miR-205在鼻咽癌組織中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響△

高英 謝麗

·基礎(chǔ)研究·

miR-205在鼻咽癌組織中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響△

高英 謝麗＊

目的探討miR-205在鼻咽癌組織中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。方法選取57例初治鼻咽癌患者和40例對照組，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測2組組織中的miR-205表達(dá)。培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，將細(xì)胞分為miR-205 minic組、minic-對照組、miR-205 inhibitor組和inhibitor-對照組，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-205表達(dá)，四氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖情況，劃痕實驗檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力，Transwell法檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果鼻咽癌組織中miR-205的相對表達(dá)量為1.85±0.17，高于對照組的1.14±0.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.099，P<0.05)。鼻咽癌組織中miR-205的相對表達(dá)量與臨床分期、病理分級和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。miR-205 minic組細(xì)胞中miR-205的相對表達(dá)量為0.87±0.12，顯著高于miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組，分別為0.34±0.09、0.53±0.11和0.55±0.12，且miR-205 inhibitor組低于minic-對照組和inhibitor-對照組(P<0.001)。miR-205 minic組細(xì)胞48 h、72 h和96 h的增殖能力顯著高于minic-對照組和inhibitor-對照組，而miR-205 inhibitor組則低于minic-對照組和inhibitor-對照組(P<0.001)。miR-205 minic組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均高于miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組，且miR-205 inhibitor組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于minic-對照組和inhibitor-對照組(P<0.001)。結(jié)論miR-205在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，下調(diào)miR-205表達(dá)可減少鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：328-332)

鼻咽癌；miR-205；細(xì)胞增殖；侵襲能力

鼻咽癌是鼻咽黏膜好發(fā)的惡性腫瘤，病因多樣且存在地域差異[1]。由于其起病隱匿，惡性程度高，多數(shù)患者臨床確診時已處于中晚期，嚴(yán)重影響預(yù)后[2]。中晚期鼻咽癌患者初治反應(yīng)率較低，且5年生存率<60%[3]。目前，鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究[4]指出，鼻咽癌的發(fā)病及進(jìn)展是多因素、多基因、多步驟共同作用的結(jié)果。微小RNA(micro RNA，miRNA，miR)是機(jī)體廣泛存在、高度保守、含20個核苷酸的小RNA，與多種惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[5]。miR-205作為miRNA的重要類型，在食管癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、卵巢癌[8]等多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。本研究對鼻咽癌組織中miR-205的表達(dá)進(jìn)行檢測，并利用轉(zhuǎn)染miR-205模擬物或抑制物的方法，探討其對人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，以期為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年3月～2016年4月在本科住院治療的初治鼻咽癌患者57例，其中男性36例、女性21例；年齡28～74歲，平均(43.2±9.5)歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢驗確診，均未接受放、化療。臨床分期：Ⅰ期4例、Ⅱ期6、Ⅲ期31例、Ⅳ期16例；病理分級：未分化癌23例、低分化鱗狀細(xì)胞癌34例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。同期選取因其他疾病行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的鼻咽部標(biāo)本40例作為對照組，均排除鼻咽癌，其中男性24例、女性16例，年齡27～73歲，平均(44.1±10.2)歲。2組研究對象性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。鼻咽癌患者均取治療前活檢標(biāo)本，對照組通過鼻內(nèi)鏡取鼻咽黏膜組織，保存于-70 ℃液氮中。研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備 CNE-2細(xì)胞株由美國ATCC細(xì)胞庫提供，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Hyclone公司，Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)試劑盒購自日本Takara公司，miR-205和內(nèi)參U6序列均由上海生工生物公司設(shè)計合成，miR-205模擬物(miR-205 minic)、miR-205抑制物(miR-205 inhibitor)及相應(yīng)的對照序列均由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計合成，LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國 Invitrogen公司，四氮唑藍(lán)(microculture tetrozolium, MTT)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，紫外分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，全自動酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-205表達(dá) 取鼻咽癌和對照組組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。用Trizol總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，利用紫外分光光度計對總RNA純度進(jìn)行檢測，以A260/A280≥1.80作為合格樣品。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板，用PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-205引物，上游：5′-CTTGTCCTTCATTCCACCGGA-3′，下游：5′-TGCCGCCTGAACTTCACTCC-3′；U6引物，上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，進(jìn)行40次循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法獲得鼻咽癌和對照組組織中miR-205相對表達(dá)量。取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解，其余步驟同上。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基對CNE-2細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，取對數(shù)生長細(xì)胞，接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右時，利用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，將細(xì)胞分為4組。miR-205 minic組轉(zhuǎn)染miR-205模擬序列：5′-UCCUUCAUUCCACCGG-AGUCUG-3′；minic-對照組轉(zhuǎn)染minic對照序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；miR-205 inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-205抑制物序列：5′-CCGGTGGAATGAA-GG-3′；inhibitor-對照組轉(zhuǎn)染inhibitor對照序列：5′-ACGTCTATACGCCCA-3′。各組轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況 取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×103/孔。每組均設(shè)置5個復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72、96 h時，將5 g/L的MTT液20 μL加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。去除培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)200 μL，充分振蕩12 min，待結(jié)晶完全溶解后，利用全自動酶標(biāo)儀對570 nm處吸光度A值進(jìn)行檢測。

