利用SSR快速鑒定棉花品種真實(shí)性和純度

王欣怡艾先濤王俊鐸梁亞軍龔照龍鄭巨云郭江平 買買提·莫明李雪源,*新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 83005;新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 新疆烏魯木齊 83009

利用SSR快速鑒定棉花品種真實(shí)性和純度

王欣怡1艾先濤2王俊鐸2梁亞軍2龔照龍2鄭巨云2郭江平2買買提·莫明2李雪源2,*
1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 830052;2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 新疆烏魯木齊 830091

利用 SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)棉花品種真實(shí)性和純度進(jìn)行分析研究, 旨在為棉花品種提供分子鑒定依據(jù)。以具有代表性的棉花品種為材料, 經(jīng)過(guò)引物初篩和復(fù)篩, 確定26對(duì)均勻分布于棉花染色體上的SSR核心標(biāo)記。結(jié)果表明, 26對(duì)核心標(biāo)記在120份材料中篩選得到138個(gè)等位位點(diǎn), 其中129個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn), 多態(tài)性比率達(dá)93.48%。以標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照, 利用26對(duì)核心標(biāo)記對(duì)10份棉花常規(guī)種進(jìn)行真實(shí)性鑒定, 發(fā)現(xiàn)僅有源棉6號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA圖譜高度一致,其他9份常規(guī)種與標(biāo)準(zhǔn)品種均存在8～18個(gè)差異位點(diǎn), 分子鑒定結(jié)果與田間鑒定相符。另外分別篩選5對(duì)特征引物作為純度檢測(cè)標(biāo)記, 采用單位點(diǎn)平均法統(tǒng)計(jì) 4份常規(guī)棉品種檢測(cè)結(jié)果表明, 源棉 6號(hào)純度最高, 為 98.0%, 源棉 1號(hào)最低, 為90.5%, 檢測(cè)結(jié)果與田間純度鑒定呈現(xiàn)正相關(guān)性。研究表明利用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定棉花品種真實(shí)性和純度的方法完全可行。

棉花; 真實(shí)性鑒定; 純度檢測(cè); SSR分子標(biāo)記

品種真實(shí)性和純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》中定義, 品種真實(shí)性(cultivar genuineness或trueness)是指一批種子所屬品種與文件(品種證書(shū)、標(biāo)簽等)是否相同; 而品種純度(varietal purity)則是指品種在特征、特性方面典型一致的程度。品種混雜和純度降低會(huì)明顯降低作物產(chǎn)量、影響作物品質(zhì)。Ashok等[1]研究認(rèn)為若種子純度每降低 1%, 那么每公頃棉花減產(chǎn)可達(dá) 100 kg。近年來(lái), 我國(guó)棉花品種“套牌”、“冒牌”現(xiàn)象嚴(yán)重, 品種質(zhì)量較差, 嚴(yán)重影響棉花生產(chǎn)安全和健康發(fā)展, 因此,生產(chǎn)和市場(chǎng)迫切需要一種科學(xué)有效的品種鑒定方法。長(zhǎng)期以來(lái), 國(guó)內(nèi)外棉花品種真實(shí)性和純度鑒定的權(quán)威方法, 是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的田間小區(qū)種植鑒定。由于許多形態(tài)學(xué)性狀鑒定周期長(zhǎng)、調(diào)查性狀易受栽培條件及環(huán)境因素影響,使其時(shí)效性和可靠性受到一定限制[2], 難以及時(shí)監(jiān)控市場(chǎng)上的種子質(zhì)量問(wèn)題和解決品種侵權(quán)等糾紛。

