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      優(yōu)化Fe-CA仿酶合成工藝研究

      2017-09-25 06:11:49趙士舉魏登輝常安然劉小勇于建軍
      關(guān)鍵詞:煙梗木質(zhì)素卷煙

      趙士舉,魏登輝,常安然,張 聳,劉小勇,于建軍

      (1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 河南 鄭州 450002; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 河南 鄭州 450002)

      優(yōu)化Fe-CA仿酶合成工藝研究

      趙士舉1,魏登輝2,常安然2,張 聳2,劉小勇1,于建軍2

      (1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 河南 鄭州 450002; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 河南 鄭州 450002)

      為了減少梗絲中木質(zhì)素含量,改善梗絲的品質(zhì),提高其在卷煙中的應(yīng)用,對Fe-CA仿酶合成的4個影響因素(摩爾配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH)進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化,并將合成的Fe-CA仿酶對梗絲進(jìn)行木質(zhì)素降解,對處理前后的梗絲進(jìn)行電鏡掃描,并將其制成單料煙進(jìn)行感官評價(jià)。結(jié)果表明,最佳合成方案條件是n(Fe2+)∶n(檸檬酸)為1∶1,反應(yīng)溫度是60 ℃,反應(yīng)時(shí)間是40 min,pH值為6.0,此時(shí)合成率為82.1%;Fe-CA仿酶處理后的梗絲,木質(zhì)素含量由3.49%降至1.60%,去除率達(dá)54.15%;Fe-CA仿酶處理后的梗絲表面變得更加齊整光滑,毛突減少;與對照相比,試驗(yàn)卷煙的香氣質(zhì)和香氣量得到了改善,木質(zhì)雜氣減少,刺激性降低,品質(zhì)得到提升。

      梗絲;仿酶;木質(zhì)素;卷煙;感官評價(jià)

      中國是煙草種植大國,每年都會有大量煙梗產(chǎn)生。如何有效利用煙梗,近年來有很多研究機(jī)構(gòu)對此進(jìn)行了一些有意義的研究,如龔德鴻等[1]通過熱解的方式將生煙梗轉(zhuǎn)化為生物油,還有人將煙梗膨脹制成梗絲添加到卷煙中。由于煙梗的主要成分是木質(zhì)素、纖維素和半纖維等,其中木質(zhì)素燃燒時(shí)有木質(zhì)氣并產(chǎn)生灼喉感,限制了煙梗在卷煙行業(yè)中的使用,因此,可以通過減少煙梗中的木質(zhì)素來改善煙梗在卷煙中的使用效果。關(guān)于木質(zhì)素的降解方法主要有物理、化學(xué)及生物法等,如李力等[2]用蒸汽爆破的方法處理煙梗,從而使煙梗的木質(zhì)素含量減少;郭剛等[3]通過利用稀NaOH溶液與酶聯(lián)用的方式來處理煙梗,結(jié)果表明,煙梗木質(zhì)素降解30%,煙梗內(nèi)在品質(zhì)得到提升;林凱等[4]用生物酶對梗絲進(jìn)行處理,使梗絲木質(zhì)素含量減少,梗絲品質(zhì)得到提升。 仿酶是既有酶的功能又比酶簡單穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)分子或分子集合體, 兼有天然酶催化與化學(xué)催化的優(yōu)點(diǎn), 其中鐵系仿酶中的Fe-羧酸復(fù)合物(Fe-CA)體系對天然植物原料中木質(zhì)素的脫除具有良好的選擇性[5-7]。迄今為止,對Fe-CA仿酶合成工藝的優(yōu)化及其在梗絲降解過程中的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道,本研究選擇Fe-CA仿酶對梗絲中的木質(zhì)素進(jìn)行脫除,然后將降解后的梗絲用到卷煙生產(chǎn)上,以改善煙梗對卷煙的感官質(zhì)量造成不佳抽吸的狀況。

      1 材料與方法

      1.1材料、試劑與儀器

      梗絲(河南地區(qū))、98 %濃硫酸(AR,煙臺市雙雙化工有限公司)、檸檬酸(AR,天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、FeSO4·7H2O(AR,天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、95 %無水乙醇(AR,天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、鄰二氮菲(AR, 德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)

      四口瓶(250 mL,北京博美BOMEX玻璃儀器)、電熱恒溫水浴鍋(HH·SY21-Ni,北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司)、恒溫恒濕箱(澳德瑪HWHS-100HC,深圳市澳德瑪科技有限公司)、掃描電子顯微鏡(日本,JSM-6490LV)、雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、傅里葉紅外光譜儀(IR-960, 天津瑞岸科技有限公司)等。

