幾種中藥提取物對二斑葉螨的生物活性及其對主要解毒代謝酶活性的影響

宋珊珊, 王 輝, 王章訓(xùn), 王新譜

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 銀川 750021)

幾種中藥提取物對二斑葉螨的生物活性及其對主要解毒代謝酶活性的影響

宋珊珊, 王 輝, 王章訓(xùn), 王新譜*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 銀川 750021)

用3種不同有機(jī)溶劑對蛇床子Cnidiummonnieri、白頭翁Pulsatillachinensis、百部Stemonajaponica、半夏Pinelliaternata、紫丁香Syringaoblate進(jìn)行了提取,獲得15種植物粗提物,并采用玻片浸漬法對二斑葉螨進(jìn)行室內(nèi)藥效測定。結(jié)果表明,當(dāng)各粗提物濃度為5.00 mg/mL時,蛇床子丙酮提取物A-SCZ和蛇床子氯仿提取物C-SCZ在處理24 h后,二斑葉螨的校正死亡率為100%,具較好的殺螨活性。室內(nèi)毒力試驗(yàn)表明,A-SCZ、C-SCZ、百部乙醇提取物E-BB、白頭翁乙醇提取物E-BTW、白頭翁氯仿提取物C-BTW對二斑葉螨的LC50分別為2.68、1.68、4.14、11.91、5.93 mg/mL。測定施藥后4 h和24 h二斑葉螨體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、酸性磷酸酯酶(ACP)、堿性磷酸酯酶(ALP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFOs)等解毒代謝酶的活力變化情況,結(jié)果表明,白頭翁、紫丁香、蛇床子的活性成分主要抑制二斑葉螨體內(nèi)AchE、GSTs、ACP和CarE而發(fā)揮殺螨作用,而百部粗提物主要抑制的是害螨體內(nèi)GSTs和MFO。A-SCZ、C-SCZ提取率達(dá)19.83%和21.62%,表明這兩種中藥提取物有較高的提取率和殺螨活性,具有很大的開發(fā)潛力。

中藥提取物; 二斑葉螨; 蛇床子; 白頭翁; 百部; 半夏; 紫丁香; 生物活性; 解毒代謝酶

化學(xué)農(nóng)藥在防治病蟲害方面起到了重要作用,但長期以來,大量的化學(xué)農(nóng)藥造成農(nóng)藥殘留日益加重,不僅破壞了作物的品質(zhì),還影響了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境,直接危害人體健康。植物源農(nóng)藥因其低毒、低殘留的特性而受到市場的迫切需求。從天然產(chǎn)物,尤其是從植物中發(fā)現(xiàn)殺蟲活性物質(zhì),是創(chuàng)制新型無公害農(nóng)藥的重要途徑。我國的植物資源豐富,傳統(tǒng)中藥材在治療和緩解人類各種疾病中起著非常重要的輔助作用,且其具有獲取方式方便、經(jīng)濟(jì)、對環(huán)境傷害低等優(yōu)點(diǎn)[1]。因而從中草藥中篩出殺蟲活性高的活性物質(zhì),作為環(huán)境友好型農(nóng)藥用于防治害蟲,成為植物源農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用的研究熱點(diǎn)。前人對從藥用植物中提取潛在的殺蟲活性物質(zhì)做了大量的研究工作,豆科、菊科、茄科、唇形科和傘形科植物對害螨具有很好的觸殺作用,如苦豆子SophoraalopecuroidesLinn.、川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.、丁香草AsmoniaellipticaRoem.etSchull.、青蒿ArtemisiaannuaLinn.、煙草NicotianatabacumLinn.、黃柏PhellodendronchinenseSchneid.、益母草Leonurusartemisia(Lour.)S.Y.Hu、番茄LycopersiconesculentumMill.、瑞香狼毒StellerachamaejasmeLinn.、尾葉魚藤DerriscaudatilimbaHow和含羞草MimosapudicaLinn.等植物的粗提物都被證明具有較高的殺螨活性[2-10]。已經(jīng)開發(fā)出了印楝素、苦參堿、蛇床子素和煙堿·苦參堿等植物源農(nóng)藥產(chǎn)品[11-15]。

害蟲體內(nèi)的各種解毒代謝酶及其他生化酶在對殺蟲劑等的代謝中起重要作用,可以促進(jìn)害蟲對外源有害物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)的解毒代謝。如酯酶能夠水解羧酸酯鍵和磷酸酯鍵,尤其是水溶性短鏈酯類;多功能氧化酶能夠通過羥基化、氧化水解等催化各種結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)氧化[16];谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在保護(hù)組織抵御氧化侵害及氧化壓力中起重要作用[17]。