分子生物學(xué)的發(fā)展使農(nóng)作物品種鑒定進(jìn)入基因水平,其中以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記具有擴(kuò)增穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn), 因此被廣泛應(yīng)用于棉花品種鑒定[3]。武耀廷等[4]利用48對(duì)SSR標(biāo)記檢測(cè)了30個(gè)陸地棉栽培品種和 4個(gè)高優(yōu)勢(shì)雜交種親本的多態(tài)性, 并建立了雜交種的SSR指紋圖譜用于分子鑒定和純度檢測(cè)。朱美霞等[5]以5個(gè)棉花栽培品種為材料, 利用15對(duì)SSR引物確定了分析品種純度所需引物數(shù), 為棉花品種指紋圖譜的建立提供了理論依據(jù)。殷劍美等[6]從 217對(duì)引物中篩選出 21對(duì)多態(tài)性引物, 構(gòu)建蘇雜118的SSR指紋圖譜, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)蘇雜118真實(shí)性和純度的快速鑒定。Yu等[7]選擇105對(duì)均勻分布于染色體的引物, 對(duì)棉屬6個(gè)種的12個(gè)基因型進(jìn)行多態(tài)性分析, 揭示了棉屬種間和陸地棉種內(nèi)的DNA多態(tài)信息。劉國(guó)棟等[8]利用78個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)12個(gè)棉花品種進(jìn)行標(biāo)記基因型分析, 通過(guò)分析非純位點(diǎn)率和異型單株率對(duì)品種遺傳純度的影響, 建立了利用 SSR標(biāo)記鑒定棉花品種純度的方法。

目前利用分子標(biāo)記對(duì)棉花品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定和純度檢測(cè)的研究主要是針對(duì)雜交種, 有關(guān)常規(guī)種的研究報(bào)道還比較少。本研究利用 26對(duì)均勻分布于染色體上的SSR標(biāo)記對(duì)棉花品種真實(shí)性和純度分析研究, 并針對(duì)如何提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本, 提出了合理混合 DNA樣品的方法, 確定了一種快速鑒定棉花常規(guī)品種真實(shí)性與純度的 SSR分子標(biāo)記方法, 為今后棉花品種鑒定提供分子水平上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與取樣方法

對(duì)于棉花品種真實(shí)性鑒定選用常規(guī)品種源棉6號(hào)、新陸早13、新陸早26、新陸早37、新陸中9、新陸中37、魯棉研28、中棉所35、中棉所41、中棉所43共10個(gè)品種為材料, 隨機(jī)選取每個(gè)品種 15個(gè)單株, 將每 5個(gè)單株DNA等量混合進(jìn)行SSR分析, 以SSR位點(diǎn)有2個(gè)或2個(gè)以上等位變異的組, 對(duì)構(gòu)成混樣的5個(gè)單株DNA進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)于棉花品種純度 SSR檢測(cè)與田間鑒定選用常規(guī)品種中棉所49、源棉1號(hào)、源棉2號(hào)和源棉6號(hào)為材料, 取每個(gè)品種100個(gè)單株, 對(duì)單株DNA進(jìn)行SSR檢測(cè); 在盛鈴期[9]分別調(diào)查4個(gè)品種的株型、鈴形、葉形等, 作為田間品種純度鑒定的依據(jù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉花基因組DNA的提取 采用改良CTAB法快速提取棉花基因組 DNA[10]。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度, 通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確定其質(zhì)量。

1.2.2 SSR擴(kuò)增與電泳分析 SSR引物信息來(lái)源于CMD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cottonmarker.org/)、CottonDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cottondb.org/)以及文獻(xiàn)資料[8,11-12]已公布的引物。采用10 μL PCR體系, 包括DNA模板(60 ng μL–1) 1 μL, 正、反向引物(4 pmol μL–1)各0.5 μL, 10×緩沖液1μL, dNTPs (2.5 mmol L–1) 0.2 μL, Taq酶(5 U μL–1) 0.1 μL和ddH2O 6.7 μL。參考艾先濤等[13]PCR方法, 產(chǎn)物經(jīng)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 快速銀染法[14]染色(僅需12 min)。

