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    益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性研究

    2017-09-26 02:52:02高培元
    中國食品工業(yè) 2017年6期
    關(guān)鍵詞:錐形瓶益母草濾紙

    高培元

    (蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院)

    益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性研究

    高培元

    (蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院)

    目的:對(duì)益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究,為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。方法:PDA培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵液中菌液和菌絲分離,乙酸乙酯萃?。粸V紙片法進(jìn)行抗菌活性篩選。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)對(duì)14株益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,可知益母草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)各指示菌均有抑菌作用。結(jié)論:益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌作用。

    益母草;內(nèi)生真菌;抑菌活性

    益母草(Leonurus japonicus Houtt.)為唇形科植物,一年或兩年生草本,含有生物堿和黃酮等活性物質(zhì),其干燥地上部分為常用中藥, 味辛苦、涼、活血、祛淤、調(diào)經(jīng)、消水,治療婦女月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、胞衣不下、產(chǎn)后血暈、瘀血腹痛、崩中漏下、尿血、瀉血、癰腫瘡瘍。

    一、材料與方法

    1、材料

    菌種 實(shí)驗(yàn)室前期保存的益母草內(nèi)生真菌。

    培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:蒸餾水,葡萄糖,馬鈴薯,瓊脂;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏,蛋白胨,瓊脂,NaCl。

    試劑 75%醫(yī)用酒精(山東利爾康消毒科技有限公司),青霉素(160萬單位哈藥集團(tuán)制藥總廠),鏈霉素(100萬單位華北制藥股份有限公司),BR Kermel瓊脂粉(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠),乙酸乙酯(工業(yè)級(jí)),蒸餾水。

    儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào):HH-B11.500BS)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、電子天平(ES-2002H)(長沙湘平科技發(fā)展有限公司),滅菌鍋(YS280B)(上海市三申醫(yī)療器械有限公司),冰箱(BCD-217CFA)(澳柯瑪股份公司),超凈臺(tái),恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司),恒溫振蕩器(SHZ-82)(國華儀器有限公司),JJ-CJ-ID 型超凈工作臺(tái)(杭州凈化設(shè)備廠),AB104-N 電子天平(Mettle-Toledo),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS)(上海榮生化儀器廠),循環(huán)水式多用真空泵(SHBIIIA)(鄭州長城科貿(mào)有限公司)、紗布、錐形瓶、漏斗等。

    2、實(shí)驗(yàn)(設(shè) 計(jì))方案

    2.1 菌種的復(fù)蘇

    2.1.1 PDA固體培養(yǎng)基的制備

    (1)將20個(gè)培養(yǎng)皿滅菌后,放入超凈臺(tái),紫外滅菌;

    (2)將馬鈴薯洗凈,削皮后稱重100g,切成小丁,并用蒸餾水洗2~3次;

    (3)將馬鈴薯放入鍋中,加入蒸餾水沒過馬鈴薯,并用玻璃棒攪拌蒸煮大約30min;

    (4)稍微冷卻后,用八層紗布過濾,棄濾渣;

    (5)將濾液稀釋到500m,加入100g葡萄糖,6.5g瓊脂并混合均勻;

    (6)將混合均勻的液體裝入錐形瓶中,用報(bào)紙及紗布封口,高壓滅菌30min后,取出放入超凈臺(tái);

    (7)待稍微冷卻后加入青霉素和鏈霉素;

    (8)倒平板,每個(gè)培養(yǎng)皿約20~30mL,水平放好,待其凝固。

    2.1.2 菌種的接種

    將冷藏菌種放于室溫2h,然后在滅菌30min后的超凈臺(tái)上,以無菌操作法接到2.1.1項(xiàng)下制備的平板上,放于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5-7天。

    2.2 菌種的發(fā)酵

    2.2.1 種子罐培養(yǎng)

