was 5.00 g·L-1, the initial pH reached 7.0，the volume of liquid was 1/2, the NaCl concentration was 0.0 g·L-1and the temperature was 30℃. The phosphate solubilizing capacity of the strain got the highest when using glucose as carbon source and ammonium sulfate as nitrogen source. Moreover, the ratio of carbon to nitrogen (100∶1) is optimum for strain CHW10B. After being inoculated with strain CHW10B, the ground diameter, seedling height and biomass of 1-year-oldT.chinensisvar.maireiseedlings increased by 19.53%, 20.14% and 25.39% in 360 days’ post-inoculation, respectively. The strain could produce siderophore, arginine decarboxylase, ACC deaminase (0.922 U·mg-1) and IAA (8.908 mg·mL-1), and secrete a large amount of gluconic acid (5 704.92 μg·L-1). [Conclusion]S.melilotiCHW10B has strong phosphorus-solubilizing capability, and plays a significant promoting role in the growth ofT.chinensisvar.mairei. The strain can be applied to a variety of soils of different acidity-alkalinity. The result would be an important reference for further exploring of the CHW10B strain in production of bio-fertilizer and high efficient cultivation onT.chinensisvar.mairei, etc.

Keywords:Sinorhizobiummeliloti;Taxuschinensisvar.mairei; phosphate-solubilization; growth-promoting effect

南方紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger) Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu)是我國一級保護野生瀕危藥用植物，采取人工栽培措施，在一定程度上能夠克服南方紅豆杉天然林生長緩慢、資源緊缺的問題[9]。本課題組前期從南方紅豆杉根際分離篩選到1株高效溶無機磷細菌——草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)CHW10B，經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對南方紅豆杉60 d實生苗幼苗期生長有明顯的促生作用[8]，并能穩(wěn)定地定殖于南方紅豆杉根際和根部[10]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進一步探討該菌株產(chǎn)IAA、ACC脫氨酶、嗜鐵素及精氨酸脫羧酶等促生長特性，分析比較其溶磷特性及對1年生南方紅豆杉的促生效果，旨在完善該菌株的系統(tǒng)研究，為高效利用該菌株以更好提高南方紅豆杉人工栽培效率、豐富生物肥料菌種資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1供試菌株

高效溶磷草木樨中華根瘤菌CHW10B，由本課題組前期從南方紅豆杉根際分離篩選得到。

1.2供試植物

南方紅豆杉1年生盆栽實生苗，栽培于長治市林業(yè)局苗圃。

1.3供試培養(yǎng)基

2 研究方法

2.1CHW10B菌株溶磷動態(tài)

2.2磷酸鈣濃度對CHW10B菌株溶磷能力的影響

向滅菌的NBRIP培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0.63、1.25、2.50、5.00、10.00g·L-1的磷酸鈣，按1%接種量接入CHW10B種子液。各處理均設3個重復和1個空白對照，在30℃、180r·min-1培養(yǎng)最適天數(shù)(4d)后，取適量發(fā)酵液測定可溶性磷含量，方法同2.1。

2.3碳源、氮源、碳氮比對CHW10B菌株溶磷能力的影響

將葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖和可溶性淀粉分別按1%比例加入到NBRIP液體培養(yǎng)基中作為唯一碳源；將(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨分別按0.1‰的比例加入NBRIP液體培養(yǎng)基中作為唯一氮源；以最適的碳源和氮源，將NBRIP培養(yǎng)基的C/N調(diào)到150/1、125/1、100/1、75/1、50/1和25/1。每處理設3個重復和1個空白對照，按1%接種量進行接種，在30℃、180r·min-1培養(yǎng)最適天數(shù)(4d)后，測定可溶性磷含量，方法同2.1。

2.4溫度、pH值、裝液量、NaCl濃度對CHW10B菌株溶磷能力的影響

按1%的接種量將CHW10B種子液接入到NBRIP液體培養(yǎng)基中，設置培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35、40℃；將NBRIP液體培養(yǎng)基pH值分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10；分別將20、40、50、60、80mLNBRIP培養(yǎng)基加入到100mL三角瓶中，使其體積比分別為1/5、2/5、1/2、3/5、4/5；調(diào)節(jié)NBRIP培養(yǎng)基的NaCl濃度為0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0g·L-1。各處理設3個重復和1個空白對照，30℃、180r·min-1培養(yǎng)最適天數(shù)(4d)后，測定可溶性磷含量，方法同2.1。

2.5CHW10B菌株產(chǎn)有機酸、ACC脫氨酶、IAA、ADC、嗜鐵素能力測定

參考Saleh等[11,13]的研究方法進行CHW10B菌株ACC脫氨酶活性測定，IAA含量測定采用Salkowski比色法[14]，產(chǎn)精氨酸脫羧酶(ADC)能力測定參照Sun等[15]的方法，產(chǎn)嗜鐵素參照Yu等[16]的方法采用CAS平板進行定性檢測。

