阿格列汀對糖尿病大鼠腎臟病理改變的影響

鄭 杰 劉玉勝 張光昊 張行謙 高 敏 鹿慶華

(山東大學第二醫(yī)院，山東 濟南 250033)

阿格列汀對糖尿病大鼠腎臟病理改變的影響

鄭 杰 劉玉勝 張光昊 張行謙 高 敏 鹿慶華

(山東大學第二醫(yī)院，山東 濟南 250033)

目的探討糖尿病(DM)大鼠腎病中腎臟病理改變、細胞凋亡的機制及阿格列汀對細胞凋亡的影響。方法8周齡雄性Wistar大鼠50只，隨機分為對照組(n=10)，DM組(n=20)，阿格列汀組(n=20)。各組正常飲食，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素構建糖尿病模型。模型穩(wěn)定后，給予對照組、糖尿病組生理鹽水灌胃，阿格列汀組以一定劑量阿格列汀研缽磨碎后生理鹽水稀釋灌胃。于21 w末監(jiān)測血糖、血肌酐、尿素氮等生化指標，21 w末處死大鼠后蘇木素-伊紅(HE)染色、PAS染色、Masson染色等病理檢測腎功能及損傷情況；免疫組化、Western印跡檢測腎組織受體相互作用蛋白(RIP)3、Caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)的表達情況。結果與對照組相比，糖尿病組系膜細胞基底膜增厚，細胞外基質堆積，RIP3、Caspase-3、PARP表達增多，阿格列汀組腎臟病理損傷較輕，相應表達減少，但比對照組稍多，Western印跡結果阿格列汀組相對對照組變化不大。結論阿格列汀可能通過改善細胞凋亡通路中的死亡受體通路中的RIP3的表達改善腎臟細胞的凋亡程度，延緩腎臟病理損傷的進展。

阿格列??；糖尿病腎??；細胞凋亡；受體相互作用蛋白3；聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶

在糖尿病(DM)血管病變并發(fā)癥中，腎病導致心腦血管病變的發(fā)生、發(fā)展是引起終末期腎衰竭的主要原因之一〔1〕。糖尿病腎病(DN)的發(fā)生、發(fā)展是一個慢性而又復雜的過程。已有研究證實高糖誘導引起的氧化應激導致足細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞凋亡〔2〕。目前認為有3條通路參與凋亡的發(fā)生：線粒體通路，死亡受體通路和內質網通路〔3〕。其中，受體相互作用蛋白(RIP)3具有自磷酸化、誘導細胞凋亡和(或)壞死及激活核轉錄因子(NF)-κB的作用，是參與腫瘤壞死因子(TNF)-α介導的死亡受體凋亡通路的信號分子〔4〕。本實驗探討RIP3是否在腎臟細胞凋亡通路中起作用及阿格列汀能否改善DN腎臟病理損傷及細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1動物及分組 8周齡清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重200 g，購自山東大學醫(yī)學院實驗動物中心。適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機選10只作為對照組，DM組和阿格列汀組各20只，腹腔注射檸檬酸緩沖液溶解的鏈脲佐菌素(STZ，濃度2%)65 mg/kg構建DM模型。第3天測血糖(測血糖前需禁食12 h)，1 w后再測，隨機血糖>16.7 mmol/L視為造模成功，實驗過程中DM各組不符合標準者予以剔除。待模型穩(wěn)定后，給予對照組、DM組生理鹽水灌胃，阿格列汀組以一定劑量阿格列汀研缽磨碎后生理鹽水稀釋灌胃，21 w末稱重，處死動物取材。

1.2標本收集與處理 各組大鼠于21 w末于尾靜脈取血測血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。血糖由血糖測量儀、血糖試紙檢測。各組大鼠于第21周末處死提前1 d以代謝籠收取24 h尿液標本，加入甲苯防腐，記錄尿量，同時離心后取上清液置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于測定尿微量白蛋白。血、尿生化指標均由全自動生化分析儀測定。

1.3腎臟病理學觀察 各組大鼠于21 w末腹腔注射水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，取出雙腎，剝去腎包膜，稱取腎臟重量，并記錄，計算腎臟肥大指數(腎重/體重)，同時一部分腎臟放入4%多聚甲醛中以備制作石蠟切片，一部分投入液氮中12 h，然后置于-80℃冰箱中，以備Western印跡實驗。將標本從多聚甲醛中取出，流水沖洗3～4 h后脫水，石蠟包埋，用石蠟切片機切成4 μm的切片。

1.3.1HE染色 石蠟切片烤片30 min左右→脫蠟至水(二甲苯Ⅰ、Ⅱ，梯度酒精浸泡)→蘇木素染色2～3 min→蒸餾水沖洗一下→鹽酸酒精分化5 s→流水沖洗5 min→伊紅染色2～3 min→流水沖洗5 min→脫水透明→中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3.2PAS染色 石蠟切片烤片30 min左右→脫蠟至水→0.5%過碘酸溶液氧化10 min→蒸餾水充分洗滌5 min，3次→Schiff試劑染色40 min左右→亞硫酸沖洗液處理切片3次，每次2 min→流水沖洗10 min→蘇木素染核2～3 min→蒸餾水沖洗一下后鹽酸酒精分化5 s→流水沖洗5 min→脫水透明→中性樹膠封片。

