改進(jìn)液氮凍融法和試劑盒法提取糞便基因組DNA對(duì)比研究

王寧++王占黎++包艷?++劉琦琦

摘 要： 目的 比較兩種方法提取糞便細(xì)菌基因組DNA的效果。方法 收集30例健康人的糞便，采用改進(jìn)的液氮凍融法及試劑盒法提取DNA，對(duì)總產(chǎn)量和純度進(jìn)行分析。PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因序列，比較不同方法提取人糞便基因組DNA效率的差異。結(jié)果 采用改進(jìn)的液氮凍融法提取和試劑盒法提取的DNA濃度分別為784±69.13 ng/μl、209.98±39.30 ng/μl（F=505.085，P<0.001）。結(jié)論 試劑盒法在提取基因組DNA純度優(yōu)于改進(jìn)液氮凍融法。但改進(jìn)液氮凍融法的優(yōu)點(diǎn)是提取基因組DNA濃度高，滿足后期使用條件的前提下，提取費(fèi)用相對(duì)較低。

關(guān)鍵詞： 糞便；細(xì)菌基因組DNA；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

【中圖分類號(hào)】G710

一 材料與方法

1 樣品的采集與儲(chǔ)存

以滅菌過(guò)的糞便取樣盒采集30份體檢正常的20-30歲志愿者的新鮮糞便樣本，并在采集后30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃凍存，備用。

2 糞便細(xì)菌基因組DNA提取方法

改進(jìn)的液氮凍融法：糞便前處理[2]：稱取200 mg糞便，加入30 mL PBS渦旋震蕩，使樣本均勻渾濁。200×g離心5 min，收集上清棄去沉淀。重復(fù)洗滌3次。9000×g離心5 min，重復(fù)洗滌3次。倒棄上清，留沉淀。加入4 mL PBS緩沖液，取1 mL移入1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存。DNA提?。?000×g離心5 min，倒棄上清收集沉淀。加入500 μL TE緩沖液，震蕩重懸。至液氮中凍結(jié)，取出后放入65 ℃水浴融化，反復(fù)凍融3次。再加入60 μL 10%SDS和2 μL 100 mg/mL RNase A，55 ℃水浴30 min。加入10 μL 蛋白酶K，混勻后于37 ℃搖床搖4 h。加80 μL CTAB和80 μL NaCl，混勻65 ℃水浴20 min。加750 μL苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），12000×g離心10 min。取上清，加750 μL氯仿：異戊醇（24：1），。12000×g離心10 min，取上清，重復(fù)上述步驟。在上清液中加500 μL預(yù)冷異丙醇混合。12000×g離心10 min，棄去上清，在沉淀中加1 mL 75%乙醇沖洗沉淀。在室溫中晾干乙醇。用60 μL TE溶解DNA。4 ℃放置過(guò)夜后置于-20 ℃凍存。

糞便基因組DNA提取試劑盒法：按TIANamp Stool DNA Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 DNA溶液濃度及純度測(cè)定

糞便總DNA通過(guò)紫外微量分光光度計(jì)定量檢測(cè)提取DNA濃度，用OD260/280檢測(cè)提取DNA的純度。

4 提取DNA的PCR有效性分析

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 sec，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（20個(gè)循環(huán)）；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（10個(gè)循環(huán)），72 ℃ 再延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EB染色，150 v/cm，15 min。用凝膠成像照相分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用T檢驗(yàn)比較，P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二 結(jié)果

1 不同方法提取糞便細(xì)菌基因組DNA產(chǎn)物純度和濃度比較結(jié)果

結(jié)果顯示不同方法提取的糞便DNA濃度在各組間均有顯著性差（P<0.001）。在提取DNA的純度上，OD值在1.8-2.0范圍內(nèi)較好。改進(jìn)液氮凍融法和試劑盒法的產(chǎn)物純度（OD260/280）是2.11±0.10，1.89±0.05。改進(jìn)液氮凍融法和試劑盒法的產(chǎn)物產(chǎn)物濃度是 784±69.13ng/μL，209.98±39.3ng/μL。

效性分析結(jié)果

2 不同方法提取糞便細(xì)菌基因組DNA產(chǎn)物的PCR有

在200bp處可擴(kuò)增出特異性條帶。糞便DNA提取試劑盒提取的DNA有清晰明亮的條帶。改進(jìn)液氮凍融法提取的DNA條帶亮度很大，但個(gè)別有拖尾現(xiàn)象。

3 不同方法提取糞便細(xì)菌基因組DNA產(chǎn)物所耗時(shí)間和費(fèi)用對(duì)比分析結(jié)果

改進(jìn)液氮凍融法用時(shí)15h，每個(gè)成本6元；試劑盒法用時(shí)2.5h，每個(gè)樣品成本19.6元。液氮凍融法提取糞便DNA前需要對(duì)糞便樣品進(jìn)行前處理清洗，所以操作所耗時(shí)間延長(zhǎng)，成本較低。而目前試劑盒提取方法工作效率較高， 但成本也相應(yīng)提高。

三 討論

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)的液氮凍融法，利用PBS緩沖液對(duì)凍存糞便進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果得到了高濃度的DNA產(chǎn)物相對(duì)試劑盒法，但產(chǎn)物純度沒(méi)有得到提升。試劑盒法提取的產(chǎn)物濃度適中，提取產(chǎn)物純度較好。但由于成本和耗時(shí)的差異，使得此種方法的選擇要根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。在探討糞便DNA的PCR有效性上，液氮凍融法的提取穩(wěn)定性較好，如果加大核糖核酸酶的使用量會(huì)減少RNA污染及電泳條帶拖尾現(xiàn)象，從而避免使用相對(duì)價(jià)格昂貴的試劑盒，使糞便DNA檢測(cè)更具廉價(jià)性。從糞便中提取高質(zhì)量腸道菌群總基因組DNA是研究分析腸道菌群與相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)和前提。糞便樣品中含有大量腸道菌，同時(shí)也含有各種腸道脫落細(xì)胞、腐殖質(zhì)及多種無(wú)機(jī)物和有機(jī)物等[3]。液氮凍融法經(jīng)過(guò)改進(jìn)比以前的方法在濃度和純度上有進(jìn)一步提升。由于目前糞便提取基因組DNA試劑盒在提取產(chǎn)物純度和質(zhì)量上的穩(wěn)定性，提高了糞便DNA提取效率的同時(shí)對(duì)腸道菌群DNA產(chǎn)物的測(cè)序工作奠定了研究基礎(chǔ)。綜上所述，建議實(shí)驗(yàn)室根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求和特點(diǎn)、經(jīng)費(fèi)支持情況、人力物力來(lái)合理選擇糞便DNA提取方法。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 劉偉偉，嚴(yán)敏，周麗萍，等.肥胖與腸道菌群的相關(guān)性[J].生命的化學(xué)，2009，29（6）：928-932.

[2] 徐潔.四川地區(qū)不同年齡健康人腸道菌群的比較研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 鄭曉皎.腸道菌-宿主代謝物組的分析平臺(tái)的建立及應(yīng)用[D].上海交通大學(xué)，2013.