二斑葉螨TetranychusurticaeKoch屬蜱螨目,葉螨科,是一種世界性害螨[18]。1983年我國北京地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)二斑葉螨為害花卉作物,現(xiàn)已逐漸成為果樹和蔬菜作物的重要害螨之一[19]。二斑葉螨因寄主范圍廣、繁殖速度快、抗藥性強(qiáng)、隱蔽性強(qiáng),成為世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個重要問題。其寄主植物非常繁雜廣泛,據(jù)記載共有50科800余種,可寄生于果樹、蔬菜、花卉、田間農(nóng)作物及農(nóng)田雜草上[20-22]。

本研究選取蛇床子Cnidiummonnieri(Linn.)Cusson、白頭翁Pulsatillachinensis(Bunge.)Regel、百部Stemonajaponica(Blume.) Miq.、半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit、紫丁香SyringaoblataLindl. 5種中藥材,用乙醇、丙酮和氯仿3種有機(jī)溶劑共獲得15種粗提物,進(jìn)行室內(nèi)藥效試驗(yàn)和毒力測定,以期篩選出對二斑葉螨具有較好生物活性的中藥材,為中藥材的綜合開發(fā)利用和研制防治二斑葉螨的植物源殺螨劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

試驗(yàn)所用主要試劑詳見表1。

表1試驗(yàn)主要試劑

Table1Mainreagents

試劑名稱Reagent純度Purity生產(chǎn)廠家Manufacturer氫氧化鈉99%天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司磷酸氫二鈉99%天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司乙醇95%上海禾穎化工有限公司氯仿分析純青島精科儀器試劑有限公司丙酮分析純上海津力化工有限公司磷酸二氫鈉(批號20120308)分析純天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒-蘇州科銘生物技術(shù)有限公司羧酸酯酶(CarE)試劑盒-蘇州科銘生物技術(shù)有限公司酸性磷酸酯酶(ACP)試劑盒-蘇州科銘生物技術(shù)有限公司堿性磷酸酯酶(ALP)試劑盒-蘇州科銘生物技術(shù)有限公司谷胱甘肽S?轉(zhuǎn)移酶(GSTs)試劑盒-蘇州科銘生物技術(shù)有限公司蛋白含量測定試劑盒-蘇州科銘生物技術(shù)有限公司多功能氧化酶(MFO)試劑盒-南京建成生物科技有限公司

1.2 主要儀器

試驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備詳見表2。

表2試驗(yàn)主要儀器

Table2Mainexperimentalinstruments

儀器設(shè)備Instrumentandequipment型號Model生產(chǎn)廠家Manufacturer新型高速連續(xù)式超微粉碎機(jī)CLF?30B浙江省新昌縣城關(guān)紅利數(shù)控制造廠索式提取器BSXT06上海比朗儀器制造有限公司智能人工氣候培養(yǎng)箱RTOP?260D浙江托普儀器有限公司水浴搖床TS?110X30上海柏欣儀器設(shè)備廠電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG?9420A上海一恒科學(xué)儀器有限公司電子天平LE204E/02梅特勒?托利多上海儀器有限公司循環(huán)水真空泵SHZ?Ⅲ上海亞榮生化儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀OSB?2100EYELA日本東京理化旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N?1100EYELA日本東京理化冰箱BCD?575WBDL青島海爾股份有限公司尼康體視顯微鏡SMZ745T南京兆坤儀器有限公司多功能熒光酶標(biāo)儀SP?Max3500FL上海閃譜生物科技有限公司制冰機(jī)YKKYFM70北京長流科學(xué)儀器有限公司

1.3 供試葉螨

供試二斑葉螨于2014年7月采自寧夏銀川市玉米田,經(jīng)鑒定后在室內(nèi)接種到菜豆上純化種群,擴(kuò)大繁殖備用。

1.4 供試材料

試驗(yàn)所用蛇床子、白頭翁、百部、半夏中藥材均采購自寧夏中醫(yī)研究院,紫丁香采自寧夏大學(xué)校園。其中蛇床子和半夏供試部位是種子,百部和白頭翁的供試部位為根部,紫丁香供試部位為枝條表皮。將供試材料于60℃下在DHG-9420A電熱鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行30 min干燥處理,之后用CLF-30B超微粉碎機(jī)將植物樣品粉碎分裝后在低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 粗提物的制備