      1.2Fe-CA仿酶的合成

      取0.01 mol檸檬酸加入適量蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移至250 mL 四口瓶中,同時(shí)加入少量鐵粉做抗保護(hù)劑,在通入高純氮?dú)獗Wo(hù)下將四口瓶放入恒溫水浴中低速攪拌10 min ;加入0.01 mol的硫酸亞鐵,待硫酸亞鐵完全溶解后,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)四口瓶中反應(yīng)溶液pH值至試驗(yàn)設(shè)計(jì)值。開始計(jì)時(shí),反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)后溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中,加入一定量的無水乙醇,攪拌5~10 min,析出螯合物,過濾并用無水乙醇洗滌沉淀物2~3次,低溫真空干燥得到Fe-CA仿酶樣品。其余按表1做正交試驗(yàn)[8-12]。

      1.3Fe-CA仿酶單因素試驗(yàn)

      主要選取Fe2+與檸檬酸配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值4個因素考察Fe-CA仿酶合成的最佳條件,水平梯度設(shè)為n(Fe2+):n(檸檬酸) 分別為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4和1∶5,反應(yīng)溫度設(shè)為30,40,50,60和70 ℃,反應(yīng)時(shí)間設(shè)為20,30,40,50和60 min,pH值設(shè)為3.0,4.0,5.0,6.0和7.0。

      1.4Fe-CA仿酶正交試驗(yàn)

      在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用DPS統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Fe-CA仿酶合成正交試驗(yàn),試驗(yàn)選取n(Fe2+):n(檸檬酸)(1∶1,1∶2和1∶3)(A)、反應(yīng)溫度(40,50和60℃)(B)、反應(yīng)時(shí)間(30,40和50 min)(C)和pH值(4.0,5.0和6.0)(D)為因素,設(shè)計(jì)成4因素3水平9處理試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

      表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

      1.5Fe-CA仿酶合成率的測定

      通過檢測水樣在510 nm 處的吸光值,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到水樣中Fe2+濃度與吸光值的關(guān)系曲線,計(jì)算出合成物產(chǎn)品中亞鐵的含量,對比初始反應(yīng)時(shí)加入的亞鐵離子的量,得出Fe-CA仿酶合成率[8]。

      1.6Fe-CA仿酶處理前后梗絲的紅外光譜測定

      先稱取Fe-CA仿酶0.001 g,再稱取溴化鉀0.1 g,烘干后混勻,用研缽研碎,經(jīng)過壓片后,在傅里葉紅外光譜儀上測Fe-CA仿酶的圖譜。同理,經(jīng)溴化鉀壓片后測檸檬酸的紅外光譜圖[13]。

      1.7Fe-CA仿酶在梗絲木質(zhì)素降解中的應(yīng)用

      將一定量的Fe-CA仿酶溶解到純水中,制成Fe-CA仿酶溶液,用小型噴霧器將Fe-CA仿酶溶液噴灑到梗絲上,之后將處理過的梗絲裝入自封袋中,放入恒溫恒濕箱中(溫度35 ℃,濕度65%)處理30 min進(jìn)行酶解,之后將梗絲烘干。采用煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T 347—2010[14]測定梗絲中木質(zhì)素含量(即用酸性洗滌劑除去糖類、蛋白質(zhì)、半纖維素及脂肪等成分后,再以72%硫酸處理,最后測定酸不溶木質(zhì)素的含量)。設(shè)降解前的梗絲木質(zhì)素含量為X1,降解后的梗絲木質(zhì)素含量為X2,梗絲木質(zhì)素降解率為(X1-X2)/X1×100%。

      1.8Fe-CA仿酶處理前后梗絲的評吸

      將經(jīng)Fe-CA仿酶處理后的梗絲,放在溫度(22±1)℃和相對濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱中平衡48 h,用填煙器分別將經(jīng)過Fe-CA仿酶處理和未經(jīng)過Fe-CA仿酶處理的梗絲制成煙支(每支約為1 g,每個樣10支),放入恒溫恒濕箱中繼續(xù)平衡48 h,由鄭州卷煙廠的卷煙感官評吸專家小組(7人)進(jìn)行評吸[15-16]。

      2 結(jié)果與分析

      2.1Fe-CA仿酶合成單因素試驗(yàn)

      2.1.1n(Fe2+)∶n(檸檬酸)對Fe-CA仿酶合成率的影響 在初始條件pH值6.0,反應(yīng)溫度50 ℃,反應(yīng)時(shí)間40 min下,考察不同F(xiàn)e2+與檸檬酸摩爾配比對Fe-CA仿酶合成率的影響,結(jié)果如圖1所示。在Fe2+不變,檸檬酸逐漸增加的過程中,F(xiàn)e-CA仿酶的合成率逐漸減低,這說明n(Fe2+)∶n(檸檬酸)為1∶1時(shí)為最佳配比。