1.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 取各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰酶消化后，用RPMI-1640培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，接種于背后有劃線的6孔板中，1 mL/孔，于恒溫培養(yǎng)箱中過夜孵育。待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時，用無菌槍頭垂直于背后劃橫線，每孔連續(xù)至少穿過5條。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，去除漂浮細(xì)胞。置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于劃痕0 h和24 h拍照，利用Image-Pro Plus圖像分析軟件對劃痕距離進(jìn)行分析。細(xì)胞遷移率=[(W0 h-W24 h)/W0 h]×100%(W表示寬度)。

1.7 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室上室鋪Matrigel膠50 μL，取各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰酶消化后，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制備濃度為1×106個/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL接種于Transwell小室上室，將含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于小室下室，于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕將上室中的細(xì)胞去除，用結(jié)晶紫染色，于高倍鏡取5個視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 2組組織中miR-205表達(dá) 鼻咽癌組織中miR-205相對表達(dá)量為1.85±0.17，高于對照組的1.14±0.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.099，P<0.05)。2.2 鼻咽癌組織中miR-205表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 鼻咽癌組織中miR-205相對表達(dá)量與性別、年齡、浸潤范圍無關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期、病理分級和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(表1)。

表1 鼻咽癌組織中miR-205表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-205表達(dá) miR-205 minic組細(xì)胞中miR-205相對表達(dá)量為0.87±0.12，顯著高于miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組，分別為0.34±0.09、0.53±0.11和0.55±0.12，且miR-205 inhibitor組低于minic-對照組和inhibitor-對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=34.286，P<0.001)。

2.4 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力 miR-205 minic組細(xì)胞48 h、72 h和96 h增殖能力顯著高于minic-對照組和inhibitor-對照組，而miR-205 inhibitor組則低于minic-對照組和inhibitor-對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表2)。

2.5 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力 miR-205 minic組細(xì)胞遷移率為(61.8±13.5)%，顯著高于miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組，分別為(31.6±9.6)%、(48.6±10.7)%和(50.7±11.5)%，且miR-205 inhibitor組細(xì)胞遷移率均低于minic-對照組和inhibitor-對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=40.617，P<0.001)(圖1)。

表2 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力比較(A值，

圖1. 劃痕實驗檢測不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力 A、C、E、G分別示0 h時miR-205 minic組、miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組；B、D、F、H分別示24 h時miR-205 minic組、miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組 ×100

2.6 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力比較 miR-205 minic組侵襲細(xì)胞數(shù)為(261.8±23.5)個，顯著高于miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組，分別為(131.6±19.4)個、(208.6±18.5)個和(211.7±20.2)個，且miR-205 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)均低于minic-對照組和inhibitor-對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.509，P<0.001)(圖2)。

圖2 Transwell法檢測不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力 A. miR-205 minic組；B. miR-205 inhibitor組；C. minic-對照組；D. inhibitor-對照組 結(jié)晶紫染色 ×100

3 討論

鼻咽癌是惡性程度較高的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多因素、多基因、多步驟。近年來，隨著診療技術(shù)的進(jìn)展，鼻咽癌診療水平得到長足發(fā)展，但由于腫瘤惡性程度高、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，多數(shù)患者預(yù)后較差[9]。因此，積極探討影響鼻咽癌發(fā)生及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因或因素，對改善患者預(yù)后具有重要意義。miR-205是miRNA家族成員之一，其在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，既可發(fā)揮癌基因作用[10]，又可作為抑癌基因而抑制腫瘤發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中miR-205的相對表達(dá)量高于對照組，說明miR-205可能作為癌基因參與了鼻咽癌的發(fā)生。鄧鈴等[12]通過篩選鼻咽癌石蠟標(biāo)本中miRNA的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，miR-205在鼻咽癌中表達(dá)水平升高，可能參與了鼻咽癌的發(fā)生過程，與本研究結(jié)論一致。在與臨床病理特征之間的關(guān)系分析中發(fā)現(xiàn)，miR-205相對表達(dá)量與臨床分期、病理分級和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、未分化癌和發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中呈高表達(dá)，提示miR-205可能參與了鼻咽癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程。

