兩種鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

穆希巖,李成龍,黃 瑛,沈公銘,李緒興,雷云雷,黃 嵐,逄 森,李應(yīng)仁,李學(xué)鋒,王成菊*(.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心,北京 004；.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 0093)

兩種鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

穆希巖1*,李成龍2,黃 瑛1,沈公銘1,李緒興1,雷云雷1,黃 嵐2,逄 森2,李應(yīng)仁1,李學(xué)鋒2,王成菊2*(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心,北京 100141；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 100193)

研究了鄰苯二甲酸二辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響,并利用酶聯(lián)免疫法檢測了DEHP和DBP暴露后兩種與胚胎發(fā)育相關(guān)的蛋白(Nkx2.5和LOX)及甲狀腺素(T3、T4)水平的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)濃度下(10～500 μg/L)的DEHP和 DBP可誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)一系列發(fā)育異常,包括自主運(yùn)動(dòng)異常、心率下降、脊柱彎曲及心包水腫等,同時(shí)伴隨心臟發(fā)育蛋白 Nkx2.5含量顯著下降.ELISA檢測結(jié)果表明,500μg/L的DEHP和DBP暴露后,斑馬魚胚胎T3、T4含量顯著上升.上述結(jié)果表明DEHP和DBP對(duì)魚類早期生命階段同樣具備內(nèi)分泌干擾作用.另外,本研究中DEHP和DBP對(duì)斑馬魚胚胎的最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)為10μg/L,已經(jīng)接近它們在一些環(huán)境水域的檢出濃度,因此其對(duì)水環(huán)境中處于早期生命階段的生物的潛在危害急需重視.

鄰苯二甲酸二辛酯；鄰苯二甲酸二丁酯；斑馬魚胚胎；發(fā)育毒性；激素含量

增塑劑(又稱塑化劑)是一種能夠增加材料可塑性、柔韌性和膨脹性的添加劑,在塑料生產(chǎn)中的使用十分頻繁.鄰苯二甲酸酯(Phthalate Esters,PAEs)是目前應(yīng)用最為普遍的增塑劑,廣泛用于食品包裝、兒童玩具、建筑材料、醫(yī)療用品和化妝品等領(lǐng)域[1].鄰苯二甲酸酯與塑料分子之間由氫鍵或范德華力連接,彼此保留各自相對(duì)獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì),因此隨著時(shí)間的推移,PAEs很容易從塑料中擴(kuò)散到外環(huán)境[2],從而污染水和空氣等.目前鄰苯二甲酸酯類污染物已經(jīng)引起國際環(huán)保部門的普遍重視,美國環(huán)保局(EPA) 將鄰苯二甲酸二辛酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)等六種鄰苯二甲酸酯類化合物列入了重點(diǎn)控制的環(huán)境污染物名單中[3].中國將DMP、DEHP和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物[4].《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》也已經(jīng)將DBP和DEHP 作為檢測項(xiàng)目[5].

隨著我國對(duì)鄰苯二甲酸酯環(huán)境監(jiān)測工作的重視,國內(nèi)不斷有環(huán)境地表水中PAEs的檢出情況被報(bào)道.如重慶主城長江和嘉陵江中豐水期時(shí) DEHP和 DBP的檢出濃度分別達(dá)到 5.2和 4.6μg/L[6].而在松花江、長江武漢段、黃河中下游等重要水域中均檢測出較高濃度的鄰苯二甲酸酯類污染物(表1),其中DEHP和DBP在一些漁業(yè)水域的檢出濃度已經(jīng)超過《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中的限量(DEHP: 8μg/L; DBP: 3μg/L)[5].因此,環(huán)境水體中的PAEs可能對(duì)所在水域中的水生生物產(chǎn)生影響,開展鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究十分必要.