1.2.3 數(shù)據(jù)記錄與位點(diǎn)判讀 利用均勻分布的26對(duì)核心標(biāo)記, 將供試樣本電泳譜帶與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較, 根據(jù)譜帶一致性判定供試樣品的真實(shí)性, 結(jié)果用不同、近似、相同表示。當(dāng)供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品差異位點(diǎn)＞2時(shí), 判定為不同品種; 當(dāng)差異位點(diǎn)≤2時(shí), 判定為相似品種; 若供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品無(wú)差異位點(diǎn), 則判定為相同品種[15]。從供試樣品中隨機(jī)選取 100個(gè)單株作為檢測(cè)樣本, 根據(jù)真實(shí)性鑒定時(shí)核心引物的擴(kuò)增結(jié)果, 分別選取 5對(duì)特征引物作為純度檢測(cè)標(biāo)記。品種純度P = (NT–ND)/NT×100%, 式中NT為供檢品種總株數(shù), ND為雜株數(shù), 以平均值表示該品種的純度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

以8份遺傳背景差異較大的品種對(duì)分布于棉花全基因組的586對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行初步篩選, 隨后利用120份具有廣泛代表性的材料復(fù)篩, 最終確定26對(duì)多態(tài)性高、帶型清晰的SSR引物定為本次試驗(yàn)的核心引物(表1)。26對(duì)核心引物均勻分布于棉花26條染色體上, 在120份復(fù)篩材料上共檢測(cè)到138個(gè)等位基因變異, 平均每個(gè)SSR有5.31個(gè),變幅為2～9, 其中具有多態(tài)性的位點(diǎn)為129個(gè), 多態(tài)性比率達(dá)93.48%。26對(duì)核心引物總體上鑒別能力尚可, 進(jìn)行棉花品種的鑒定是可行的。

2.2 棉花品種真實(shí)性鑒定

2.2.1 取樣量的確定 單個(gè)植株無(wú)法代表整個(gè)品種群體的基因型信息, 綜合考慮工作量及操作可行性, 將品種真實(shí)性鑒定的樣品量確定為15個(gè)單株, 再將單株DNA合并為若干混合樣本進(jìn)行SSR分析。

為確定混合樣本中個(gè)體DNA份數(shù), 將A (新陸早26)和B (新陸中37) 2個(gè)品種按10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10的比例混合DNA, 分別記作樣1～樣11, 利用多態(tài)性SSR引物對(duì)11個(gè)樣本進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為2個(gè)品種的雜合帶型(圖1)。隨著2個(gè)品種DNA濃度在各個(gè)樣本中比例的改變, 其 PCR產(chǎn)物中 2個(gè)品種的帶紋清晰度也逐漸加強(qiáng)或減弱。

表1 用于棉花品種鑒定的26對(duì)SSR核心引物Table 1 Twenty-six pairs of SSR core primers for cotton varieties identification

圖1 A和B不同比例DNA混合樣本標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 SSR bands of mixed DNA samples from Xinluzao 26 and Xinluzhong 37

檢測(cè)到供試品種和雜株的多態(tài)性位點(diǎn)時(shí), 混合樣本中的雜株達(dá)到20%, 雜株帶型清晰可見(jiàn)。據(jù)此認(rèn)為5個(gè)單株DNA合并為1個(gè)混合樣本最為合理。只要該混合樣本中有1個(gè)雜株, 此位點(diǎn)的帶型將表現(xiàn)為測(cè)試品種與雜株的雜合帶型, 進(jìn)一步檢測(cè)5個(gè)單株, 便能找出與其余4株帶型不同的單株。

2.2.2 真實(shí)性鑒定的結(jié)果判定 選取10個(gè)棉花常規(guī)品種將其編號(hào)(表2), 隨機(jī)選取15株源棉6號(hào)品種, 以5個(gè)單株DNA均勻混合為1組, 制成3個(gè)樣本(A1、A2、A3)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。將供試樣品也按照上述方法制成3個(gè)樣本(X1、X2、X3), 利用26對(duì)核心標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增分析, 通過(guò)對(duì)比供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品整體圖譜的差異位點(diǎn), 判斷待檢樣品的真實(shí)性。2.2.3 同一樣品 3組混樣間差異位點(diǎn)分析 通過(guò)對(duì)比同一樣品3組混合樣本電泳圖譜發(fā)現(xiàn)(圖2), 源棉6號(hào)和中棉所43的3組混合樣本在26個(gè)標(biāo)記中譜帶均一致; 其余8個(gè)品種3組混合樣本之間存在4～13個(gè)差異位點(diǎn)。對(duì)于相同位點(diǎn)譜帶不一致的3組混合樣本, 進(jìn)一步分析構(gòu)成該混樣的15個(gè)單株圖譜(圖3), 確定非本品材料。

