幾種常見化合物對槲皮素穩(wěn)定性的影響

許廣人，陳志剛，陳惠玉，雷紅宇，蘇建明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙410128）

幾種常見化合物對槲皮素穩(wěn)定性的影響

許廣人，陳志剛*，陳惠玉，雷紅宇，蘇建明*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙410128）

槲皮素是一種多酚羥基化合物，具有抗炎、抗氧化、提高動物生產(chǎn)性能、改善動物肉品質(zhì)等功能。為探究生產(chǎn)或加工過程中常見化合物對槲皮素穩(wěn)定性的影響，選取了不同濃度的氧化還原劑、金屬化合物、糖類、檸檬酸等物質(zhì)處理槲皮素6 h和24 h，并觀察幾種不同濃度的常見化合物對槲皮素濃度的影響。結(jié)果表明，過氧化氫和亞硝酸鈉呈時間和濃度依賴性地降低槲皮素濃度（P＜0.05）；鉀離子、鈣離子、鈉離子、葡萄糖、蔗糖和檸檬酸不影響槲皮素濃度（P＞0.05）；鎂離子與槲皮素作用6 h，對其濃度無顯著影響（P＞0.05），而作用24 h時，高濃度的鎂離子顯著降低了槲皮素溶液濃度（P＜0.05）；鋁離子和銅離子作用6 h和24 h均能顯著地降低槲皮素濃度（P＜0.05）。表明氧化劑、還原劑、鎂離子、銅離子和鋁離子會影響槲皮素穩(wěn)定性，而鉀離子、鈣離子、鈉離子、葡萄糖、蔗糖和檸檬酸不會影響槲皮素穩(wěn)定性。

槲皮素；穩(wěn)定性；化合物；質(zhì)量控制

Abstract:Quercetin is a polyphenol hydroxy compound,which has the functions of antiinflammation,antioxidation,improving animal production performance and improving meat quality of animals.For investigating the effect of common compounds in the course of production or processing on quercetin stability,different concentrations of redox agent,metallic compounds,sugar,citric acid were selected to co-treat with quercetin for 6 h and 24 h,and the effect of several different concentrations of compounds on quercetin content were observed.The results showed that hydrogen peroxide and sodium nitrite decreased the concentrations of quercetin in a time and concentration dependent manner(P＜0.05).Potassium ions,calcium ions,sodium ions,glucose,sucrose and citric acid did not affect quercetin concentrations.The magnesian ion had no significant influence on quercetin concentrations at 6 h(P＞0.05),but significantly decreased the concentrations of quercetin at 24 h(P＜0.05).The concentrations of quercetin were markedly decreased in the presence of aluminum ion and copper ion at 6 h and 24 h(P＜0.05).It indicated that oxidant,reducing agent,magnesium ion,copper ion and aluminum ion could affect the stability of quercetin,but potassium,calcium ion,sodiumion,glucose,sucrose and citric acid could not affect the stability of quercetin.

Key words:quercetin;stability;compound;quality control

槲皮素是一種多酚羥基化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。已有研究證明，槲皮素可以抗動物致病菌，提高免疫功能、抗氧化能力和提高生長性能，改善雞蛋品質(zhì)和動物肉品質(zhì)等，是一種較為高效的天然飼料添加劑[1-6]。然而，槲皮素的穩(wěn)定性研究可以為槲皮素合理劑型的研發(fā)和藥理研究提供有力的證據(jù)支撐。但是，目前關(guān)于槲皮素穩(wěn)定性的研究多限于單一的吸光度比較，缺乏平行試驗數(shù)據(jù)的收集和合理的統(tǒng)計分析，沒有在試驗體系中槲皮素濃度用量的具體說明，并且探究影響槲皮素穩(wěn)定性的化合物作用濃度和作用時間缺少梯度設(shè)置，特別是沒有濃度范圍的考察，不足以較為全面地評價有關(guān)化合物對槲皮素穩(wěn)定性影響[7]。因此，試驗選取了不同濃度的氧化還原劑、金屬離子、糖類、檸檬酸等物質(zhì)以不同時間處理槲皮素，以槲皮素濃度的變化值作為評價指標(biāo)，從而探究幾種常見化合物對槲皮素穩(wěn)定性的影響，為槲皮素在生產(chǎn)、加工與儲存過程中的質(zhì)量控制和在體外細(xì)胞研究中的溶液配制和使用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