表1 鄰苯二甲酸二辛酯和鄰苯二甲酸二丁酯在我國重要環(huán)境水域中的含量(μg/L)Table 1 Detected concentrations of DEHP and DBP in Chinese important environmental water areas (μg/L)

大量的離體試驗(yàn)和哺乳動(dòng)物活體試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)鄰苯二甲酸酯類污染物屬于環(huán)境激素,具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用.因此在鄰苯二甲酸酯類污染物的水生生物毒理學(xué)研究中,其對(duì)激素水平和生殖系統(tǒng)影響的研究一直占據(jù)著重要地位. Wang等[12]的研究表明,成年稀有鮈鯽在 DEHP暴露21d后,雌魚血液中雌二醇含量顯著下降;而雄性血液中雌二醇含量顯著上升.Golshan等[13]發(fā)現(xiàn)1μg/L的DEHP長期暴露后,雄性金魚的精子質(zhì)量和精子活性均顯著下降,同時(shí)伴隨雄魚體內(nèi)睪丸酮含量下降和類固醇合成基因StAR表達(dá)量下調(diào).除對(duì)水生生物成年個(gè)體的內(nèi)分泌干擾作用外,近些年鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)水生生物早期生命階段的影響也逐漸受到關(guān)注.Jia等[14]的研究發(fā)現(xiàn)DEHP可干擾斑馬魚胚胎甲狀腺,包括影響仔魚體內(nèi)甲狀腺素含量及甲狀腺相關(guān)基因表達(dá)水平.Wood等[15]檢測了 DEHP對(duì)黑頭呆魚的 DNA甲基化作用,研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境濃度下的DEHP暴露14d后,黑頭呆魚仔魚體內(nèi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量未見明顯異常,也未發(fā)現(xiàn)DNA甲基化.

斑馬魚胚胎具備量大易得、體外發(fā)育、透明、發(fā)育周期短等特點(diǎn),可以全程、完整觀察和研究其內(nèi)部所有器官和結(jié)構(gòu)的變化,目前被廣泛用于污染物的毒性評(píng)價(jià)研究中[16].另外胚胎毒性試驗(yàn)還可以避免殺死動(dòng)物或解剖動(dòng)物,這符合環(huán)境毒理學(xué)為保護(hù)動(dòng)物權(quán)利而尋求替代的毒性試驗(yàn)材料發(fā)展方向[17].本試驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)觀察,研究兩種鄰苯二甲酸酯類污染物DEHP和DBP對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育影響,同時(shí)利用酶聯(lián)免疫方法檢測DEHP和DBP暴露后,斑馬魚胚胎中兩種發(fā)育相關(guān)蛋白和雌激素及甲狀腺素水平的變化情況,進(jìn)而揭示鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)水生生物早期生命階段的影響和危害.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)條件

斑馬魚親魚,體長 3.50～4.50cm,體重 0.30～0.60g,按照本試驗(yàn)組已報(bào)道的方法[18]在實(shí)驗(yàn)室條件下長期馴養(yǎng). 斑馬魚胚胎由試驗(yàn)室親魚產(chǎn)卵獲得,斑馬魚親魚繁殖過程和胚胎收集過程均按照本試驗(yàn)組已發(fā)表論文中的方法進(jìn)行[19].

1.2 藥品與試劑

99.5 %鄰苯二甲酸二辛酯(CAS: 117-81-7)和 99%鄰苯二甲酸二丁酯(CAS: 84-74-2)均購自 Sigma-Aldrich公司.用分析純丙酮配置鄰苯二甲酸酯儲(chǔ)存溶液,儲(chǔ)存液進(jìn)一步用重組水稀釋至指定濃度作為暴露介質(zhì).重組水配置方法參考OECD的推薦方法[20],配好的重組水中含分別含有2mmol/L Ca2+、0.5mmol/L Mg2+、0.75mmol/LNa+和0.074mmol/L K+.

1.3 暴露試驗(yàn)

1.3.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測暴露試驗(yàn) 參照 OECD試驗(yàn)指導(dǎo)和 Fraysse et al. (2006)的方法進(jìn)行試驗(yàn)

[20-21],將斑馬魚胚胎暴露在10, 50, 500μg/L濃度的DEHP和DBP溶液中(實(shí)驗(yàn)用水均為重組水).設(shè)助劑對(duì)照(丙酮含量為0.01mL/L)和重組水空白對(duì)照.分別把受精卵轉(zhuǎn)移到 24孔板中,每板使用20個(gè)孔,每孔含有2mL試驗(yàn)藥液和1枚受精卵,一張板為一個(gè)重復(fù),對(duì)照和各暴露組均設(shè)置三個(gè)重復(fù).保證在胚胎發(fā)育囊胚期階段(產(chǎn)卵受精后 2h)開始前完成暴露.把孔板蓋好放在人工氣候箱中培養(yǎng),27～28℃,光照:黑暗=14h:10h.按照Nagel提出的致死終點(diǎn)(卵凝結(jié)、發(fā)育停滯、心跳停止)記錄胚胎的死亡情況[22].暴露持續(xù) 96h,其間每24h更換3/4藥液以保持穩(wěn)定的測試物濃度和潔凈的水質(zhì).