      圖1 配比對Fe-CA仿酶合成率的影響Fig.1 Effect of coordination ratio on the synthesisrate of Fe-CA biomimetic enzyme

      2.1.2 反應(yīng)溫度對Fe-CA仿酶合成率的影響 在初始pH值6.0,n(Fe2+)∶n(檸檬酸)為1∶1,反應(yīng)時(shí)間40 min的情況下,改變溫度進(jìn)行試驗(yàn),探討反應(yīng)溫度對Fe-CA仿酶合成率的影響,結(jié)果如圖2所示。隨著反應(yīng)溫度的升高,F(xiàn)e-CA仿酶的合成率呈先升高后降低的趨勢,這可能是隨著反應(yīng)溫度的增加,逆反應(yīng)趨勢增大的造成的,在50 ℃時(shí)合成率達(dá)到最大。

      圖2 反應(yīng)溫度對仿酶合成率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on thesynthesis rate of Fe-CA biomimetic enzyme

      2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對Fe-CA仿酶合成率的影響 在初始pH值6.0,n(Fe2+)∶n(檸檬酸)為1∶1,反應(yīng)溫度50 ℃的情況下,改變反應(yīng)時(shí)間,探討反應(yīng)時(shí)間對Fe-CA仿酶合成率的影響,結(jié)果如圖3所示。隨著時(shí)間的增加,合成率先增大后減小,反應(yīng)時(shí)間為40 min時(shí)合成率達(dá)最大值。

      圖3 反應(yīng)時(shí)間對Fe-CA仿酶合成的影響Fig.3 Effects of reaction time on the synthesisrate of Fe-CA biomimetic enzyme

      2.1.4 pH值對Fe-CA仿酶合成率的影響 在n(F2+e)∶n(檸檬酸)為1∶1,反應(yīng)溫度50 ℃,反應(yīng)時(shí)間 40 min的情況下,改變反應(yīng)的pH值,來探討反應(yīng)pH對Fe-CA仿酶合成率的影響,結(jié)果如圖4所示。隨著反應(yīng)溶液pH值的增大,F(xiàn)e-CA仿酶合成率先增大后降低,在pH值5.0時(shí),合成率最大。

      圖4 pH值對Fe-CA仿酶合成的影響Fig.4 Effects of pH on the the synthesisrate of Fe-CA biomimetic enzyme

      2.2Fe-CA仿酶合成的正交試驗(yàn)

      在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn),從而找出Fe-CA仿酶合成的最佳試驗(yàn)方案,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。 由表2可知,F(xiàn)e-CA仿酶合成的最佳工藝條件是A1B3C2D3,即最佳合成方案條件是n(Fe2+)∶n(檸檬酸)為1∶1,溫度是60 ℃,時(shí)間是40 min,pH為6.0。由表2試驗(yàn)結(jié)果中的極差R大小可知,影響Fe-CA仿酶合成率大小的影響因素主要是配比,然后是反應(yīng)時(shí)間,其次是反應(yīng)溫度和溶液的pH值。

      因此, 綜合以上正交試驗(yàn),確定n(Fe2+)∶n(檸檬酸)為1∶1,反應(yīng)溫度60 ℃, 反應(yīng)時(shí)間40 min, pH值為6.0時(shí)為最佳合成工藝條件。

      表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experimental

      注:K1,K2,K3是均值,R是極差。

      Note:K1,K2,K3indicate mean,Ris range.

      2.3Fe-CA仿酶和檸檬酸的紅外光譜對比

      經(jīng)過溴化鉀壓片測得Fe-CA仿酶和檸檬酸的紅外光譜圖,結(jié)果如圖5所示。從Fe-CA仿酶紅外圖譜可以看出,F(xiàn)e-CA仿酶在1 641.39 cm-1和1 384.39 cm-1處有吸收峰,說明此兩處有CO,前者為反對稱伸縮振動,后者為對稱伸縮振動,其中1 641 cm-1處為配位羧基的特征吸收峰,表明了硫酸亞鐵和多元羧酸的羧基發(fā)生了配位反應(yīng)。對照檸檬酸紅外光譜圖,其中1 700.27和1 755.36 cm-1處 的自由羧基吸收峰消失,表明硫酸亞鐵和多元羧酸反應(yīng)完全,形成晶體[7-8]。

      圖5 Fe-CA仿酶和檸檬酸紅外圖譜Fig.5 Infrared spectrum of Fe-CA and citric acid

      2.4Fe-CA仿酶降解梗絲木質(zhì)素試驗(yàn)