2.2.4 供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品間差異位點(diǎn)分析 10個(gè)供試樣品中, 僅 A1～A3樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品在26個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增圖譜完全一致, 判定為相同品種; 其余樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品間存在8～18個(gè)差異位點(diǎn)(圖4), 判定為不同品種。事實(shí)上A1～A3樣品即為源棉6號(hào)品種的3個(gè)分樣。

表2 用于真實(shí)性鑒定的10個(gè)常規(guī)棉花品種Table 2 List of 10 inbred cotton varieties for authenticity identification

圖2 引物NAU2083在不同品種3組混合樣本中的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplified bands of three mixed samples by the different varieties with primer NAU2083

圖3 引物NAU2083在15個(gè)單株(新陸早13和新陸中37)的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Amplified result of 15 single plants (Xinluzao 13 and Xinluzhong 37) with primer NAU2083

利用該方法不僅實(shí)現(xiàn)了供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的鑒定,而且10個(gè)供試樣品也能夠相互區(qū)分, 統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3。26對(duì)核心引物成功鑒定出了 10份棉花材料的真實(shí)性, 說(shuō)明所選核心引物具有鑒別能力和區(qū)分能力。

2.3 棉花品種純度檢測(cè)

2.3.1 SSR分子檢測(cè) 分別從26對(duì)核心引物中篩選5對(duì)特征引物作為純度檢測(cè)標(biāo)記(表4), 采用單位點(diǎn)平均法統(tǒng)計(jì)4份常規(guī)棉品種100個(gè)單株的純度檢測(cè)結(jié)果(圖5)。帶型統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明, 同一品種不同引物的一致性帶型存在較大的差異, 中棉所49在5對(duì)引物中的一致性變化范圍在94%～98%之間, 平均95.3%, 經(jīng)統(tǒng)計(jì), 源棉1號(hào)品種的純度為90.5%,源棉2號(hào)品種的純度為94.7%, 源棉6號(hào)品種的純度為98%。

2.3.2 SSR分子檢測(cè)與田間種植鑒定分析 為了進(jìn)一步驗(yàn)證分子檢測(cè)結(jié)果的可靠性, 根據(jù)中棉所 49、源棉 1號(hào)、源棉2號(hào)、源棉6號(hào)品種區(qū)域試驗(yàn)和審定所描述的田間表型性狀, 在盛鈴期對(duì)其進(jìn)行調(diào)查(表5)。

結(jié)果顯示兩種方法鑒定結(jié)果一致, 其純度由高到低均為源棉6號(hào)＞中棉所49＞源棉2號(hào)＞源棉1號(hào), 但對(duì)同一品種的純度, 田間種植鑒定結(jié)果均高于分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果(表6)。

圖4 引物CGR5707在標(biāo)準(zhǔn)樣品與10個(gè)供試樣品的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 Amplified result of standard sample and 10 detection varieties with primer CGR5707 M: marker; A～J: 10個(gè)供試品種。M: marker; A–J: 10 tested varieties.

3 討論

棉花品種真實(shí)性和純度鑒定結(jié)果是棉花質(zhì)量監(jiān)控和品種權(quán)保護(hù)的依據(jù)。利用 SSR標(biāo)記進(jìn)行品種真實(shí)性鑒定和純度檢測(cè)在大多作物中已有報(bào)道[16-18], 在棉花品種鑒定研究中也取得了一定進(jìn)展。隨著分子標(biāo)記技術(shù)不斷簡(jiǎn)化,完成1個(gè)品種鑒定的試驗(yàn)僅需1 d左右, 與形態(tài)標(biāo)記相比,具有準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。