1.3.3Masson染色 石蠟切片烤片約30 min→脫蠟至水→Masson復合染色液染色5 min→0.2%醋酸溶液清洗2次，每次1 min→5%磷鎢酸3 min→0.2%醋酸溶液清洗2次，每次1 min→亮綠染色30 s，0.2%醋酸水洗2次→脫水透明→中性樹膠封片。

1.3.4天狼星紅染色 石蠟切片烤片30 min左右→脫蠟至水→天狼星紅飽和苦味酸液染1 h左右→流水沖洗10 min→脫水透明→中性樹膠封片，偏振光顯微鏡觀察。

1.4免疫組化法檢測腎組織受體相互作用蛋白(RIP)3、Caspase-3及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶蛋白(PARP)表達 烤片30 min左右→脫蠟至水→EDTA抗原修復，高火2 min 40 s，低火15 min→自然冷卻約1 h→磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次3 min→3%H2O2室溫孵育15 min→PBS洗3次，各3 min→5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，20 min→滴加適當稀釋的一抗，4℃過夜(12～16 h)→37℃復溫，45 min→PBS洗3次，各3 min→滴加生物素標記的山羊抗兔IgG，37℃40 min→PBS洗3次，各3 min→DAB顯色，鏡下控制顯色時間，直至出現棕黃色顆?！魉疀_洗→蘇木素復染核2～3 min，沖洗之后鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗10 min→脫水透明→中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.5Western印跡檢測腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達 取-80℃凍存的腎臟組織剪碎、研磨提取蛋白→BCA法測蛋白濃度→配膠、上樣→電泳80 mV 2 h左右→切膠、轉膜200 mV 2 h左右→牛奶封閉1 h→1×TBST洗膜3次，每次5 min→敷一抗(1∶1 000)，4℃過夜(16 h)→1×TBST洗膜3次，每次15 min→敷生物素標記的山羊抗兔IgG 2 h→1×TBST洗膜3次，每次15 min→ECL顯色，ImageJ軟件對條帶進行分析，計算灰度值。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況 注射STZ后，DM組血糖明顯升高，開始出現多飲、多食、多尿的癥狀，體重明顯減輕，精神狀態(tài)較差，阿格列汀組較DM組情況有所改善。

2.2各組大鼠腎臟組織病理改變 DM組腎臟肥大指數較對照組明顯增大(P<0.01)，阿格列汀組較DM組明顯改善(P<0.01)。DM組HE染色與PAS染色同對照組相比，基底膜增厚，系膜基質增多，細胞外基質沉積，腎小球體積增大，血管壁玻璃樣變性、腎小管細胞空泡樣變性、紋理變亂等?；啄ひ约跋的さ母淖冊赑AS染色中較為明顯。阿格列汀組病理損傷較DM組輕。Masson染色以及天狼星紅染色與對照組相比，Ⅰ型膠原(紅色)、Ⅳ膠原(淡黃色)表達量增多，膠原纖維排列紊亂、分布不均，主要集中在腎小球系膜區(qū)，腎小管基底膜，阿格列汀組與DM組相比膠原表達量下降。見圖1。

2.3各組大鼠生化指標檢測 與對照組相比，DM組造模成功后血糖持續(xù)在11.1 mmol/L以上，有顯著差異(P<0.01)，Scr、BUN隨著飼養(yǎng)時間的延長，與對照組相比逐漸增加(P<0.01)，尿白蛋白排泄率(UAER)于12 w末與對照組相比含量明顯增高(P<0.01)，阿格列汀組與DM組相比各指標明顯改善(P<0.01)，見表1。

圖1 各組大鼠腎臟病理學改變(×200)

組別體重(g)腎重(g)肥大指數(‰)血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)UAER(μg/min)對照組363.64±8.391.37±0.024.33±0.105.54±0.146.65±0.1855.8±1.393.76±0.07DM組204.94±7.681)1.64±0.011)8.00±0.301)24.79±1.441)15.89±1.051)88.38±0.951)22.99±1.301)阿格列汀組243.27±6.361)2)1.54±0.021)2)6.37±0.191)2)20.66±0.421)2)12.21±0.841)2)73.93±0.871)2)15.31±0.751)2)

與對照組比較：1)P<0.01；與DM組比較：2)P<0.01

2.4免疫組化檢測各組腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達 RIP3主要在胞質中表達，DM組表達量較對照組明顯增多，主要集中在腎小管，阿格列汀組表達量下降(P<0.05)，Caspase-3在胞質、胞核中均有表達，DM組表達量較對照組明顯增加，主要集中在腎小管，腎小球中也可見部分棕黃色顆粒，阿格列汀組表達量相對DM組表達量顯著減少(P<0.05)。PARP主要在胞核中表達，DM組較對照組增多，在腎小管、腎小球均有表達，腎小管周圍頗多，阿格列汀組明顯下降(P<0.05)，見圖2，表2。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達(DAB，×200)

