曲伏前列素致高眼壓模型大鼠結(jié)膜充血的不良反應(yīng)機制研究

王洪宇，裴存文，法 利，段運動

（承德市中心醫(yī)院眼科，河北承德 067000）

曲伏前列素致高眼壓模型大鼠結(jié)膜充血的不良反應(yīng)機制研究

王洪宇＊，裴存文#，法 利，段運動

（承德市中心醫(yī)院眼科，河北承德 067000）

目的：研究曲伏前列素致高眼壓模型大鼠結(jié)膜充血的不良反應(yīng)機制。方法：將50只大鼠隨機分為正常對照組、模型組和曲伏前列素低、中、高劑量組（100、200、400 mg/kg），每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠右眼建立高眼壓模型，每天滴加相應(yīng)藥物1次，連續(xù)1周。末次給藥后體外分離并培養(yǎng)各組大鼠右眼角膜周圍血管內(nèi)皮細胞，檢測血管內(nèi)皮細胞活力、細胞凋亡情況和增殖相關(guān)因子（Ki-76）、凋亡相關(guān)因子（Bad、Bax）、凋亡抑制相關(guān)因子（Bcl-2、Bcl-xl）蛋白表達水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組大鼠血管內(nèi)皮細胞活力明顯降低，凋亡率明顯增加，Bad、Bax蛋白表達明顯增強，Bcl-2、Bcl-xl、Ki-76蛋白表達明顯減弱，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，曲伏前列素低、中、高劑量組大鼠血管內(nèi)皮細胞活力明顯降低，凋亡率明顯增加，Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達明顯減弱，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；曲伏前列素中、高劑量組大鼠血管內(nèi)皮細胞中Bad、Bax蛋白表達明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：曲伏前列素可能是通過促進高眼壓模型大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而降低其細胞活力，進而引發(fā)結(jié)膜充血這一不良反應(yīng)。

曲伏前列素；高眼壓；血管內(nèi)皮細胞；不良反應(yīng)；結(jié)膜充血；大鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the ADR mechanism of conjunctival hyperemia in model rats with prostacyclin-induced high intraocular pressure.METHODS：50 rats were randomly divided into normal control group，model group，prostacyclin low-dose，medium-dose，high-dose groups（100，200，400 mg/kg），10 in each group.Except for normal control group，right eyes of rats in other groups were established high intraocular pressure model，dropping corresponding medicine once a day，for 1 week.After last administration，the right eyes cornel peripheral corneal endothelial cells of rats in each group were isolated in vitro and cultured.Vascular endothelial cell viability，cell apoptosis and proliferation-related factor（Ki-76），apoptosis-related factors（Bad，Bax），inhibito of apoptosis-related factors（Bcl-2，Bcl-xl）protein expressions were detected.RESULTS：Compared with normal control group，vascular endothelial cell viability in model group were obviously decreased；apoptosis rate was obviously increased；Bad，Bax protein expressions were obviously enhanced；Bcl-2，Bcl-xl，Ki-76 protein expressions were obviously weakened，with statistical significances（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，vascular endothelial cell viability in prostacyclin low-dose，medium-dose，high-dose groups were obviously decreased；apoptosis rate was obviously increased；Bcl-2，Bcl-xl protein expressions were obviously weakened，with statistical significances（P＜0.05 or P＜0.01）；the Bad，Bax protein expressions in prostacyclin medium-dose，high-dose groups were obviously enhanced（P＜0.05 or P＜0.01），the other indexes had no statistical differences（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Prostacyclin may cause conjunctival hyperemia through promoting the apoptosis of cornel peripheral corneal endothelial cells of model rats with high intraocular pressure and decreasing the cell viability.

KEYWORDSProstacyclin；High intraocular pressure；Vascular endothelial cell；ADR；Conjunctival hyperemia；Rats

青光眼發(fā)病率高，為不可逆及不可修復(fù)的致盲性疾病，其病理特征為眼內(nèi)壓力持續(xù)性升高導(dǎo)致眼球內(nèi)部組織及功能受損，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、壞死，視乳頭損傷及進行性視野缺損[1-4]?！霸绨l(fā)現(xiàn)、早治療”對挽救患者視力及提高其生活質(zhì)量具有重要意義[5]。現(xiàn)階段治療青光眼主要為降眼壓、營養(yǎng)神經(jīng)及抗炎治療。滴眼液為便捷、簡潔的常用藥物治療手段之一[6-8]。曲伏前列素為α受體拮抗藥，可舒張外周血管[9]，臨床用于青光眼患者的降眼壓治療。滴眼后導(dǎo)致患者結(jié)膜充血是曲伏前列素的常見不良反應(yīng)，也在一定程度上降低了患者的依從性。本實驗經(jīng)國家藥物臨床試驗機構(gòu)（GCP）中心倫理委員會審核通過，擬觀察曲伏前列素對高眼壓模型大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞的影響，以期解釋其導(dǎo)致結(jié)膜充血這一不良反應(yīng)的發(fā)生機制，并為尋找合理有效的干預(yù)藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3111型CO2飽和濕度培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；TL 3001型高倍光學(xué)熒光顯微鏡（上海締倫光學(xué)儀器公司）；EasyCyte 8型流式細胞儀檢測儀（德國Merck公司）；XLLD-ⅢR型醫(yī)用離心機（河北鑫樂科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