準(zhǔn)確稱取備用中藥材樣品100 g,放入2 000 mL燒杯中,加入1 000 mL 95%乙醇溶液,浸泡24 h后,超聲提取30 min,抽濾,濾渣再加1 000 mL 95%乙醇超聲提取30 min,抽濾,合并兩次濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏狀,將濾渣烘干用以計算提取率,將原液放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

丙酮和氯仿作為萃取劑的方法同上,試劑均為分析純。

各溶劑對不同材料的粗提物縮寫見表3。

表3各植物粗提物與其縮寫對照表

Table3Comparisonofthecrudeextractsandtheirabbreviations

粗提物Crudeextract縮寫Abbreviation粗提物Crudeextract縮寫Abbreviation乙醇?百部粗提物E?BB丙酮?白頭翁粗提物A?BTW乙醇?蛇床子粗提物E?SCZ丙酮?半夏粗提物A?BX乙醇?紫丁香粗提物E?ZDX氯仿?百部粗提物C?BB乙醇?白頭翁粗提物E?BTW氯仿?蛇床子粗提物C?SCZ乙醇?半夏粗提物E?BX氯仿?紫丁香粗提物C?ZDX丙酮?百部粗提物A?BB氯仿?白頭翁粗提物C?BTW丙酮?蛇床子粗提物A?SCZ氯仿?半夏粗提物C?BX丙酮?紫丁香粗提物A?ZDX

1.5.2 室內(nèi)藥效試驗(yàn)和毒力測定方法

室內(nèi)藥效試驗(yàn):參照FAO推薦的測定螨類害蟲的標(biāo)準(zhǔn)方法—玻片浸漬法(slide-dip method)。方法是將雙面膠帶剪成載玻片寬度長短(約3 cm),貼在載玻片的一端,揭去膠帶上的紙片,用小號勾線筆在豆苗葉片上挑選大小一致,活性較強(qiáng)的成螨,在體視顯微鏡下將其背部向下貼在雙面膠上,各螯肢可以自由活動,每個載玻片上粘兩行,每行20頭,于培養(yǎng)箱中內(nèi)放置2 h,用解剖鏡觀察,嚴(yán)格剔除死亡、不活潑、幼螨及體位不合適的葉螨個體,保留活躍的成螨為測試蟲源。試供植物粗提物的濃度為5 mg/mL,以清水處理作對照,所有處理重復(fù)3次。將載玻片帶蟲的一端浸入藥液輕輕搖晃,在藥液中停留5 s后取出,馬上在體視顯微鏡下用濾紙吸干螨體和周圍多余的藥液,將載玻片平放入裝有濕潤棉花的培養(yǎng)皿中,置于溫度為(28±1)℃、相對濕度60%、光周期 16L∥8D的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在浸藥24、48 h后分別統(tǒng)計二斑葉螨的存活情況,以勾線筆輕觸螨體,螯肢不動者視為死亡。記錄各組死亡和存活的數(shù)量并計算校正死亡率。

用Abbott公式計算校正死亡率。

死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100;

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)×100/(1-對照死亡率);

室內(nèi)毒力測定:根據(jù)室內(nèi)藥效試驗(yàn)的結(jié)果,設(shè)計室內(nèi)毒力測定的濃度梯度,每處理5個濃度梯度,設(shè)3次重復(fù),以清水為對照。統(tǒng)計浸藥處理后48 h二斑葉螨死亡率,計算毒力曲線,試驗(yàn)方法同室內(nèi)藥效試驗(yàn)。

1.5.3 二斑葉螨解毒代謝酶比活力的測定

挑選18盆長勢良好、鮮嫩的豆苗,每盆接種二斑葉螨約200頭,正常飼養(yǎng)繁殖一周左右備用。取各中藥處理中毒力效果最佳的提取物用乙醇稀釋至致死中濃度后,對單盆帶蟲豆苗均勻噴施。以不作處理的帶蟲豆苗為對照,每組重復(fù)3次。于4、24 h后分別測定其體內(nèi)的酶比活力。