槲皮素（BR，≥98%），槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、過氧化氫（H2O2）、亞硫酸鈉（NaNO2）、氯化鉀（KCl）、無水氯化鈣（CaCl2）、檸檬酸、葡萄糖、氯化鈉（NaCl）、六水氯化鎂（MgCl2）、蔗糖、五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O）、六水氯化鋁（AlCl3·6H2O），均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗用水為雙蒸水。

1.2 儀器

AY220電子分析天平，SHIMADZU；1510全波長酶標(biāo)儀，Thermo Fisher。

1.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和槲皮素待測品溶液配制

采用電子分析天平稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.0 493 g，少量無水乙醇溶解，100 mL容量瓶定容后轉(zhuǎn)至玻璃瓶中，4℃放置，配制得到493 μg·mL-1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。稱量槲皮素樣品0.0 515 g，無水乙醇攪拌溶解，100 mL容量瓶定容后轉(zhuǎn)至玻璃瓶中，4℃保存，配制得到槲皮素樣品溶液。

1.4 波長掃描

吸取槲皮素樣品溶液500 μL，加入等體積無水乙醇，混勻，以此類推，逐一稀釋3次。第3個稀釋管中加入雙蒸水500 μL，充分混勻。移取第3個稀釋管溶液100 μL于已預(yù)鋪100 μL的96孔板中，混勻。酶標(biāo)儀在340～400 nm進(jìn)行波長掃描。選擇最高峰對應(yīng)的波長作為槲皮素的測定波長。

1.5 槲皮素的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在7個2 mL離心管中各加入無水乙醇500 μL，最后1管加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，混勻。吸取500 μL于倒數(shù)第2管，混勻，從中吸取500 μL于倒數(shù)第3管，按此規(guī)律逐一操作至第倒數(shù)第6管，并棄去第6管500 μL。各管加入500 μL雙蒸水，混勻。在96孔板上選取7個孔，各加雙蒸水入100 μL。從7個離心管中吸取100 μL溶液對應(yīng)加入96孔板上的7個孔中，以第1個孔作為調(diào)零孔，測定吸光度。以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度X（μg·mL-1）為橫軸，吸光度Y為縱軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 槲皮素濃度測定

吸取100 μL槲皮素樣品溶液至已預(yù)加100 μL雙蒸水的96孔板中，混勻，測定吸光度，平行4次。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，計算槲皮素溶液濃度。

1.7 不同濃度氧化劑和還原劑對槲皮素濃度的影響

在2 mL離心管中各加入槲皮素樣品溶液500 μL，再加入不同濃度H2O2的水溶液500 μL，使H2O2的終濃度為0、0.004%、0.016%、0.063%、0.250%、1.000%（V/V），以不含槲皮素溶液的試驗管作為調(diào)零管。NaNO2終濃度為0、0.016%、0.031%、0.063%、0.125%、0.250%、0.500%、1.000%（m/V），處理同于H2O2。作用6、24 h后，按測定方法計算槲皮素溶液濃度。計算公式：倍數(shù)=各組槲皮素濃度/對照組槲皮素濃度。

1.8 不同濃度金屬化合物對槲皮素濃度的影響

在2 mL離心管中各加入槲皮素樣品溶液500 μL，再加入不同濃度金屬化合物（KCl、CaCl2、NaCl、MgCl2、AlCl3·6H2O、CuSO4·5H2O）的水溶液500 μL，使KCl的終濃度為0～0.125%（m/V），CaCl2終濃度為0～0.125%（m/V），NaCl終濃度為0～1.000%（m/V），MgCl2終濃度為0～1.000%（m/V），AlCl3·6H2O終濃度為0～1.000%（m/V），CuSO4·5H2O終濃度為0～0.063%（m/V），以不含槲皮素溶液的試驗管作為調(diào)零管。分別作用6和24 h后，計算槲皮素溶液濃度。

1.9 不同濃度糖類對槲皮素濃度的影響

在2 mL離心管中各加入槲皮素樣品溶液500 μL，再加入不同濃度葡萄糖和蔗糖的水溶液500 μL，使葡萄糖的終濃度為0～1.000%（m/V），蔗糖終濃度為0～1.000%（m/V），以不含槲皮素溶液的試驗管作為調(diào)零管。分別作用6和24 h后，計算槲皮素溶液濃度。

1.10 不同濃度檸檬酸對槲皮素濃度的影響

在2 mL離心管中各加入槲皮素樣品溶液500 μL，再加入不同濃度檸檬酸的水溶液500 μL，使檸檬酸的終濃度為0～0.031%（m/V），以與各試驗管相比不含槲皮素溶液作為調(diào)零管。分別作用6和24 h后，計算槲皮素溶液濃度。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用獨立樣本t檢驗分析差異性。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，圖中星號表示數(shù)據(jù)與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