為進(jìn)一步探討miR-205在鼻咽癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，利用miR-205模擬物、抑制物及對照序列轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞。結(jié)果顯示，miR-205 minic組細(xì)胞增殖能力顯著高于minic-對照組和inhibitor-對照組，而miR-205 inhibitor組則低于minic-對照組和inhibitor-對照組，說明上調(diào)miR-205可促進(jìn)CNE-2細(xì)胞增殖，下調(diào)miR-205則可抑制細(xì)胞增殖，提示miR-205參與了鼻咽癌細(xì)胞增殖過程。有研究[13]指出，上調(diào)miR-205可通過調(diào)控Cyclin D1、P21基因而實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控。劃痕實驗和Transwell小室實驗進(jìn)一步顯示，miR-205 minic組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于miR-205 inhibitor組、minic-對照組和inhibitor-對照組，且miR-205 inhibitor組細(xì)胞遷移率均低于minic-對照組和inhibitor-對照組，說明上調(diào)miR-205可提高細(xì)胞遷移和侵襲能力，抑制miR-205則抑制細(xì)胞遷移及侵襲能力，進(jìn)一步說明miR-205基因表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力有關(guān)。

綜上所述，miR-205在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，可能在鼻咽癌發(fā)生中發(fā)揮癌基因功能，下調(diào)miR-205可減少鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，有望為鼻咽癌基因治療提供新的靶位。

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ExpressionofmiR-205innasopharyngealcarcinomatissuesanditseffectoncellproliferationandinvasion

GAOYing,XIELi＊.

DepartmentofOtolaryngology,Ji′nanIronandSteelGroupCorporationHospitalinShandongProvince,Ji′nan250101,China

GAO Ying, Email: 2967939793@qq.com

ObjectiveTo investigate the expression of miR-205 in nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissues and its effect on cell proliferation and invasion.MethodsFifty-seven patients with newly diagnosed NPC and 40 non-NPC patients who had accepted endoscopic surgery (as the control group) were selected. The expression of miR-205 in nasopharyngeal tissues in the two groups were detected by using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR). The human NPC CNE-2 cells were cultured. According to the different transfectants, CNE-2 cells were divided into miR-205 minic group, minic-control group, miR-205 inhibitor group and inhibitor-control group. The expressions of miR-205 in different transfected groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The cell proliferation was detected by microculture tetrozolium (MTT) assay. The cell migration ability was detected by scratch test. The invasive ability was detected by Transwell method.ResultsThe relative expression of miR-205 in NPC tissues (1.85±0.17) was significantly higher than those in the control group (1.14±0.12) (t=25.099,P<0.05). The relative expression of miR-205 was related to clinical stage, pathological grade and cervical lymph node metastasis (P<0.05). The relative expression of miR-205 in miR-205 minic group (0.87±0.12) was significantly higher than those in miR-205 inhibitor group, minic-control group and inhibitor-control group [(0.34±0.09), (0.53±0.11) and (0.55±0.12)], and the relative expression of miR-205 in miR-205 inhibitor group was lower than those in the minic-control group and inhibitor-control group (P<0.01). The cell proliferations at 48 h, 72 h and 96 h in the miR-205 minic group were higher than in the minic-control group and inhibitor-control group, while those in the miR-205 inhibitor group were lower than in the minic-control group and inhibitor-control group (P<0.001). The cell migration rate and invasive cell numbers in the miR-205 minic group were higher than those in the miR-205 inhibitor group, minic-control group and inhibitor-control group, and the cell migration rate and invasive cell numbers in miR-205 inhibitor group were lower than those in the minic-control group and inhibitor-control group (P<0.001).ConclusionsMiR-205 was highly expressed in NPC tissues. Down-regulation expression of miR-205 could reduce the proliferation, invasion and migration of CNE-2 cells. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:328-332)

Nasopharyngeal carcinoma; miR-205; Cell proliferation; Invasive ability

2016-11-28)

(本文編輯 楊美琴)

國家自然科學(xué)基金(81372888)

山東省濟(jì)南鋼鐵有限公司總醫(yī)院耳鼻喉科 濟(jì)南 250101；＊山東省腫瘤醫(yī)院耳鼻喉科 濟(jì)南 250117

高英(Email: 2967939793@qq.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.05.005