1.3.2 蛋白和激素水平檢測暴露試驗(yàn) 將斑馬魚胚胎暴露于50和500μg/L濃度的DEHP和DBP溶液中,以1L燒杯為暴露容器,每個(gè)燒杯中呈有暴露溶液500mL和胚胎100顆,作為一個(gè)重復(fù),每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù).暴露持續(xù)96h,其間每24h更換3/4藥液以保持穩(wěn)定的測試物濃度和潔凈的水質(zhì).

1.4 胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測

參考Nagel提出的毒理指標(biāo),用倒置顯微鏡觀察其致死效應(yīng)、亞致死效應(yīng)和致畸效應(yīng).其中亞致死效應(yīng)的檢測包括:(1)每天觀察所有胚胎的發(fā)育情況,記錄發(fā)育異常和畸形的個(gè)體; (2)24hpf (hours post fertilization,受精后小時(shí)數(shù))時(shí),從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取 5粒有活性的胚胎,在倒置顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)(明顯的全身性扭動(dòng))情況,記錄 20S內(nèi)自主運(yùn)動(dòng)的次數(shù).(3)分別在48、72hpf時(shí),在倒置顯微鏡下觀察斑馬魚心跳情況,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取 5?；钆咛?記錄20S內(nèi)心跳次數(shù).

1.5 激素含量檢測

1.5.1 樣品收集與前處理 在 96hpf暴露結(jié)束后,用吸管從每個(gè)重復(fù)中移取40個(gè)胚胎到1.5mL EP管(即eppendorf 離心管)中,小心吸出藥液后,用蒸餾水輕柔沖洗胚胎3次,然后將蒸餾水吸出,置于冰上放置,待所有樣品收集完畢后,統(tǒng)一儲(chǔ)存于-20℃冰箱中,等待下一步檢測.

1.5.2 ELISA檢測 將樣品置于冰水混合物中解凍后,向胚胎樣品中加入適量生理鹽水后勻漿,3000r/min離心10min后,取上清液待測.

賴氨酰氧化酶(LOX)、心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)的檢測均使用商品化試劑盒(北京冬歌生物科技有限公司)進(jìn)行,操作過程及每種激素濃度的計(jì)算方法參照試劑盒說明書完成.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.采用One-Way ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析,以 Dunnett post hoc方法完成顯著性比較; P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果

2.1 溶劑效應(yīng)

顯著性分析結(jié)果表明,溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組中試驗(yàn)涉及的所有指標(biāo)的檢測結(jié)果之間不存在顯著差異(數(shù)據(jù)未給出).在本文中出現(xiàn)的對(duì)照組(control)數(shù)據(jù)均來自于溶劑對(duì)照.

2.2 PAEs對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

圖1 DEHP和DBP對(duì)斑馬魚胚胎24hpf自主運(yùn)動(dòng)的影響Fig.1 The effect of DEHP and DBP on spontaneous movements of zebrafish embryos

2.2.1 PAEs對(duì)斑馬魚胚胎24hpf自主運(yùn)動(dòng)的影響 斑馬魚胚胎發(fā)育到 24hpf時(shí),會(huì)出現(xiàn)有規(guī)律的自主運(yùn)動(dòng).DEHP和DBP在試驗(yàn)濃度下均對(duì)斑馬魚胚胎的 24hpf自主運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了較明顯的抑制作用,其中 DEHP的抑制作用更強(qiáng).由圖 1可知,DEHP對(duì)斑馬魚胚胎 24hpf自主運(yùn)動(dòng)的抑制作用呈現(xiàn)出濃度梯度效應(yīng),隨暴露濃度升高,抑制作用逐漸加強(qiáng).DBP僅在50μg/L濃度時(shí),可顯著抑制斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng).