2.6CHW10B菌株對1年生南方紅豆杉的促生作用

3 結(jié)果與分析

3.1CHW10B菌株溶磷量動態(tài)變化

從圖1可看出：前4dCHW10B菌株培養(yǎng)液的可溶磷含量逐漸增加，到第4天時達到峰值(757.752mg·L-1)，此時溶磷能力最強；4d后該菌的溶磷能力明顯降低，但到第7天卻有所回升，回升原因可能是培養(yǎng)后期營養(yǎng)耗盡，菌體細胞大量死亡裂解導致可溶性磷釋放。以上結(jié)果說明，該菌株溶磷的最佳培養(yǎng)時間為4d。

3.2磷酸鈣濃度對CHW10B菌株溶磷能力的影響

3.3碳源、氮源、碳氮比對CHW10B菌株溶磷能力的影響

3.3.1碳源對CHW10B菌株溶磷能力的影響 圖3表明：不同碳源明顯影響CHW10B菌株溶解磷酸鈣的能力；以葡萄糖為唯一碳源時，該菌株溶磷能力最強，溶磷量達740.310mg·L-1；其次為果糖(79.457mg·L-1)；以麥芽糖、甘露醇、蔗糖和可溶性淀粉為碳源時，溶磷量大幅降低，尤其以可溶性淀粉為碳源時，溶磷量最小(2.907mg·L-1)。由此可知，葡萄糖為CHW10B菌株充分發(fā)揮其溶磷功能的最適碳源。因此，在CHW10B菌株的實踐應用中，應考慮與可以降解土壤中多糖的菌株結(jié)合使用。

圖2 不同磷酸鈣濃度下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.2 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different calcium phosphate contents

圖3 不同碳源下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.3 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different carbon sources

圖4 不同氮源下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.4 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different nitrogen sources

3.3.2氮源對CHW10B菌株溶磷能力的影響 圖4表明：不同氮源條件下，CHW10B菌株溶磷能力差異顯著；以(NH4)2SO4為氮源時，CHW10B菌株的溶磷能力最強，溶磷量為738.372mg·L-1；以NH4NO3為氮源時，該菌株的溶磷能力比以(NH4)2SO4為氮源時略低(溶磷量為720.504mg·L-1)，但二者差異不顯著。以牛肉膏、酵母膏和蛋白胨為氮源時，該菌株的溶磷能力明顯下降，而以KNO3為氮源時，該菌株的溶磷能力最弱(溶磷量為179.201mg·L-1)。說明該菌株以NH4+為氮源時的溶磷能力明顯比以NO3-為氮源時的強，NH4+適合該菌株溶磷能力的充分發(fā)揮。因此，CHW10B菌株溶磷作用最適氮源為(NH4)2SO4，在實踐應用中與(NH4)2SO4沒有顯著差異的NH4NO3也可以考慮。

3.3.3碳氮比對CHW10B菌株溶磷能力的影響 以最適碳源(葡萄糖)和最適氮源(硫酸銨)分別作為碳源和氮源，比較不同C/N對CHW10B菌株溶磷能力的影響。圖5表明：不同C/N對CHW10B菌株的溶磷能力影響顯著；C/N≤100/1時，C/N越大，CHW10B菌株的溶磷能力越強；C/N>100/1，隨著C/N升高，該菌株的溶磷能力反而減弱。C/N為25/1時，該菌株的溶磷量最低(318.542mg·L-1)，C/N為100/1時，該菌株的溶磷量最高(684.108mg·L-1)，此時溶磷能力最強。

圖5 不同C/N下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.5 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different C/N

3.4環(huán)境條件對CHW10B菌株溶磷能力的影響

3.4.1初始pH值對CHW10B菌株溶磷能力的影響 圖6表明：隨著pH值的升高，CHW10B菌株的溶磷能力表現(xiàn)為先增長后降低；當初始pH值為10時，該菌株的溶磷能力最差，但可溶性磷含量仍達521.318mg·L-1；初始pH值為7時，該菌株的溶磷能力最強(727.713mg·L-1)。以上結(jié)果表明，CHW10B菌株對不同的pH值具有較強的適應能力，但中性條件最利于其溶磷功能的發(fā)揮，這也暗示了該菌株可以應用于多種不同酸堿性土壤中。

圖6 不同初始pH值下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化.6 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different initial pH