    將平板上長好的菌種于滅菌30min后的超凈臺(tái)上,接到裝有300mL PD培養(yǎng)基的錐形瓶中,放入搖床(28℃,120r/min)中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)7-15天。

    2.3 發(fā)酵液的處理

    將發(fā)酵好的菌液用八層紗布過濾,將液體與菌絲分離,把得到的菌液和菌絲分別用乙酸乙酯萃取三次,合并有機(jī)相,回收乙酸乙酯,得到乙酸乙酯部位的浸膏。將所得浸膏放入烘箱使之完全干燥,待干燥后制成10mg/ml的樣品溶液,裝入小玻璃瓶中待用。

    2.4 粗品及單體化合物的抑菌

    2.4.1 益母草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物濾紙片制備及處理

    用打孔器將濾紙制成直徑為6mm的小圓片,121℃高溫滅菌30min備用。待測樣品發(fā)酵液用無菌水稀釋為10mg/ml,以備后用。

    2.4.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

    (1)將20個(gè)培養(yǎng)皿高溫滅菌后,放入超凈臺(tái),紫外滅菌;

    (2)于500ml錐形瓶中稱取牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 10g,瓊脂15-20g;

    (3)加1000ml蒸餾水使完全溶解;

    (4)調(diào)節(jié)PH 7.5左右,制成培養(yǎng)基溶液,進(jìn)行高溫滅菌;

    (5)滅菌結(jié)束將錐形瓶置于超凈臺(tái)中,稍作冷卻后及時(shí)倒平板;

    (6)倒平板,每個(gè)培養(yǎng)皿約20~30mL,水平放好,待其凝固。

    2.4.3 抑菌試驗(yàn)

    將大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,地衣芽孢桿菌,肺炎雙球菌,綠膿芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,37℃懸搖24h,制備所需菌懸液,再用無菌水稀釋成10-1,10-2,10-3,10-4濃度梯度,在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布,37℃培養(yǎng)24小時(shí),確定最適生長濃度。在倒好的培養(yǎng)基中加入最適濃度的菌懸液150ml,用涂布棒將菌液涂布均勻,制成含菌平板,然后用濾紙片蘸取10mg/ml的鏈霉素緩沖液放在平板中央做陽性對(duì)照,再將濾紙片蘸取樣品貼在平板上,每皿貼一片,每個(gè)菌種做兩個(gè)平行。完成以后,將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,采用求平均值法測定濾紙片的抑菌圈直徑大小,并比較它們抑菌效果。

    二、結(jié)果與分析

    2.1 益母草 內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)5種指示菌均有不同的抑制作用, 其中對(duì)大腸桿菌的抑制作用較為明顯,占樣品總數(shù)的70.1%;對(duì)地衣芽孢桿菌有抑制作用的占樣品總數(shù)的55.2%;對(duì)大腸桿菌有抑制作用比較少,僅有4種樣品,僅占樣品總數(shù)的28.6%;對(duì)肺炎鏈球菌有抑制作用的占樣品總數(shù)的42.9%;對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的占樣品總數(shù)的35.7%。其中有5個(gè)樣品,對(duì)2種以上指示菌有抑制作用。經(jīng)由梯度稀釋實(shí)驗(yàn)得出樣品對(duì)指示菌抑制作用的最小抑制濃度,通過對(duì)5種不同的濃度的指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)比較,可得益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有一定的抑菌作用。

    表1 益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)圖例

    2.2 結(jié)論

    抑菌實(shí)驗(yàn)表明,具有抑菌作用的樣品占樣品總數(shù)的64.3%,其中具有2種及以上抑菌作用的樣品占樣品總數(shù)的35.7%。但由于提取實(shí)驗(yàn)樣品均為粗品,所以抑菌作用未能完全發(fā)掘出來,表明益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物含有較多的抑菌資源,有待進(jìn)一步探索。另外實(shí)驗(yàn)所采取的濾紙片抑菌法效果稍差,未能得出準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

    三、主要參考文獻(xiàn)

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