2.2.2 PAEs對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響 由圖2可知,DEHP和DBP在試驗(yàn)濃度下對(duì)斑馬魚胚胎心率有明顯的抑制作用,且抑制作用隨暴露濃度的升高和暴露時(shí)間的延長而增強(qiáng).在 72hpf時(shí), DEHP-500μg/L和DBP-500μg/L組,胚胎20s心跳次數(shù)分別為對(duì)照組的75%的79%.

圖2 DEHP和DBP對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響Fig.2 The effect of DEHP and DBP on heart rate of zebrafish embyos

圖3 DEHP和DBP的致畸作用Fig.3 The teratogenic effects of DEHP and DBP

2.2.3 PAEs對(duì)斑馬魚的致畸作用 DEHP和DBP暴露后,斑馬魚胚胎出現(xiàn)多種畸形癥狀,主要包括心包水腫(圖 3A2)、脊柱彎曲(圖 3A4).而對(duì)照組胚胎未觀測到這些畸形癥狀.其中,最明顯的畸形是脊柱彎曲.在96hpf,當(dāng)DEHP和DBP的暴露濃度達(dá)到 50μg/L時(shí)可引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)脊柱彎曲,畸形率分別為為7%和9%.隨著暴露濃度的增加,胚胎的畸形率進(jìn)一步升高,500μg/L的DEHP和 DBP引起的脊柱彎曲率分別為 13% (P＜0.01)和18%(P＜0.01)(圖3B1).心包水腫的出現(xiàn)率相對(duì)較低,500μg/L的DEHP和DBP誘導(dǎo)的心包水腫率分別為7%和13%(P＜0.01)(圖3B2).

2.3 PAEs對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育相關(guān)蛋白含量的影響

由圖4A可知,DEHP和DBP均能明顯抑制斑馬魚胚胎Nkx2.5蛋白含量,DEHP-500 μg/L和DBP-500μg/L暴露組中的Nkx2.5含量分別為對(duì)照組的73%和61%.

圖4 DEHP和DBP暴露后,斑馬魚胚胎中Nkx2.5(A)和LOX(B)蛋白含量Fig.4 The protein level of Nkx2.5 and LOX in zebrafish embryos after DEHP and DBP exposure

DEHP和DBP均能促進(jìn)斑馬魚胚胎中LOX含量(圖4B).50和500μg/L的DEHP暴露后,斑馬魚胚胎中 LOX含量分別為對(duì)照組的 1.3倍 (P＜0.01)和1.2倍(P＜0.05).500μg/L的DBP可顯著誘導(dǎo)LOX水平,蛋白含量約為對(duì)照組的1.2倍(P＜0.05),而50μg/L的DBP對(duì)斑馬魚胚胎LOX含量無明顯影響.

2.4 PAEs對(duì)斑馬魚胚胎甲狀腺素含量的影響

由圖5可知, T3含量在DEHP和DBP暴露后顯著上升,DEHP-500μg/L組和 DBP-500μg/L組中T3含量分別為對(duì)照組的 1.4倍(P＜0.01)和1.6倍(P＜0.01).T4含量在暴露后變化趨勢與 T3的趨勢接近,500μg/L的 DEHP和 DBP暴露后,斑馬魚胚胎 T4含量明顯升高,分別為對(duì)照組含量的1.6倍(P＜0.01)和1.5倍(P＜0.01).

圖5 DEHP和DBP暴露后,斑馬魚胚胎中甲狀腺素含量Fig.5 The level of T3and T4in zebrafish embryos after DEHP and DBP exposure