以小號勾線筆輕取不同處理的試蟲各200頭,加入2 mL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液(多功能氧化酶MFO:勻漿時取 1 mL pH=7.3 PBS緩沖液;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶:勻漿時取 1.5 mL pH=7.5 PBS緩沖液;乙酰膽堿酯酶:勻漿時取1.5 mL pH=7.0 PBS緩沖液;羧酸酯酶:取 1.5 mL pH=7.0 PBS緩沖液;磷酸酯酶:取1.5 mL pH=7.0 PBS緩沖液)冰浴勻漿120 s,勻漿液在10 000 r/min、4℃條件下離心10 min。取上清液在10 000 r/min、4℃條件下再離心20 min,所獲得的上清液用于酶活性測定。封存于-18℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?避免反復(fù)凍融。

施藥后4 h和24 h后,測定二斑葉螨體內(nèi)總蛋白含量、乙酰膽堿酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、酸性磷酸酯酶(ACP)、堿性磷酸酯酶(ALP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)等解毒代謝酶的活力變化情況,具體原理為:

AchE催化Ach水解生成膽堿,膽堿與二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)作用生成 5-巰基-硝基苯甲酸(TNB),TNB在412 nm處有吸收峰,通過測定412 nm吸光度增加速率,計算AchE活性。

CarE:能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固藍(lán)顯色;在450 nm光吸收增加速率,計算CarE活性。

磷酸酯酶:酸性(堿性)條件下,酸性(堿性)磷酸酯酶可以水解反應(yīng)底物對硝基苯基磷酸二鈉,產(chǎn)生對硝基苯酚,為黃色物質(zhì)。當(dāng)?shù)孜锍浞謺r,該酶活性越強(qiáng),所生成的對硝基苯酚也相應(yīng)越多,據(jù)此可應(yīng)用比色法測定該酶比活力。

GST催化GSH與CDNB 結(jié)合,結(jié)合產(chǎn)物的吸收峰波長為340 nm,通過測定 340 nm 波長處吸光度上升速率即可計算出GST活性。

MFO:生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定樣品中昆蟲多功能氧化酶(MFO)的水平。向預(yù)先包被了昆蟲MFO單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入MFO,溫育;溫育后,加入生物素標(biāo)記的抗MFO抗體,再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶,然后加入底物A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中昆蟲多功能氧化酶(MFO)的濃度呈正相關(guān)。

蛋白質(zhì)測定方法采用考馬斯亮藍(lán)法。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇致死率在20%～80%之間所對應(yīng)的濃度設(shè)置5個濃度梯度,考慮試驗(yàn)具體操作的方便性,將試驗(yàn)設(shè)計所得的濃度梯度與提取率相結(jié)合,計算轉(zhuǎn)換為體積分?jǐn)?shù)梯度,再將所得體積分?jǐn)?shù)梯度近似取整后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

用SPSS 20.0軟件求出毒力回歸方程、LC50值、相關(guān)系數(shù)r及95%置信區(qū)間,用LSD法進(jìn)行單因素方差分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 3種溶劑對5種中藥的提取率

由于各有機(jī)溶劑的極性各不相同,根據(jù)相似相溶原理,不同溶劑提取出的有效成分各不相同。各中藥粗提物的提取率如表4所示,C-SCZ提取率最高,達(dá)21.62%,其次為A-SCZ,提取率達(dá)19.83%。A-ZDX、A-BB、C-BX、E-ZDX等的提取率均大于10.00%,C-ZDX、E-BB的提取率低,僅為4.93%和4.92%。

表4不同溶劑對各中藥粗提物的提取率

Table4Extractionrateofcrudeextractsfromdifferentplantsbythreesolvents

供試植物Plant提取率/%Extractionrate乙醇(E)Ethanol丙酮(A)Acetone氯仿(C)Chloroform百部(BB)Stemonajaponica4．9213．188．20蛇床子(SCZ)Cnidiummonnieri9．2319．8321．62紫丁香(ZDX)Syringaoblata10．1816．644．93白頭翁(BTW)Pulsatillachinensis7．805．896．24半夏(BX)Pinelliaternata9．335．5011．13

2.2 不同植物粗提物對二斑葉螨的室內(nèi)藥效試驗(yàn)

當(dāng)各粗提物濃度為5.00 mg/mL時,24 h和48 h的死亡率如表5所示,丙酮-蛇床子(A-SCZ)和氯仿-蛇床子(C-SCZ)均具有較高的殺螨活性,校正死亡率達(dá)100%,乙醇-白頭翁(E-BTW)殺螨活性次之,24 h校正死亡率為51.48%,48 h校正死亡率為60.29%,乙醇-百部(E-BB)的24 h校正死亡率為53.38%,48 h校正死亡率為60.75%,也表現(xiàn)出較好的殺螨活性;其余植物粗提物對成螨的觸殺效果均不太高,半夏的氯仿提取物(C-BX)殺螨活性最低,24 h校正死亡率僅為10.63%,48 h校正死亡率為14.67%。