3.4.2裝液量對CHW10B菌株溶磷能力的影響 溶氧量對微生物的生長有重要作用，不同微生物對溶解氧需求也不同。裝液量是影響溶氧量的一個重要因素，裝液量越少，溶氧系數(shù)越大，溶氧量越多。圖7表明：CHW10B菌株在不同裝液量下均有一定的溶磷能力，但溶磷能力的強弱不同：裝液量400mL·L-1(2/5)和800mL·L-1(4/5)時，CHW10B菌株的溶磷能力差異不顯著；裝液量600mL·L-1(3/5)時，CHW10B菌株的溶磷能力最差；裝液量500mL·L-1(1/2)時，CHW10B菌株的溶磷能力最強，溶磷量高達750.001mg·L-1。由此可知，裝液量500mL·L-1(1/2)為本研究條件下CHW10B菌株溶磷的最適裝液量。

圖7 不同裝液量下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.7 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different liquid volume in flask

圖8 不同NaCl濃度下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.8 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different concentration of Nacl

圖9 不同溫度下CHW10B菌株培養(yǎng)液可溶磷含量的變化Fig.9 Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different temperature

3.5CHW10B菌株產(chǎn)有機酸能力

表1表明：CHW10B菌株發(fā)酵液產(chǎn)生有機酸，且有機酸總量為5710.82μg·L-1，比對照組的665.05μg·L-1高758.70%。CHW10B菌株分泌的有機酸為草酸和葡萄糖酸，與對照相比，雖然少了甲酸和檸檬酸，但其葡萄糖酸的產(chǎn)生量遠大于對照，分泌草酸的量與CK的相差不大。葡萄糖酸一方面能降低pH值從而溶解難溶性磷，另一方面還能與Al3+等螯合釋放磷酸根[17]。由此可見，CHW10B菌株發(fā)酵液良好的分泌葡萄糖酸的能力促進了其高效溶磷作用。

表1 CHW10B菌株分泌的有機酸種類和含量

注：“-”代表未檢測到。Note：“-” represents not detected.

3.6CHW10B菌株產(chǎn)ACC脫氨酶、IAA、嗜鐵素及精氨酸脫羧酶能力

經(jīng)測定，CHW10B菌株可以產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)和ACC脫氨酶，產(chǎn)IAA量為8.908mg·mL-1，其ACC脫氨酶比活力為0.922U·mg-1。采用CAS平板對CHW10B菌株進行產(chǎn)鐵載體定性測定，結(jié)果表明：CHW10B菌株能產(chǎn)生鐵載體(圖10)。圖11表明：該菌株還具有產(chǎn)精氨酸脫羧酶的能力。以上結(jié)果說明，CHW10B菌株具有多種植物促生特性。

圖10 CHW10B菌株的CAS平板檢測Fig.10 Siderophore production of strain CHW10B on CAS agar plates

圖11 CHW10B菌株產(chǎn)精氨酸脫羧酶定性測定結(jié)果Fig.11 Qualitative determination results of strain CHW10B on producing Arginine decarboxylase

3.7CHW10B菌株對南方紅豆杉的促生作用

南方紅豆杉1年生實生苗接種CHW10B菌株后360d的生長情況(表2)表明：接種CHW10B菌劑對南方紅豆杉生長具促進作用，與對照相比，南方紅豆杉實生苗地徑、苗高和生物量的增長率分別為19.53%、20.14%和25.39%。CHW10B菌株對南方紅豆杉實生苗生物量和苗高的促生作用達極顯著(P<0.01)，而對地徑的促生作用達顯著(P<0.05)。

表2 CHW10B菌株對南方紅豆杉生長的影響

注：同行不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05。

Note：The different small letters in the samerow mean the significant difference atP<0.05．

4 討論

溶磷微生物的溶磷作用并非一成不變，隨著外界環(huán)境或營養(yǎng)物質(zhì)的變化，其溶磷效果也發(fā)生改變[19]。許多研究表明，碳是影響溶磷菌生長繁殖和生理生化代謝包括溶磷作用等的最主要因素，不同溶磷菌株的最佳碳源及利用碳源的廣泛性存在明顯區(qū)別，如節(jié)桿菌1TCRi7只有以葡萄糖為碳源時才具有溶磷能力[20]；而洋蔥伯克霍爾德氏菌C5-A[17]、耳假單胞菌WB38[7]、泛菌屬溶磷菌D2[18]、熒光假單胞菌JW-JS1[21]和本研究中的草木樨中華根瘤菌CHW10B溶磷碳源較廣，以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等分別作為碳源時皆具有溶磷能力；在后4株菌中，除洋蔥伯克霍爾德氏菌C5-A以麥芽糖為碳源時溶磷作用最強外，其余均以葡萄糖為碳源時溶磷能力最強。草木樨中華根瘤菌CHW10B溶磷最佳碳源為葡萄糖也可能與其溶磷過程中產(chǎn)生大量的葡萄糖酸有關(guān)[19,22]。