      用煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法測梗絲木質(zhì)素含量,木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式:X/%=m1/m0×100%,公式中,m1為烘干后的木質(zhì)素質(zhì)量(g);m0為絕干試樣的質(zhì)量(g)。測得梗絲降解前的木質(zhì)素含量為3.49 %(m1為0.034 9g,m0為1 g),經(jīng)Fe-CA仿酶降解后梗絲的木質(zhì)素含量為1.60 %(m1為0.016g,m0為1 g),降低了54.15 %,表明Fe-CA仿酶對梗絲木質(zhì)素有較好的降解作用。

      將經(jīng)Fe-CA仿酶處理前后的梗絲樣品分別切片,然后在SEM電鏡下觀察,結(jié)果見圖6。由圖6可知,經(jīng)Fe-CA仿酶處理后的梗絲表面比未處理的梗絲表面變得更加齊整光滑,毛突減少,說明梗絲經(jīng)Fe-CA仿酶處理后木質(zhì)素降解較好。

      2.5Fe-CA仿酶處理前后梗絲表面評吸結(jié)果分析

      對加Fe-CA仿酶處理的梗絲與經(jīng)Fe-CA仿酶處理的梗絲分別進(jìn)行評吸,結(jié)果見表3。由表3可知,加Fe-CA仿酶處理的梗絲,卷煙煙氣的香氣質(zhì)、香氣量得到提高,余味改善,煙氣中的雜氣、刺激性降低;但煙氣濃度、勁頭、燃燒性及灰色則無明顯變化。

      圖6 Fe-CA仿酶處理前后煙梗絲表面SEM圖(×200)Fig.6 SEM map of cut stem before and after treatment with Fe-CA biomimetic enzyme

      3 結(jié)論與討論

      通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了Fe-CA仿酶合成工藝條件,當(dāng)反應(yīng)條件是n(F2+e)∶n(檸檬酸)為1∶1,反應(yīng)溫度是60 ℃,反應(yīng)時(shí)間是40 min,pH值為6.0,合成效果最好。通過對比Fe-CA仿酶和檸檬酸的紅外光譜圖確認(rèn)了硫酸亞鐵與檸檬酸合成了晶體。用合成的Fe-CA仿酶來處理梗絲中的木質(zhì)素,木質(zhì)素含量由原來的3.49 %降到1.60 %,降低了54.15 %。文獻(xiàn)[17]中以過氧化氫和氫氧化鉀溶液處理梗絲,梗絲木質(zhì)素含量降低43.5%。易聰華等[18]用氧堿法處理煙梗,煙梗中木質(zhì)素含量降低47.9%??梢?,用本方法合成的Fe-CA仿酶對梗絲木質(zhì)素的降解效果較好。分別對降解后的梗絲和未降解的梗絲進(jìn)行評吸,結(jié)果表明,經(jīng)過Fe-CA仿酶處理的梗絲,在香氣、雜氣、刺激性和余味方面得到了改善,卷煙品質(zhì)得到提升。

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      (責(zé)任編輯:常思敏)

      OptimizationofthesynthesisprocessofFe-CAbiomimeticenzyme

      ZHAO Shiju1, WEI Denghui2, CHANG Anran2, ZHANG Song2, LIU Xiaoyong1, YU Jianjun2

      (1. College of Sciences , Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

      In order to reduce the lignin content in cut stems, to improve the quality of cut stems and to increase their proportion in cigarette blends, single factor experiments were conducted to study the effects of four factors involved in synthesis of Fe-CA biomimetic (molar ratio, reaction temperature, reaction time, and pH). The synthesis process of Fe-CA biomimetic was optimized by orthogonal test, the cut stems were analyzed by scanning electron microscope before and after Fe-CA biomimetic treatment, and the sensory quality of cigarettes made of the treated and untreated cut stems was panel tested, separately. The results showed that: under the optimum synthesis conditions,n(Fe2+):n(citric acid) 11, reaction temperature 60 ℃, reaction time 40 min, and pH 6.0, the synthesis rate is 82.1%; after the Fe-CA biomimetic treatment of the cut stems , the content of lignin in cut stems fell from 3.49% to 1.60%, the removal rate reached 54.15%, and the surface of the cut stems was smoother with less burrs; compared with the control, the aroma quality, aroma quantity of the test cigarette smoke were improved, the levels of offensive odor and irritation were reduced, and the quality of the cut stems was enhanced.

      cut stem; biomimetic; lignin; cigarette; sensory evaluation

      S 572

      :A

      2016-10-21

      河南農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基金項(xiàng)目(30600980)

      趙士舉(1979-),男,河南滎陽人,副教授,主要從事功能化研究。

      于建軍(1957-),男,山東文登人,教授。

      1000-2340(2017)02-0212-06

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