3 討論

由于鄰苯二甲酸酯類污染物在水環(huán)境中分布廣泛,其對(duì)水生生物早期發(fā)育的影響時(shí)有報(bào)道.Shen等(2011)[23]研究發(fā)現(xiàn),DBP及其主要代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)可顯著影響非洲爪蟾(Xenopus laevis)的生長發(fā)育,包括體長生長抑制和眼間距離變短等,LOEC值為 15mg/L. Gardner等(2016)[24]比較了三種鄰苯二甲酸酯類污染物(DBP,DEP和DnPP)對(duì)非洲爪蟾胚胎的致死能力和致畸能力,發(fā)現(xiàn)三種污染物中,DBP毒性最強(qiáng),致死和致畸的 LOEC分別為 14.7和8.3mg/L,DEP毒性最弱,致死和致畸的LOEC分別為50.3和41.7mg/L.而根據(jù)本研究結(jié)果, DBP對(duì)斑馬魚胚胎的致畸 LOEC僅為 500μg/L,說明斑馬魚對(duì) DBP的敏感性遠(yuǎn)高于非洲爪蟾.Wood等[25]檢測了 DEHP對(duì)黑頭呆魚(Pimephales promelas)的發(fā)育影響,其研究結(jié)果表明 0.1～100μg/L的DEHP暴露14d,對(duì)黑頭呆魚的發(fā)育無明顯影響.而在本研究中,10μg/L的DEHP即可顯著抑制斑馬魚胚胎的心率,50μg/L的DEHP還能干擾胚胎的 24hpf自主運(yùn)動(dòng).而本研究的暴露時(shí)間比Wood等[26]的周期更短,由此推斷斑馬魚對(duì)DEHP的敏感性可能高于黑頭呆魚.Chikae等的研究發(fā)現(xiàn),0.01～10μg/L的 DEHP暴露后,青鳉魚(Oryzias latipes)胚胎的死亡率顯著升高,且體長生長較對(duì)照組明顯被抑制.古皮魚(Poecilia reticulata)長期(91d)暴露于 1μg/L 和 10μg/L DEHP后,出現(xiàn)了多種發(fā)育異常,包括體長生長抑制和體重抑制等,其中10μg/L DEHP還能顯著引起古皮魚死亡[27].上述研究中DEHP對(duì)魚類發(fā)育影響的 LOEC值低于本研究結(jié)果(10μg/L),一方面可能由于暴露周期較長;另一方面可能因?yàn)榍圜汈~和古皮魚的敏感性比斑馬魚更高.

近年來,多個(gè)研究對(duì)DEHP和DBP對(duì)水生生物的毒性進(jìn)行了比較.Zhao等[28]的研究發(fā)現(xiàn)DBP對(duì)鯉魚(Cyprinus carpio)的毒性比DEHP更強(qiáng),它們對(duì)鯉魚的 96h-LC50值分別為 16.30and 37.95mg/L.相反,Huang等[29]以大型溞(Daphnia magna)為模型開展的急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) DEHP的毒性高于DBP,它們對(duì)大型溞的24h-EC50值分別為 2.1和 8.0mg/L.在本研究中,相同濃度暴露后,DBP引起斑馬魚胚胎的畸形率高于DEHP,說明DBP對(duì)斑馬魚胚胎的致畸能力強(qiáng)于DEHP;而胚胎發(fā)育指標(biāo)結(jié)果表明 DEHP對(duì)斑馬魚心率和24hpf自主運(yùn)動(dòng)的影響比DBP更強(qiáng),因此根據(jù)本研究結(jié)果難以判斷DEHP和DBP對(duì)斑馬魚胚胎的毒性順序.

脊柱彎曲是DEHP和DBP暴露后斑馬魚胚胎出現(xiàn)的最明顯的畸形效應(yīng),多種污染物已經(jīng)被證實(shí)能夠引起水生生物出現(xiàn)脊柱彎曲的癥狀.造成脊柱彎曲的可能原因之一是賴胺酰氧化酶(LOX)的活性被抑制,Zhou等[30]和 van Boxtel等[31]先后證明了殺螟丹和二硫代胺類農(nóng)藥引起水生生物脊柱畸形的機(jī)制在于對(duì)賴胺酰氧化酶的抑制作用.而在本研究中,DEHP和DBP對(duì)賴胺酰氧化酶蛋白含量表現(xiàn)為促進(jìn)作用(圖3),由此推斷鄰苯二甲酸酯類污染物引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)脊柱彎曲的原理可能與上述兩類農(nóng)藥不同.