不同溶磷微生物對不同氮源利用效率也不盡相同。本研究中，草木樨中華根瘤菌CHW10B以NH4+為氮源時的溶磷能力明顯比以NO3-為氮源時的強，以硫酸銨為氮源時溶磷能力最強，以硝酸銨為氮源時溶磷能力次之，而以硝酸鉀為氮源時的溶磷能力明顯降低，這與耳假單胞菌WB38[7]溶磷氮源情況相似，不同的是后者以硝酸銨為氮源時溶磷能力最強，硫酸銨次之。本研究結(jié)果與趙小蓉等[20]和范丙全等[23]發(fā)現(xiàn)的溶磷菌通常以NO3-為氮源時的溶磷量高于以NH4+為氮源時的溶磷量相反。另外，范丙全等[23]認為，使用銨態(tài)氮時主要分泌蘋果酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸，而硝態(tài)氮條件下幾乎不產(chǎn)生這些有機酸。本研究中，CHW10B菌株以(NH4)2SO4為氮源時產(chǎn)生大量的葡萄糖酸，并沒有產(chǎn)生其他有機酸，其具體原因有待進一步研究。

有研究表明，適當調(diào)整C/N值，溶磷微生物可能會釋放更多磷[21]，不同菌株對培養(yǎng)基中C/N值反應差異顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，當C/N<100/1時，隨培養(yǎng)基的C/N值升高，草木樨中華根瘤菌CHW10B的溶磷能力逐漸增強；當C/N=100/1時，草木樨中華根瘤菌CHW10B菌株溶磷能力最強，這與劉輝等[21]關(guān)于熒光假單胞菌JW-JS1菌株和趙小蓉等[20]關(guān)于歐文氏桿菌的研究結(jié)果相同；當C/N>100/1時，CHW10B菌株的溶磷能力逐漸減弱，與青霉和腸桿菌的結(jié)果[20]不一致，可能是因為不同菌株自身所適宜的C/N有所不同。

本研究中的草木樨中華根瘤菌CHW10B是分離自南方紅豆杉根際的高效溶磷菌株，具有在南方紅豆杉根際發(fā)展成優(yōu)勢種群的前提，該菌株除產(chǎn)生葡萄糖酸具有較強溶磷能力外，還可產(chǎn)ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶，具有多種植物促生特性。將該菌株制成菌劑作用于1年生南方紅豆杉實生苗后，具有良好的促生效應。在本課題組的前期研究中，CHW10B對60 d南方紅豆杉幼苗生長也表現(xiàn)出明顯的促生作用?？梢钥闯?，該菌株有望被制成生物肥料，應用于南方紅豆杉等的人工栽培，具有較高的應用潛力。若將該菌株更好應用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中，還需進一步結(jié)合實踐中土壤和周圍環(huán)境的實際情況，進行深入驗證。

5 結(jié)論

碳源、氮源、碳氮比和溫度等環(huán)境條件均對CHW10B菌株的溶磷能力有一定的影響，以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，且碳氮比為100/1時，該菌株的溶磷能力最強。該菌株溶磷能力最強的其他環(huán)境條件分別為培養(yǎng)時間4 d、磷酸鈣5.00 g·L-1、初始pH值7.0、裝液量1/2、NaCl為0.0 g·L-1、溫度30℃。將該菌株接種于1年生南方紅豆杉根部360 d后，發(fā)現(xiàn)其對南方紅豆杉有明顯的促生作用。經(jīng)檢測，該菌株除產(chǎn)生大量葡萄糖酸外，還產(chǎn)生可促進植物生長的IAA、ACC脫氨酶、嗜鐵素和精氨酸脫羧酶。鑒于該菌株對南方紅豆杉良好的促生作用，結(jié)合其溶磷特性，可將該菌株應用于南方紅豆杉的種植。

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(責任編輯：徐玉秀)

Phosphate-solubilizingCharacteristicsandGrowth-promotingEffectofSinorhizobiummelilotiCHW10BonTaxuschinensisvar.mairei

LIYun-ling1, 2,HOUQin-wen1, 2,LIURui-xiang1, 2,RENJia-hong1, 2,ZHANGYi1

(1.Department of Biological Science and Technology, Changzhi University, Changzhi 046011, Shanxi, China；2.Ecological and Environmental Research Institute of Taihangshan Mountains, Changzhi 046011, Shanxi, China)

S718.8

A

1001-1498(2017)05-0751-08

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.007

2017-02-15

國家自然科學基金項目(31100471);山西省重點學科建設經(jīng)費資助

李云玲(1976—)，女，碩士，講師.主要研究方向：環(huán)境微生物.電話: 13509755820. E-mail: lyl_0315@163.com

* 通訊作者：任嘉紅，博士，教授.主要研究方向：森林微生物.E-mail : renjiahong@163.com