表55種植物的不同溶劑粗提物校正死亡率1)

Table5Correctedmortalitiescausedbythecrudeextractsfrom5kindsofplantswithdifferentsolvents

粗提物種類Solventextract24h死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality48h死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality乙醇?百部(E?BB)Ethanol?S．japonica(53．95±1．15)b (53．38±1．17)b(66．17±1．11)b(60．75±1．16)b乙醇?蛇床子(E?SCZ)Ethanol?C．monnieri(36．13±6．97)c(35．48±7．10)c(44．07±11．52)de(37．16±12．07)de乙醇?紫丁香(E?ZDX)Ethanol?S．oblata(28．25±13．12)cd(27．52±13．38)cd(32．14±7．10)ef(23．75±7．43)ef乙醇?白頭翁(E?BTW)Ethanol?P．chinensis(51．96±6．26)b(51．48±6．39)b(64．65±10．84)bc(60．29±11．35)bc乙醇?半夏(E?BX)Ethanol?P．ternata(35．91±12．44)c(34．47±12．68)c(46．11±22．29)de(38．84±23．34)de丙酮?百部(A?BB)Acetone?S．japonica(15．00±0．13)e(11．46±0．13)e(22．00±5．64)gf(15．22±5．91)gf丙酮?蛇床子(A?SCZ)Acetone?C．monnieri(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a丙酮?紫丁香(A?ZDX)Acetone?S．oblata(20．39±2．27)de(17．07±2．32)de(28．98±7．90)gf(22．80±8．27)gf丙酮?白頭翁(A?BTW)Acetone?P．chinensis(19．00±3．44)de(15．63±3．51)de(24．00±2．57)gf(17．39±2．69)gf丙酮?半夏(A?BX)Acetone?P．ternata(32．07±2．69)c(29．31±2．74)c(50．88±6．28)cd(44．58±6．57)cd氯仿?百部(C?BB)Chloroform?S．japonica(35．15±6．95)c(33．83±7．08)c(43．76±7．72)de(34．61±8．08)de氯仿?蛇床子(C?SCZ)Chloroform?C．monnieri(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a氯仿?紫丁香(C?ZDX)Chloroform?S．oblata(37．22±6．74)c(35．94±6．87)c(43．83±5．56)de(34．69±5．82)de氯仿?白頭翁(C?BTW)Chloroform?P．chinensis(38．00±3．37)c(36．73±3．43)c(51．00±5．92)d(47．02±6．20)d氯仿?半夏(C?BX)Chloroform?P．ternata(11．47±2．54)e(10．63±2．59)e(17．14±3．00)g(14．67±3．15)g

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。同列不同小寫字母表示各處理間死亡率有顯著性差異(P<0.05)。 Data are the means of 3 replicates. Different lowercase letters in the same column indicate that there were significant differences in mortality among the treatments (P<0.05).

2.3 5種植物粗提物對二斑葉螨成蟲的室內(nèi)毒力測定

選取殺蟲活性較高的蛇床子丙酮提取物A-SCZ、蛇床子氯仿提取物C-SCZ、百部乙醇提取物E-BB、白頭翁乙醇提取物E-BTW、白頭翁氯仿提取物C-BTW,配成濃度梯度分別為A-SCZ:3.96、2.97、1.98、0.99、0.50 mg/mL;C-SCZ:5.40、2.70、1.35、0.68、0.34 mg/mL；E-BB:7.35、6.13、4.90、2.45、0.98 mg/mL；E-BTW:19.50、15.60、11.70、7.80、3.90 mg/mL；C-BTW:10.85、9.30、7.75、4.65、1.55 mg/mL;各5個濃度梯度,對二斑葉螨成蟲進(jìn)行毒力測定。結(jié)果如表6所示,5種植物粗提物對二斑葉螨成蟲均表現(xiàn)出較好的觸殺效果,LC50分別為2.68、1.68、4.14、11.91、5.93 mg/mL,LC50最小的C-SCZ的毒力為LC50最高的E-BTW毒力的7.27倍,試驗(yàn)表明,蛇床子的氯仿粗提物和丙酮粗提物對成螨的觸殺效果最好。