表3 10份供試樣品真實(shí)性鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Authenticity identification result of ten varieties

表4 常規(guī)棉品種純度檢測(cè)引物信息表Table 4 Primer information of purity test in inbred cotton varieties

圖5 引物BNL3860在100個(gè)單株(中棉所49)的純度擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 Amplified result of 100 plants of Zhongmiansuo 49 with primer NAU2083

表5 4個(gè)棉花品種純度的田間形態(tài)鑒定結(jié)果Table 5 Purity of four cotton varieties identified by morphological method

表6 分子標(biāo)記鑒定法與田間形態(tài)鑒定純度結(jié)果比較Table 6 Comparison of purity by molecular marker identification and morphological identification (%)

利用SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定, 引物的篩選是關(guān)鍵。劉國(guó)棟等[8]認(rèn)為選擇標(biāo)記時(shí), 應(yīng)盡量覆蓋到棉花的26條染色體。本研究以具有典型代表性的材料, 從分布于棉花全基因組的586對(duì)SSR標(biāo)記中篩選出26對(duì)具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物, 作為SSR分子鑒定的核心標(biāo)記, 26對(duì)核心標(biāo)記均勻分布于棉花26條染色體上。每條染色體上選擇一對(duì)引物, 能最大限度地減少位點(diǎn)間的連鎖, 以保證真實(shí)性和純度鑒定時(shí)結(jié)果的可靠性。

真實(shí)性鑒定涉及不同樣品之間的關(guān)系, 檢測(cè)結(jié)果用不同、近似、相同表示。結(jié)果判讀時(shí), 設(shè)定不同棉花品種界定以2個(gè)差異標(biāo)記為限: 當(dāng)兩個(gè)品種混樣圖譜之間2個(gè)以上差異標(biāo)記時(shí), 可判讀為不同品種; 當(dāng)兩品種混樣圖譜之間有小于等于2個(gè)差異標(biāo)記時(shí), 可判讀為近似品種或相同品種。26個(gè)核心標(biāo)記不僅實(shí)現(xiàn)了不同供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的鑒定, 且不同樣品間也能相互區(qū)分。這與王俊芳[18]在棉花上的研究結(jié)果一致。棉花是常異花授粉作物, 天然異交率達(dá)5%～20%[19], 種群內(nèi)遺傳多樣性豐富, 劉文獻(xiàn)等[20]認(rèn)為最佳取樣量應(yīng)包含品種95%以上的遺傳變異類型。研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)取樣量為3個(gè)單株時(shí), 所包含的遺傳變異占比為82.4%～92.3%, 隨著取樣量的增加, 所包含的遺傳變異占比也隨之增加。當(dāng)取樣量在12個(gè)及12個(gè)以上單株時(shí), 品種包含的遺傳變異占比均超過(guò) 95%, 且隨著取樣量的增加占比變化幅度不顯著[11]。本文選定的15個(gè)單株取樣量,既能較好地滿足群體遺傳信息的要求, 又能合理控制工作量?；旌蠘悠贩軌蛱岣哞b定效率, 本試驗(yàn)先對(duì)5個(gè)單株葉片的DNA等量混合進(jìn)行SSR鑒定, 對(duì)于同一位點(diǎn)上譜帶不一致的組, 再對(duì)構(gòu)成各組混樣的單株進(jìn)行檢測(cè)。這種先采用混合取樣鑒定, 再對(duì)表現(xiàn)雜合組個(gè)體鑒定的方法, 使工作量減少了 4/5, 遠(yuǎn)比對(duì)單株進(jìn)行檢測(cè)節(jié)省時(shí)間和成本。