2 試驗結(jié)果

2.1 最大吸收波長的確定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在340～400 nm進(jìn)行波長掃描，槲皮素樣品溶液在370 nm處有最高峰，因此選擇370 nm作為測定波長。在370 nm波長處測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性方程為y=0.034 6x+0.034 1，R2=0.997 6。結(jié)果表明，槲皮素在0～61.63 μg·mL-1內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

圖1 槲皮素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同濃度氧化劑和還原劑對槲皮素濃度的影響

氧化劑H2O2對槲皮素濃度的影響見圖2，H2O2在作用于槲皮素6 h時，從0.250%起開始降低槲皮素濃度，而作用24 h時，從0.016%時就使槲皮素的濃度發(fā)生了顯著的降低（P＜0.05）。還原劑NaNO2對槲皮素濃度的影響見圖3，NaNO2在6和24 h兩個時間段使槲皮素濃度發(fā)生顯著性變化的濃度與過氧化氫處理基本一致（P＜0.05）。表明氧化劑H2O2和還原劑NaNO2降低槲皮素濃度，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴與時間依賴關(guān)系。

圖2 不同濃度H2O2對槲皮素濃度的影響

圖3 不同濃度NaNO2對槲皮素濃度的影響

2.3 不同濃度金屬化合物對槲皮素濃度的影響

KCl、CaCl2、NaCl對槲皮素濃度的影響分別見圖4、5、6，KCl（0～0.125%）、CaCl2（0～0.125%）、NaCl（0～1.000%）作用于槲皮素6和24 h時，均未顯著改變槲皮素濃度（P＞0.05），表明其不會改變槲皮素的穩(wěn)定性。MgCl2對槲皮素濃度的影響見圖7，0～1.000%的MgCl2對槲皮素作用6 h，對其濃度無顯著影響，而作用24 h時，0.500%、1.000%的MgCl2顯著降低了槲皮素的濃度（P＜0.05），表明隨著作用時間的延長，MgCl2對槲皮素的穩(wěn)定性影響越大。AlCl3·6H2O（0～1.000%）和CuSO4·5H2O（0～0.063%）對槲皮素濃度的影響分別見圖8、9，無論是作用6還是24 h均顯著降低了槲皮素的濃度，0.004%～1.000%的AlCl3·6H2O及0.008%～0.063%的CuSO4·5H2O在兩個作用時段均使槲皮素的濃度下降＞50%（P＜0.05），且在加完AlCl3·6H2O或CuSO4·5H2O后均可見其混合液為黃色透明溶液。表明AlCl3·6H2O、CuSO4·5H2O對槲皮素的穩(wěn)定性有顯著影響。

圖4 不同濃度KCl對槲皮素濃度的影響

圖5 不同濃度CaCl2對槲皮素濃度的影響

圖6 不同濃度NaCl對槲皮素濃度的影響

圖7 不同濃度MgCl2對槲皮素濃度的影響

2.4 不同濃度糖類對槲皮素濃度的影響

不同濃度的葡萄糖、蔗糖對槲皮素濃度的影響分別見圖10、11，作用不同時間后，槲皮素的濃度均無明顯變化（P＞0.05），表明這兩種糖類物質(zhì)對槲皮素穩(wěn)定性無影響。

圖8 不同濃度AlCl3·6H2O對槲皮素濃度的影響

圖9 不同濃度CuSO4·5H2O對槲皮素濃度的影響

圖10不同濃度葡萄糖對槲皮素濃度的影響

圖11不同濃度蔗糖對槲皮素濃度的影響

2.5 不同濃度檸檬酸對槲皮素濃度的影響

不同濃度檸檬酸對槲皮素濃度的影響見圖12，0～0.031%的檸檬酸作用6和24 h后，對槲皮素的濃度無顯著改變（P＞0.05），表明不影響其穩(wěn)定性。

圖12不同濃度檸檬酸對槲皮素濃度的影響

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和草本植物中。在340～400 nm對槲皮素樣品溶液進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在370 nm處有最高峰，接近374 nm[8]。因此，選擇370 nm作為測定波長。與前人關(guān)于槲皮素穩(wěn)定性研究不同的是試驗構(gòu)建了測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以槲皮素濃度的變化來判斷其穩(wěn)定性；對幾種化合物設(shè)置了不同作用濃度和作用時間；進(jìn)行了平行試驗，以t檢驗分析其是否對槲皮素穩(wěn)定性有影響，而不是單純地以一個吸光度的多少衡量其穩(wěn)定性。