2.4 二斑葉螨解毒代謝酶活性變化

選取殺蟲活性較高的A-SCZ、C-SCZ、E-BB、E-BTW、C-BTW 5種植物粗提物,測定其對二斑葉螨體內(nèi)主要的解毒代謝酶活性的影響,施藥4 h和24 h后二斑葉螨體內(nèi)酶活如表7所示。

處理4 h后各處理組蛋白濃度均高于正常水平,且有顯著性差異(P<0.05)。各處理組AchE均受到顯著的抑制(P<0.05),4個處理間被抑制的程度無差異;GST在各處理組中也受到顯著的抑制(P<0.05),其中蛇床子和百部處理組受到的抑制最強(qiáng),顯著不同于紫丁香處理組(P<0.05);ACP、ALP、CarE在各處理中均受到了顯著的抑制(P<0.05),處理間無明顯差異。白頭翁、紫丁香、蛇床子處理組MFO的活性在用藥后均有顯著的提升(P<0.05),百部處理組的MFO受到抑制。

表65種中藥粗提物對二斑葉螨成蟲的室內(nèi)毒力測定

Table6Indoortoxicitydeterminationof5kindsofcrudeextractsagainstTetranychusurticae

粗提液Solventextract回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientLC50/mg·mL-1MedianlethalconcentrationLC50置信區(qū)間/mg·mL-1Confidenceinterval相對毒力倍數(shù)RelativevirulencefactorC?SCZ Chloroform?C．monnieriy=4．77x+1．000．931．681．08～2．661．00A?SCZ Acetone?C．monnieriy=4．61x+0．910．902．681．53～4．691．59E?BB Ethanol?S．japonicay=4．03x+1．570．984．143．13～5．482．46E?BTW Ethanol?P．chinensisy=2．63x+2．200．9711．919．78～14．517．27C?BTW Chloroform?P．chinensisy=3．54x+1．890．935．934．71～7．463．52

表7各植物粗提物處理4h后二斑葉螨體內(nèi)酶活1)

Table7TheenzymeactivitiesofTetranychusurticaeaftertreatmentwithdifferentcrudeextractsfor4hours

粗提物Crudeextract蛋白/μg·mL-1ProteinAchE/nmol·(min·mg)-1GST/nmol·(min·mg)-1ACP/nmol·(min·mg)-1ALP/nmol·(min·mg)-1CarE/nmol·(min·mg)-1MFO/nmol·(min·mg)-1E?BTWEthanol?P．chinensis(155．66±13．27)ab(6．11±3．21)b(68．59±9．26)bc(0．23±0．00)b(3．59±0．78)b(5．67±1．09)b(31．20±0．62)cC?ZDXChloroform?S．oblata(162．90±1．12)a(7．00±2．50)b(146．45±8．64)b(0．30±0．01)b(5．13±1．58)b(6．51±0．81)b(42．50±0．62)aC?SCZChloroform?C．monnieri(145．38±2．04)b(10．07±3．57)b(29．01±5．22)c(0．48±0．01)b(5．23±1．12)b(5．60±0．43)b(37．98±0．41)bE?BBEthanol?S．japonica(166．97±3．04)a(1．96±0．69)b(70．28±1．95)bc(1．69±0．04)b(7．39±0．17)b(12．73±1．37)b(1．15±0．05)e未處理CK(17．99±1．58)c(54．09±8．10)a(716．98±30．17)a(13．39±1．84)a(58．75±5．79)a (74．57±14．37)a(2．98±0．02)d

1) 同列不同小寫字母表示各處理間酶活含量有顯著性差異(P<0.05)。 Different lowercase letters in the same column indicate that there were significant differences in enzyme activity among the treatments (P<0.05).