品種純度的鑒定則以本品種的株數(shù)占供檢樣品總株數(shù)的百分率表示, 匡猛等[21]認(rèn)為用 SSR標(biāo)記鑒定棉花品種純度時(shí), 不同的統(tǒng)計(jì)方法與標(biāo)記類型獲得的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果差異較大; 朱美霞等[5]認(rèn)為對(duì)于純度較高的品種只需要2～4對(duì)引物即可獲得滿意的檢測(cè)結(jié)果; 但對(duì)于純度較低的棉花品種, 則至少需要5對(duì)引物, 甚至10對(duì)引物才可以獲得較為精確的檢測(cè)結(jié)果。本研究利用5個(gè)核心標(biāo)記及單位點(diǎn)平均法統(tǒng)計(jì)樣品純度。SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果均低于田間檢測(cè)結(jié)果, 且SSR標(biāo)記檢測(cè)純度較低的品種, 田間檢測(cè)純度也相對(duì)較低, 反過(guò)來(lái)也是如此, 兩者呈正相關(guān)性,表明 SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果在一定程度上可以反應(yīng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)的品種純度高低。

[1] Ashok B D, Mamta P R, Manoj R B, Kshanada J M. Identification and genetic purity testing of cotton F1Hybrid using molecular markers. Indian J Biotechnol, 2011, 10: 301–306

[2] 劉峰, 馮雪梅, 鐘文, 劉玉棟, 陰祖軍, 韓秀蘭, 徐子初, 沈法富. 適合棉花品種鑒定的 SSR核心引物的篩選. 分子植物育種, 2009, 7: 1160–1168 Liu F, Feng X M, Zhong W, Liu Y D, Yin Z J, Han X L, Xu Z C, Shen F F. Screening of SSR core primer pairs for identificating cotton cultivar. Mol Plant Breed, 2009, 7: 1160–1168 (in Chinese with English abstract)

[3] 周大云, 楊偉華, 魏守軍, 王延琴, 匡猛, 馬磊, 方丹, 侯愛(ài)玲.棉種純度和真實(shí)性3種鑒定方法簡(jiǎn)介. 中國(guó)棉花, 2015, 42(8): 5–7 Zhou D Y, Yang W H, Wei S J, Wang Y Q, Kuang M, Ma L, Fang D, Hou A L. A brief introduction of 3 methods for identification of purity and authenticity of cotton seed. China Cotton, 2015, 42(8): 5–7 (in Chinese)

[4] 武耀廷, 張?zhí)煺? 郭旺珍, 殷劍美. 陸地棉品種SSR標(biāo)記的多態(tài)性及用于雜交種純度檢測(cè)的研究. 棉花學(xué)報(bào), 2001, 13: 131–133 Wu Y T, Zhang T Z, Guo W Z, Yin J M. Detecting polymorphism among upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivars and their roles in seed purity of hybrids with SSR markers. Cotton Sci, 2001, 13: 131–133 (in Chinese with English abstract)

[5] 朱美霞, 李英芝, 王建書(shū), 侯英梅, 孟艷玲. 利用 SSR方法鑒定棉花品種純度. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 33: 2010–2016 Zhu M X, Li Y Z, Wang J S, Hou Y M, Meng Y L. Purity identification of cotton varieties with SSR technique. J Anhui Agric Sci, 2005, 33: 2010–2016 (in Chinese with English abstract)

[6] 殷劍美, 陳旭升, 狄佳春, 許乃銀, 肖松華, 劉劍光, 吳巧娟.雜交棉蘇雜118的SSR指紋圖譜構(gòu)建. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, (4): 29–31 Yin J M, Chen X S, Di J C, Xu N Y, Xiao S H, Liu J G, Wu Q J. Establishment of finger printing of SSR mark for Suza 118 hybrid. Jiangsu Agric Sci, 2007, (4): 29–31 (in Chinese)

[7] Yu J Z, Fang D D, Kohel R J, Ulloa M, Hinze L L, Percy R G, Zhang J F, Chee P, Scheffler B E, Jones D C. Development of a core set of SSR markers for the characterization of Gossypium germplasm. Euphytica, 2012, 187: 203–213

[8] 劉國(guó)棟, 王芙蓉, 宮永超, 馬和歡, 張軍. 棉花品種遺傳純度的SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)研究. 棉花學(xué)報(bào), 2013, 25: 382–387 Liu G D, Wang F R, Gong Y C, Ma H H, Zhang J. A new method for identification of the genetic purity of cotton varieties by SSR markers. Cotton Sci, 2013, 25: 382–387 (in Chinese with English abstract)