研究表明H2O2不影響槲皮素穩(wěn)定性，但還原劑Na2SO3和Na2S2O3降低了槲皮素的測定吸光度[7]。鄭麗等研究表明，0～2%的H2O2作用于黃秋葵黃酮30 min時，對黃秋葵黃酮穩(wěn)定性無影響，但0.01%～0.05%的還原劑Na2SO3對其穩(wěn)定性影響較大[9]。而試驗發(fā)現(xiàn)氧化劑H2O2和還原劑NaNO2在作用槲皮素6 h和24 h均會影響槲皮素的穩(wěn)定性。氧化劑作用后結(jié)果不一致的原因可能是H2O2作用時間太短和作用濃度太低。槲皮素溶液在與高濃度氧化劑和還原劑接觸時易被氧化和還原，隨著作用時間延長氧化還原反應(yīng)加劇。因此在槲皮素的生產(chǎn)、加工或儲存過程中，應(yīng)避免與高濃度強氧化劑和強還原劑接觸。金屬離子以化合物的形式或多或少地存在于飼料中，通過攝食途徑補充畜禽進(jìn)行生命活動不可或缺的金屬離子。研究發(fā)現(xiàn)鉀離子、鈣離子和鈉離子和低濃度鎂離子不影響槲皮素的穩(wěn)定性，而高濃度的鎂離子長時間與槲皮素接觸，對其穩(wěn)定性的影響較大。鋁離子和銅離子極大地降低了槲皮素的濃度。其原因可能是鋁離子和銅離子易與槲皮素的鄰二酚羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，損失槲皮素，生成了新的物質(zhì)——槲皮素-金屬絡(luò)合物。因此在生產(chǎn)或使用過程中槲皮素以溶液形式存在時應(yīng)避免與鋁離子和銅離子接觸，與鎂離子不宜長時間接觸。葡萄糖和蔗糖主要扮演甜味劑的角色，改善口感及風(fēng)味，也可以補充能量。檸檬酸作為有機酸，常用作酸味劑，具有促進(jìn)動物生長，提高幼畜的抗病能力、飼料轉(zhuǎn)化率，縮短飼喂周期等作用。試驗表明葡萄糖和蔗糖等碳水化合物及檸檬酸與槲皮素溶液作用不改變槲皮素濃度。試驗結(jié)果表明氧化劑、還原劑、鎂離子、銅離子和鋁離子會影響槲皮素穩(wěn)定性，而鉀離子、鈣離子、鈉離子、葡萄糖、蔗糖和檸檬酸不會改變槲皮素穩(wěn)定性，該研究為槲皮素在生產(chǎn)、添加劑或獸藥加工與儲存過程中的質(zhì)量控制和在體外細(xì)胞研究中的溶液配制和使用方面提供了參考。

[1]滕楠.槲皮素抑菌作用的體內(nèi)和體外研究[D].哈爾濱∶東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[2]楊家新,李垚,韓春艷,等.槲皮素對AA肉雞免疫功能的作用[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會第十二次動物營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會,2016.

[3]孫丹彤.槲皮素對蛋雞生產(chǎn)性能、體內(nèi)和體外抗氧化指標(biāo)的影響[D].哈爾濱∶東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[4]鄒軼,向全航,彭健.止痢草油和槲皮素對育肥豬生長性能和運輸應(yīng)激的影響[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會第七屆中國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C]中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會,2014.

[5]劉紅南,滕楠,李垚,等.飼糧添加槲皮素對蛋雞蛋品質(zhì)和蛋組分的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2014,26（8）∶2 246-2 252.

[6]韓春艷,李垚,Chaudhry M T,等.槲皮素對注射鏈脲佐菌素AA肉雞胴體性能和肉品質(zhì)的影響[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會第十二次動物營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會,2016.

[7]孟憲昉,陸蘭,MENG Xian-fang,等.香椿葉中提取槲皮素的穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28（1）∶46-48.

[8]陳志剛,山光強,譚玉琴,等.紫外分光光度法測定槲皮素含量方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37（1）∶122-124.

[9]鄭麗,李和生,金洋,等.黃秋葵黃酮的穩(wěn)定性研究[J].中國蔬菜,2017（8）∶67-71.

Effect of Several Common Compounds on Stability of Quercetin

XU Guangren,CHEN Zhigang*,CHEN Huiyu,LEI Hongyu,SU Jianming*

（College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China）

R286；S816.7

A

1001-0084（2017）09-0021-05

2017-08-17

許廣人（1992-），男，江蘇盱眙人，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物與動物生理生化。

*通訊作者