處理24 h后白頭翁、紫丁香、蛇床子處理組蛋白濃度顯著高于正常水平(P<0.05),百部處理組蛋白濃度與正常水平無差異。白頭翁、紫丁香、蛇床子處理組AchE均受到顯著的抑制(P<0.05),百部處理組活性與正常水平無明顯差異;GST在各處理組中也受到顯著的抑制,其中白頭翁處理組受到的抑制最強(qiáng),顯著不同于其他3個處理組(P<0.05);白頭翁、紫丁香、蛇床子處理組的ACP、ALP、CarE均受到了顯著的抑制(P<0.05),且處理間無明顯差異,百部處理組的ACP、ALP、CarE活性均顯著高于正常水平(P<0.05)。白頭翁、紫丁香、蛇床子、百部處理組MFO的活性在用藥后均有顯著的提升,且各處理間有明顯的差異(P<0.05)。

表8各植物粗提物處理24h后二斑葉螨體內(nèi)酶活變化情況1)

Table8TheenzymeactivitiesofTetranychusurticaeaftertreatmentwithdifferentcrudeextractsfor24hours

粗提物Crudeextract蛋白/μg·mL-1ProteinAchE/nmol·(min·mg)-1GST/nmol·(min·mg)-1ACP/nmol·(min·mg)-1ALP/nmol·(min·mg)-1CarE/nmol·(min·mg)-1MFO/nmol·(min·mg)-1E?BTWEthanol?P．chinensis(200．54±6．31)a(2．17±0．67)b(65．32±5．31)d(0．45±0．05)c(5．67±1．12)c(6．45±0．91)c(72．14±3．21)aC?ZDXChloroform?S．oblata(108．84±9．54)b(11．55±1．25)b(288．16±16．34)b(2．25±0．63)c(6．69±0．83)c(4．15±0．63)c(19．63±1．67)cC?SCZChloroform?C．monnieri(121．36±11．83)b(12．23±0．93)b(177．15±12．34)c(1．23±0．05)c(7．79±2．03)c(3．26±0．79)c(43．75±2．21)bE?BBEthanol?S．japonica(8．15±1．14)c(60．60±9．85)a(335．68±35．23)b(33．14±2．23)a(90．67±5．21)a(226．85±13．64)a(8．10±0．79)d未處理CK(21．17±3．85)c(58．89±5．10)a(700．13±25．16)a(15．62±1．66)b(61．33±4．73)b(85．62±16．52)b(4．45±0．24)e

1) 同列不同小寫字母表示各處理間酶活含量有顯著性差異(P<0.05)。 Different lowercase letters in the same column indicate that there were significant differences in enzyme activity among the treatments (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了15種中藥粗提物對二斑葉螨成蟲的毒殺活性,結(jié)果表明48 h校正死亡率大于60%的有4種,其中兩種為蛇床子丙酮和氯仿提取物。蛇床子屬于傘形科Umbelliferae蛇床屬Cnidium植物,為中華人民共和國藥典規(guī)定的道地藥材,具有很高的藥用價值。已有部分學(xué)者對蛇床子的殺蟲活性進(jìn)行了初步的研究,馬麗娜等在研究傘形科中草藥乙醇提取物的殺螨活性中指出蛇床子的乙醇粗提物對柑橘全爪螨Panonychuscitri的24 h校正死亡率為52.12%,殺螨活性較弱[23],這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。李雪嬌研究了蛇床子丙酮提取物對黏蟲Mythimnaseparata的毒殺活性,其72 h死亡率為63.3%。姚英娟等研究了蛇床子無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚4種溶劑提取物對玉米象Sitophiluszeamais、谷蠢和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis成蟲的驅(qū)避和觸殺作用,結(jié)果表明除石油醚提取物對鋸谷盜96 h的校正死亡率為20%以外,其余粗提物對3種試蟲的觸殺效果均較高[24]。從已有結(jié)果來看,蛇床子乙醇提取物對鞘翅目昆蟲具有較高的觸殺活性,而對蜱螨目等刺吸式害蟲觸殺效果不明顯,而丙酮提取物相對廣譜,對各種害蟲都具有較高的毒殺活性。

蛇床子的主要藥理活性成分是香豆素類化合物和揮發(fā)油,以及單萜多醇、糖類和倍半萜類成分等[25],姚英娟推測其主要的觸殺活性物質(zhì)為香豆素類的蛇床子素[24],本試驗(yàn)用極性不同的溶劑獲得的粗提物在較低濃度范圍內(nèi)均有較高殺蟲活性,根據(jù)物質(zhì)極性相似相溶原理,推測蛇床子殺螨活性成分可能有多種。具體活性物質(zhì)的確定需通過進(jìn)一步的試驗(yàn)探索。

本研究發(fā)現(xiàn)雖然紫丁香乙醇提取物處理的成螨校正死亡率不高,但供試成螨均表現(xiàn)呆滯,活躍度低,故推測紫丁香乙醇提取物對二斑葉螨具有遲效性,致死時間要長于其他藥劑,需在后續(xù)的田間藥效試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。另外通過觀察發(fā)現(xiàn),百部乙醇提取物可使成螨蟲體體壁普遍變薄,一觸即破,其作用機(jī)理需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