[9] 白靜. 雜交棉品種SSR核心引物的篩選與真實(shí)性和純度鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論, 湖北武漢, 2011 Bai J. Screening of SSR Core Primer and the Identification of Genuineness and Purity on Hybrid Cotton. MS Thesis of Huazhong Agricultural University, Wuhan, China, 2011 (in Chinese with English abstract)

[10] Porebski S, Bailey L G, Baum B R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 1997, 15: 8–15

[11] 張小娟, 陸徐忠, 何團(tuán)結(jié), 路曦結(jié), 鄭曙峰, 倪金龍, 張冰清,楊劍波. 利用 SSR分子標(biāo)記進(jìn)行棉花品種鑒定的研究. 棉花學(xué)報(bào), 2014, 26: 483–491 Zhang X J, Lu X Z, He T J, Lu X J, Zheng S F, Ni J L, Zhang B Q, Yang J B. Identification of cotton varieties using SSR molecular markers. Cotton Sci, 2014, 26: 483–491 (in Chinese with English abstract)

[12] 聶新輝, 尤春源, 李曉方, 秦江鴻, 黃聰, 郭歡樂(lè), 王夏青, 趙文霞, 林忠旭. 新陸早棉花品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析. 作物學(xué)報(bào), 2014, 40: 2104–2117 Nie X H, You C Y, Li X F, Qin J H, Huang C, Guo H L, Wang X Q, Zhao W X, Lin Z X. Construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity for Xinluzao cotton varieties. Acta Agron Sin, 2014, 40: 2104–2117

[13] 艾先濤, 梁亞軍, 沙紅, 王俊鐸, 鄭巨云, 吐?tīng)栠d江, 多力坤,李雪源, 華金平. 新疆自育陸地棉品種SSR 遺傳多樣性分析.作物學(xué)報(bào), 2014, 40: 369–379 Ai X T, Liang Y J, Sha H, Wang J D, Zheng J Y, Tu-Er-Xun-Jiang, Duo L K, Li X Y, Hua J P. Genetic diversity analysis on local upland cotton cultivars in Xinjiang based on SSR markers. Acta Agron Sin, 2014, 40: 369–379 (in Chinese with English abstract)

[14] 張軍, 武耀廷, 郭旺珍, 張?zhí)煺? 棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的 PAGE/銀染的快速檢測(cè). 棉花學(xué)報(bào), 2000, 12: 267–269 Zhang J, Wu Y T, Guo W Z, Zhang T Z. Fast screening of microsatellite markers in cotton with PAGE/ silver staining. Cotton Sci, 2000, 12: 267–269 (in Chinese with English abstract)

[15] 李莉, 楊劍波, 汪秀峰, 向太和, 吳家道. 利用 RAPD和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)協(xié)優(yōu)雜交稻及其親本進(jìn)行區(qū)別與鑒定. 中國(guó)水稻科學(xué), 2000, 14: 203–207 Li L, Yang J B, Wang X F, Xiang T H, Wu J D. Identification of Xieyou combinations of hybrid rice and their three parents by using RAPD and microsatellite markers. Chin J Rice Sci, 2000, 14: 203–207 (in Chinese with English abstract)

[16] Yao Q L, Yang K C, Pan G T. Genetic diversity of maize (Zea mays L.) landraces from Southwest China based on SSR data. J Genet Genom, 2007, 34: 851–860

[17] 王立新, 李云伏, 常利芳, 黃嵐, 李宏博, 葛玲玲, 劉麗華, 姚驥, 趙昌平. 建立小麥品種DNA指紋的方法研究. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33: 1738–1740 Wang L X, Li Y F, Chang L F, Huang L, Li H B, Ge L L, Liu L H, Yao J, Zhao C P. Method of ID constitution for wheat cultivars. Acta Agron Sin, 2007, 33: 1738–1740 (in Chinese with English abstract)