曲伏前列素滴眼液（上海凡泰醫(yī)藥公司，批號：16120201，規(guī)格：2.5 mL∶0.1 mg）；內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒（南京華奧生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號：CK-0405）；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司，批號：1453373，純度：95%）；雙抗青-鏈霉素、羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）-異硫氰酸熒光素（FITC）二抗（上海遠慕生物科技有限公司，批號：15140-122、H20151201）；原位末端標(biāo)記法（TUNEL）凋亡試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：06L28cm）；鼠源Ki-76（增殖相關(guān)因子）、Bad（促凋亡基因）、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白（Bax）、B淋巴細胞瘤xl（Bcl-xl）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：1607331、1607314、1607336、1606324、1606307）。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量230～250 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（京）2016-2015。動物經(jīng)明暗光照交替飼養(yǎng)12 h后，于20～25℃下飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 高眼壓模型的建立

選取大鼠，ip給予10%水合氯醛（15 mL/g）進行全身麻醉，同時用鹽酸普魯卡因滴眼液進行眼球表面麻醉，顯微手術(shù)下于右眼前房注入硅油0.1 mL，建立高眼壓模型；左眼不作處理。

2.2 分組和給藥方法

采用隨機數(shù)字表法將50只大鼠隨機分為正常對照組、模型組和曲伏前列素低、中、高劑量組（100、200、400 mg/kg），每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠按“2.1”項下方法建立高眼壓模型，然后每組大鼠每天于右眼滴加相應(yīng)藥物1次，連續(xù)1周，正常對照組和模型組大鼠滴加等量的生理鹽水。曲伏前列素給藥劑量按人臨床常用劑量換算而得。

2.3 角膜周圍血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)

末次給藥后，體外分離各組大鼠右眼角膜周圍血管，待內(nèi)皮細胞爬片后，胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑15 cm，下同）離心3 min，棄上清，用5 mL新鮮含10%FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基重懸，輕輕吹打，制成單細胞懸液（原代細胞）；轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，首次換液；7～10 d后細胞達到融合，進行傳代，此時記為P1代，之后每2～3 d換液1次。每次傳代時計數(shù)，計算細胞倍增代數(shù)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況。

2.4 血管內(nèi)皮細胞的鑒定

[10]相關(guān)方法和內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒說明書操作，采用流式細胞術(shù)檢測各組大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD19、CD45的表達情況。將“2.3”項下原代細胞用胰酶消化后置于10 mL離心管中，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1次，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄PBS；加預(yù)冷的2%牛血清蛋白（BSA）2 mL，快速混勻，4℃封閉30 min；加入內(nèi)皮細胞鑒定試劑盒中的小鼠血管內(nèi)皮細胞特異性一抗（比例為1∶10），4 ℃孵育30 min；室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌3次后，用PBS重懸；加入羊抗鼠IgG-FITC二抗（比例為1∶100），4℃避光孵育30 min；用PBS洗滌2次后，用PBS重懸，用流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD19、CD45的表達情況。

2.5 CCK-8法測定血管內(nèi)皮細胞活力

參考文獻[11]相關(guān)方法和TUNEL凋亡試劑盒說明書要求，將“2.3”項下原代細胞以500個/孔鋪于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 h；每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定光密度（OD）。

2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡情況

參考文獻[12]相關(guān)方法，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況。將“2.3”項下原代細胞以70%密度爬片，待細胞完全穩(wěn)定貼壁后，固定，封閉；加入TUNEL反應(yīng)液，顯色，用光學(xué)熒光顯微鏡觀察顯紅色熒光的凋亡細胞。