組別RIP3Caspase-3PARP對照組285.57±7.083256.30±61.56861.99±72.60DM組8892.59±387.031)9873.69±133.741)8626.17±273.561)阿格列汀組4125.23±320.442)4853.77±131.662)2805.53±157.442)

與對照組比較：1)P<0.05；與DM組比較：2)P<0.05，下表同

2.5Western印跡檢測各組大鼠腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達 與對照組相比，DM組RIP3、Caspase-3、PARP表達量明顯升高，而阿格列汀組較DM組表達量減少(P<0.05)，但與對照組相比無明顯改變(P>0.05)。見圖3，表3。

1～3：對照組、DM組、阿格列汀組圖3 Western印跡檢測各組大鼠腎組織RIP3、Caspase-3、PARP表達

組別RIP3/β-actinCaspase3/β-actinPARP/β-actin對照組1.40±0.102.22±0.111.12±0.07DM組1.80±0.071)2.67±0.161)1.73±0.071)阿格列汀組1.61±0.092)2.32±0.112)1.29±0.112)

3 討 論

DN的發(fā)病是慢性且復雜的過程，最終引起腎小球肥大，腎小球基底膜增厚，膠原沉積，隨著腎臟功能的逐漸失調，腎小管萎縮、間質纖維化加重〔5，6〕。細胞凋亡在DN的發(fā)展過程中起著重要作用，高糖狀態(tài)下，促使細胞凋亡的誘導因素如氧化應激、炎癥反應等使得凋亡的強度大于細胞增生的速率，導致組織細胞數量減少，系統(tǒng)功能失調〔7，8〕。RIP3作為一類重要調節(jié)細胞死亡或存活的信號分子，廣泛表達于胚胎和大量成熟組織〔9〕，在TNF-α誘導的細胞凋亡中，TNF-α受體(TNFR)1與TNF-α受體相關死亡結構域TRADD募集，經過一系列反應，RIP3被募集到TNFR1復合物1〔10〕，表現出促凋亡的活性。過量表達RIP3會誘導細胞凋亡，也會引發(fā)TNF-α誘導的Caspase依賴的細胞凋亡〔11〕，可能會引發(fā)腎小管上皮細胞過度凋亡。Caspase-3作為執(zhí)行細胞凋亡的終末剪切酶，將底物多聚聚合酶PARP剪切成31 kD和85 kD兩個片段，引起DNA損傷，DNA修復功能喪失，導致細胞凋亡〔12〕。本實驗通過免疫組化、Western印跡檢測RIP3、Caspase-3、PARP三個指標的表達情況，從細胞凋亡的水平發(fā)現DM組這三個指標表達均增加，與細胞凋亡通路分子水平變化相一致。DPP-Ⅳ抑制劑比如西格列汀、阿格列汀等，作為治療糖尿病的新型藥物，在不引起低血糖的狀態(tài)下可以減緩腸促胰島素效應降低的速率〔13〕。一些研究報告指出阿格列汀，作為DPP-Ⅳ抑制劑，對一些組織具有保護作用，比如心臟、腎臟、胰腺、視網膜等〔14〕。阿格列汀通過抑制二肽基肽酶-Ⅳ的活性延長胰高血糖素樣肽(GLP)-1的降解時間，可以糾正糖代謝紊亂，防止腎臟損傷〔15〕。由于GLP-1在血液中易被DPP-Ⅳ在數分鐘內降解，DPP-Ⅳ抑制劑如阿格列汀可以延緩二肽基肽酶Ⅳ降解的時間，增強GLP-1生物學活性，降低血糖〔16〕。已有研究證明在膽管細胞、神經元細胞、內皮細胞，GLP-1通過改善Bcl-2家族蛋白水平的表達水平減輕細胞凋亡率〔17〕，但是并沒有確切的證據表明阿格列汀是否能夠從細胞凋亡的水平改善腎臟損傷。本實驗通過研究發(fā)現，藥物干預后的老鼠血糖水平降低，通過觀察病理改變腎臟組織病理損傷也相應減輕，系膜區(qū)膠原沉積減少，細胞外基質堆積減少等，與文獻研究報道相一致〔18〕，通過阿格列汀的藥物干預，腎臟細胞凋亡的程度有所減輕，改善腎臟損害的進行性損傷。

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〔2016-04-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R589

A

1005-9202(2017)18-4437-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.004

山東省科技發(fā)展計劃項目(No.2013G0021813)；山東省中醫(yī)藥管理局(No.2011-029)；濟南市高校自主創(chuàng)新計劃(No.201401218)；中國心血管醫(yī)師研究基金(2014)

鄭 杰(1989-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事心血管疾病基礎及臨床研究。