王蘭英等研究表明百部丙酮粗提物對螺旋粉虱Aleurodicusdisperses有較高的觸殺作用(LC50為4.046 7 mg/mL)[26]。但在本試驗(yàn)中,百部丙酮粗提物對二斑葉螨作用的LC50高達(dá)36.920 4 mg/mL,與其研究結(jié)果有較大出入,分析原因可能有以下幾方面:供試蟲源的種類不同,對提取物反應(yīng)也不同,在化學(xué)農(nóng)藥中,殺螨劑和殺蟲劑常表現(xiàn)出很大不同;提取方法不同也能導(dǎo)致活性有較大差異。

酶活變化結(jié)果表明,白頭翁、紫丁香、蛇床子的活性成分主要抑制二斑葉螨體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、磷酸酯酶和羧酸酯酶而發(fā)揮殺螨作用,而百部粗提物主要抑制的是害螨體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和多功能氧化酶。操海群等2006年用巨縣苦竹等竹提取物處理棉鈴蟲幼蟲后,幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶等解毒酶系的活性顯著降低[27],陳青等研究錫蘭肉桂丙酮粗提物對皮氏葉螨體內(nèi)解毒代謝酶的關(guān)系[28],與本文結(jié)果類似。但陳青等對大葉丁香丙酮提取物對皮氏葉螨代謝酶活性進(jìn)行研究[29],得出丁香丙酮提取物能激活害蟲體內(nèi)酸性磷酸酯酶的活性,與本文紫丁香抑制二斑葉螨體內(nèi)酸性磷酸酯酶的結(jié)果有出入,其原因可能是皮氏葉螨和二斑葉螨存在種間差異。根據(jù)酶活性的變化可以有助于分析中藥殺螨活性物質(zhì)的成分及其藥效機(jī)理,從而對殺螨物質(zhì)的提取提供有益幫助。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

EfficacyofmiticidalactivityofthecrudeextractsofsomeChinesemedicinesagainstTetranychusurticae

Song Shanshan, Wang Hui, Wang Zhangxun, Wang Xinpu

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China)

The miticidal activity of 15 kinds of crude extracts from five Chinese medicines , includingCnidiummonnieri,Pulsatillachinensis,Stemonajaponica,PinelliaternataandSyringaoblateby three different solvents were determined againstTetranychusurticaeby using the slide-dip method. The bioassay results showed that the corrected death rate ofT.urticaewas 100% at 24 h after treated with 5.00 mg/mL acetone-C.monnieri(A-SCZ) and chloroform-C.monnieri(C-SCZ), which showed a good miticidal activity. The virulence of acetone-C.monnieri(A-SCZ), chloroform-C.monnieri(C-SCZ), ethanol-S.japonica(E-BB), ethanol-P.chinensis(E-BTW) and chloroform-P.chinensis(C-BTW) crude extracts againstT.urticaewas measured. The results showed that the LC50values were 2.68 mg/mL, 1.68 mg/mL, 4.14 mg/mL, 11.91 mg/mL, 5.93 mg/mL, respectively. The activities of acetylcholinesterase, carboxylic acid esterase, acid phosphatase, alkaline phosphatase, glutathioneS-transferase, multi-function oxidase ofT.urticaewere determined at 4 h and 24 h after application of the extracts. The results showed that the active ingredients ofP.chinensis,S.oblate, andC.monnieriinhibited acetylcholinesterase, glutathioneS-transferase, phosphatase and carboxylesterase ofT.urticae, butS.japonicainhibited glutathioneS-transferase and multi-function oxidase ofT.urticae. The extraction rates of acetone-C.monnieri(A-SCZ) and chloroform-C.monnieri(C-SCZ) were 19.83% and 21.62%, respectively. Because of the high extraction rate and high acaricidal activity, these two crude extracts have great potential for development.

crude extract of Chinese medicine;Tetranychusurticae;Cnidiummonnieri;Pulsatillachinensis;Stemonajaponica;Pinelliaternata;Syringaoblata; miticidal activity; metabolic detoxification enzyme

S 482.1

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.012

2016-11-23

： 2017-04-20

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-07-0470)；寧夏“十三五”重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目(2016BZ09)

* 通信作者 E-mail: meloidae@126.com