2.7 Western blot法檢測細胞增殖與凋亡相關(guān)因子的蛋白表達

參考文獻[11]相關(guān)方法，采用Western blot法檢測細胞增殖及凋亡相關(guān)因子的表達。取“2.3”項下原代細胞，測定總蛋白濃度。分別取45 μg蛋白與等體積2倍的上樣緩沖液混勻后，100℃變性10 min，隨后進行不連續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離：5%濃縮膠，12%分離膠，80 V電泳20 min，待條帶遷移至分離膠上緣時調(diào)整為120 V電泳80 min；采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，350 mA電轉(zhuǎn)移60 min；封閉，PBS洗脫；加入鼠源Ki-76、Bad、Bcl-2、Bax、Bcl-xl多克隆抗體（稀釋比例1∶200），封口，孵育過夜后，洗膜3次；再加入二抗（稀釋比例1∶5 000），孵育1 h后洗膜3次；顯色，采用Imaga J軟件進行圖像的采集與分析。以目標(biāo)條帶的灰度值與內(nèi)參甘油醚-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值之比表示蛋白的表達水平。試驗重復(fù)6次。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 角膜周圍血管內(nèi)皮細胞形態(tài)與鑒定結(jié)果

原代細胞培養(yǎng)首次換液后，貼壁細胞多為單個長梭形細胞，偶爾可見幾個細胞的克??；細胞在傳代3次后，形態(tài)均一，呈長梭形，融合時呈漩渦狀生長。流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD19、CD45的結(jié)果顯示，體外分離細胞均表現(xiàn)CD44+（99.86±5.934）%、CD90+（95.10± 2.013）%、CD19－（0.68±0.612）%、CD45－（0.31±0.117）%，這一結(jié)果表明已成功建立大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體系。大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)圖見圖1。

3.2 血管內(nèi)皮細胞活力的測定結(jié)果

與正常對照組，其余各組大鼠血管內(nèi)皮細胞活力均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血管內(nèi)皮細胞活力均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且隨著曲伏前列素給藥劑量的增加血管內(nèi)皮細胞活力呈下降趨勢。各組大鼠血管內(nèi)皮細胞活力的測定結(jié)果見圖2。

3.3 血管內(nèi)皮細胞凋亡的測定結(jié)果

圖1 大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)圖（×400）Fig 1 Morphology of cornel peripheral corneal endothelial cells of rats（×400）

圖2 各組大鼠血管內(nèi)皮細胞活力的測定結(jié)果Fig 2 Determination results of vascular endothelial cell viability of rats in each group

正常對照組、模型組和曲伏前列素低、中、高劑量組大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡率分別為（2.21±1.36）%、（20.63±3.65）%、（28.13±4.37）%、（36.04±5.64）%、（49.26±5.86）%（n＝6）。與正常對照組比較，其余各組大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡率均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡率均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），且隨著曲伏前列素給藥劑量的增加血管內(nèi)皮細胞凋亡率呈上升趨勢。

3.4 血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡相關(guān)因子蛋白表達的測定結(jié)果

與正常對照組比較，其余各組大鼠血管內(nèi)皮細胞中Ki-76、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達均明顯減弱，Bad、Bax蛋白表達均明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血管內(nèi)皮細胞中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達均明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01）；曲伏前列素中、高劑量組大鼠血管內(nèi)皮細胞中Bad、Bax蛋白表達均明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠血管內(nèi)皮細胞中凋亡相關(guān)因子和增殖相關(guān)因子蛋白表達的測定結(jié)果見表1。

4 討論

青光眼高眼壓所致患者眼球內(nèi)部結(jié)構(gòu)壓迫、眼球血管供血不足是引起患者視力減退的重要因素之一。曲伏前列素用于治療青光眼高眼壓具有起效快、降眼壓效果好等優(yōu)點，但其最常見的不良反應(yīng)是可引起患者結(jié)膜充血，進而引起眼部瘙癢、不適等[13-14]。

有研究表明，在使用曲伏前列素滴眼的青光眼患者中發(fā)現(xiàn)，僅僅只在結(jié)膜及角膜周圍血管內(nèi)觀察到血管擴張，眼球其余部位卻未見血管擴張[15-16]。這一發(fā)現(xiàn)提示，曲伏前列素所致血管擴張這一不良反應(yīng)，并不僅僅只是α受體受拮抗導(dǎo)致血管舒張。因此，為進一步探究曲伏前列素所致結(jié)膜充血的具體機制，本研究從分子細胞生物學(xué)角度，研究了曲伏前列素對高眼壓模型大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞的影響。結(jié)果表明，曲伏前列素可能是通過促進高眼壓模型大鼠角膜周圍血管內(nèi)皮細胞凋亡，降低其細胞活力，進而引發(fā)結(jié)膜充血這一不良反應(yīng)。

表1 各組大鼠血管內(nèi)皮細胞中凋亡相關(guān)因子和增殖相關(guān)因子蛋白表達的測定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 1 Determination results of protein expressions of apoptosis-related factors and proliferation-related factors of rats in each group（x±s，n＝10）