[18] 王俊芳. 基于 SSR標(biāo)記的棉種真實(shí)性和品種純度鑒定技術(shù)研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文, 北京, 2009 Wang J F. SSR Markers-Based Cotton Purity and Authenticity Identification. MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2009 (in Chinese with English abstract)

[19] 計(jì)懷春, 孫君靈, 周中立, 潘兆娥, 賈銀華, 何守樸, 龐保印,王立如, 杜雄明. 陸地棉繁殖群體大小對(duì)遺傳完整性的影響.棉花學(xué)報(bào), 2014, 26: 145–152 Ji H C, Sun J L, Zhou Z L, Pan Z E, Jia Y H, He S P, Pang B Y, Wang L R, Du X M. Effects of population size on seed increase for genetic integrity of cotton. Cotton Sci, 2014, 26: 145–152 (in Chinese with English abstract)

[20] 劉文獻(xiàn), 李立會(huì), 劉偉華, 張正茂, 吳振海, 王成社. 華山新麥草居群取樣策略的 SSR分析. 麥類作物學(xué)報(bào), 2006, 26: 16–20 Liu W X, Li L H, Liu W H, Zhang Z M, Wu Z H, Wang C S. SSR analysis on the sampling strategy of psathyrostachys Huashanic keng population. J Triticeae Crops, 2006, 26: 16–20 (in Chinese with English abstract)

[21] 匡猛, 楊偉華, 張玉翠, 許紅霞, 王延琴, 周大云, 馮新愛(ài), 蘇暢, 周紅. 棉花雜交種純度的 SSR標(biāo)記檢測(cè)及其與田間表型鑒定的相關(guān)性. 作物學(xué)報(bào), 2011, 37: 2295–2305 Kuang M, Yang W H, Zhang Y C, Xu H X, Wang Y Q, Zhou D Y, Feng X A, Su C, Zhou H. Cotton hybrid purity tested by SSR markers and its correlation with phenotype identification in field. Acat Agron Sin, 2011, 37: 2295–2305 (in Chinese with English abstract)

Rapid Identification System of Purity and Authenticity in Cotton Varieties by SSR Markers

WANG Xin-Yi1, AI Xian-Tao2, WANG Jun-Duo2, LIANG Ya-Jun2, GONG Zhao-Long2, ZHENG Ju-Yun2, GUO Jiang-Ping2, MAMAT Mo-Ming2, and LI Xue-Yuan2,*

1Key Laboratory of Agriculture Biological Technology / College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;2Economic Crop Research Institute, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091, China

SSR molecular markers were used to analyze the authenticity and purity of cotton varieties, providing a molecular basis for the identification of cotton varieties. Typical cotton varieties were used as materials, and 26 pairs of primers well-distributed on the cotton genome were ascertained as the core primers in SSR molecular identification by preliminary and multiple screening. A total of 138 alleles from 120 varieties were screened by using 26 pairs of core primers, 129 of which were polymorphic loci, with a polymorphism rate of 93.48%. Ten inbred cotton varieties were used with 26 pairs of SSR core primers to identify the variety purity. The DNA fingerprint of one variety (Yuanmian 6) shared high uniformity with that of the standard cultivar, and DNA fingerprints of other nine varieties had 8–18 loci different from those of standard cultivar. The results from SSR molecular marker matched with those from field experiments. Five specific primers were selected for testing authenticity of each cultivar from 26 core primers. The variety with highest purity was Yuanmian 6, with the purity of 98.0% and that with lowest purity was Yuanmian 1, with the purity of 90.5%. It suggests that identifying authenticity and purity of cotton varieties is feasible by SSR molecular markers.

Cotton; Authenticity identification; Purity testing; SSR marker

(

): 2016-12-20; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-19.

10.3724/SP.J.1006.2017.01565

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360351)資助。

The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360351).

*通訊作者(Corresponding author): 李雪源, E-mail: xjmh2338@163.com

聯(lián)系方式: E-mail: 15999173011@163.com, Tel: 15999173011

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170519.1200.008.html