與國內(nèi)外現(xiàn)有的研究結(jié)果比較，本研究首次發(fā)現(xiàn)了曲伏前列素可通過促凋亡以降低血管內(nèi)皮細胞活力這一現(xiàn)象。本實驗結(jié)果為解釋滴用曲伏前列素后患者結(jié)膜充血這一不良反應(yīng)提供了實驗依據(jù)。此外，本研究初步發(fā)現(xiàn)干預(yù)血管生物學(xué)特性的新機制，從另一角度為尋找合理有效的干預(yù)血管增生的藥物提供了新依據(jù)。本研究不足之處在于，本實驗結(jié)果系通過實驗室動物模型來得到的，對于臨床的實際意義還不明確，尚需今后開展一系列的與曲伏前列素在臨床應(yīng)用有關(guān)的臨床研究來證實。

參考文獻

[1] Cao Y，Xiong J，Mei S，et al.Aspirin promotes bone marrow mesenchymal stem cell-based calvarial bone regeneration in mini swine[J].Stem Cell Res Ther，2015，doi：10.1186/s13287-015-0200-4.

[2] 余佳文，程斌.欖香烯誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡分子機制研究進展[J].中國藥房，2013，24（35）：3348-3350.

[3] Estruch R，Ros E，Salas-salvadó J，et al.Primary prevention of cardiovascular disease with a Mediterranean diet[J].N Engl J Med，2013，368（14）：1279-1290.

[4] 馬曉磊，呂安林，郭忠尚，等.阿司匹林對心肌微血管內(nèi)皮細胞血管新生功能的影響[J].心臟雜志，2015，51（3）：265-270.

[5] 葉錦霞，吳廣文，李西海，等.透骨消痛膠囊對凋亡軟骨細胞Rac1和Cdc42表達的影響[J].中國組織工程研究，2014，18（42）：6747-6751.

[6] 閆浩，陳彤.骨髓間充質(zhì)干細胞與骨髓內(nèi)細胞間相互作用關(guān)系及其進展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2013，9（4）：889-893.

[7] 黃妍，曾昆，徐彪.氨甲酰促紅細胞生成素對糖尿病模型大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的影響[J].中國藥房，2016，27（25）：3488-3491.

[8] Marques MM，Diniz IM，de Cara SP，et al.Photobiomodulation of dental derived mesenchymal stem cells：a systematic review[J].Photomed Laser Surg，2016，12（7）：114-115.

[9] 劉春姿，韓紅波.曲伏前列素對開角型青光眼眼部血流動力學(xué)及對內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子的影響[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2016，32（7）：606-608.

[10] 王俊如，趙秀麗，馬科，等.前列腺素受體基因多態(tài)性與曲伏前列腺素降眼壓療效的相關(guān)性[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2014，30（3）：190-193.

[11] Tseng CL，Chen ZY，Renn TY，et al.Solvent/detergent virally inactivated serum eye drops restore healthy ocular epithelium in a rabbit model of dry-eye syndrome[J].Plos One，2016，11（4）：e0153573.

[12] Sanseau A，Sampaolesi J，ERS Jr，et al.Preference for a fixed combination of brinzolamide/timolol versus dorzolamide/timolol among patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension[J].Clin Ophthalmol，2013，doi：10.2147/opth.S38575.

[13] AlezzandriniA，Hubatsch D，Alfaro R.Efficacy and tolerability of fixed-combination brinzolamide/timolol in latin american patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension previously on brimonidine/timolol fixed combination[J].Adv Ther，2014，31（9）：975-985.

[14] Choh V，Gurdita A，Tan B，et al.Short-term moderately elevated intraocular pressure is associated with elevated scotopic electroretinogram responses[J].Invest Ophth Vis Sci，2016，57（4）：2140-2151.

[15] Mizoue S，Nakano T，F(xiàn)use N，et al.Travoprost with sof-Zia?preservative system lowered intraocular pressure of Japanese normal tension glaucoma with minimal side effects[J].Clin Ophthalmol，2014，doi：10.2147/opth.S576 40.

[16] Igarashi R，Togano T，Sakaue Y，et al.Effect on intraocular pressure of switching from latanoprost and travoprost monotherapy to timolol fixed combinations in patients with normal-tension glaucoma[J].J Ophthalmol，2014，doi：10.1155/2014/720385.

（編輯：鄒麗娟）

Study on the ADR Mechanism of Conjunctival Hyperemia in Model Rats with Prostacyclin-induced High Intraocular Pressure

WANG Hongyu，PEI Cunwen，F(xiàn)A Li，DUAN Yundong
（Dept.of Ophthalmology，Chengde Central Hospital，Hebei Chengde 067000，China）

R965

A

1001-0408（2017）25-3510-04

2017-02-08

2017-05-27）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.15

＊主治醫(yī)師。研究方向：眼底病。電話：0314-2028095。E-mail：hongyu78w@163.com

#通信作者：副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：眼底病。電話：0314-2028095。E-mail：peicunwen@126.com