心包水腫是斑馬魚胚胎發(fā)育階段最典型的畸形癥狀之一.多種污染物都被證明能夠誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)此類畸形,但不同類別的化合物引起心包水腫的機(jī)制存在差異.已有研究證明視黃酸缺乏是引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫的原因之一[32],Mu等[33]的研究發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑處理后的斑馬魚胚胎出現(xiàn)明顯心包水腫,同時(shí)伴隨視黃酸代謝基因 CYP26A1表達(dá)顯著上調(diào),由此作者推斷苯醚甲環(huán)唑引起的斑馬魚心包水腫可能與CYP26A1上調(diào)引起的視黃酸缺乏有關(guān)[33].而本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)0.60mg/L的嘧菌酯可顯著誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫,結(jié)合嘧菌酯的殺菌機(jī)理(阻礙線粒體呼吸電子傳遞進(jìn)而抑制ATP合成),推斷其引起的心臟功能異常是由于嘧菌酯抑制線粒體呼吸,進(jìn)而引起能量供應(yīng)不足導(dǎo)致的[34].而在本研究中,DBP和DEHP在達(dá)到一定濃度時(shí)均可引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫.為研究DEHP和DBP導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)心包水腫的機(jī)制,進(jìn)一步檢測了兩種鄰苯二甲酸酯類污染物暴露后,與胚胎心臟發(fā)育相關(guān)的蛋白Nkx2.5的表達(dá)變化情況.Nkx2.5是調(diào)節(jié)胚胎心臟發(fā)育的重要蛋白,參與了心臟的形成及心肌生長等過程.已有研究證實(shí)Nkx2.5的突變可導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)異常,室間隔缺損(VSD)和心房間隔缺損(ASD)等先天性心臟疾病[35].Jamali等通過P19細(xì)胞體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在抑制Nkx2.5活性后,P19細(xì)胞的心肌生長同時(shí)被阻遏,由此證明Nkx2.5的活性在心肌發(fā)育過程中是必不可少的[36].本研究中,斑馬魚胚胎Nkx2.5蛋白含量在DEHP和DBP暴露后,較對(duì)照組明顯下降,尤其是 DBP-500 μg/L組中的Nkx2.5含量僅為對(duì)照組的 61%.由此推斷,DBP和 DEHP引起的心率異常和心包水腫,可能與Nkx2.5含量的下降有關(guān).Zhang等(2012)的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的芘可引起斑馬魚胚胎心臟出現(xiàn)一系列異常,包括心率異常、心包水腫和心臟循環(huán)缺陷等,同時(shí)伴隨Nkx2.5蛋白的編碼基因表達(dá)顯著下調(diào),這一結(jié)果與本研究的結(jié)果相符[37].

內(nèi)分泌干擾效應(yīng)一直是鄰苯二甲酸酯類污染物生態(tài)毒理學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容,近十年來,大量研究關(guān)注于 PAEs對(duì)魚類激素水平的影響.Wang等檢測了環(huán)境相關(guān)濃度下的DEHP長期暴露對(duì)成年稀有鮈鯽的內(nèi)分泌干擾作用,發(fā)現(xiàn)39.4μg/L及更高濃度的DEHP暴露后,雄魚血液中 17β-雌二醇含量顯著上升,同時(shí)雌魚血液中 17β-雌二醇明顯下調(diào)12.除性腺外,甲狀腺是鄰苯二甲酸酯類污染物在生物體內(nèi)的另一重要靶標(biāo).Ye等[38]的研究表明,DEHP可抑制大鼠血液中的 T3、T4和促甲狀腺激素釋放激素含量.Dong等[39]同樣發(fā)現(xiàn)DEHP暴露可以抑制大鼠血液中甲狀腺素含量,并能干擾多個(gè)調(diào)節(jié)甲狀腺素的基因表達(dá).Park等(2017)[40]通過對(duì)6000名韓國成人的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)成人血液中的T3和T4含量與其尿液中的鄰苯二甲酸酯類代謝產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)性.上述結(jié)果均表明,鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)哺乳動(dòng)物血液中的甲狀腺素具有抑制作用.而根據(jù)本研究的結(jié)果,500 μg/L 的DEHP和DBP能夠顯著促進(jìn)斑馬魚胚胎中的T3和T4含量,這一結(jié)果與哺乳動(dòng)物研究結(jié)果趨勢相反.Jia等[14]的研究發(fā)現(xiàn)400μg/L的DEHP暴露168小時(shí)后,斑馬魚仔魚中T3和T4含量均顯著上升,而低濃度(40～200μg/L)的DEHP對(duì)胚胎中的T3和 T4含量無顯著影響,上述結(jié)果與本研究的結(jié)果呈現(xiàn)出良好的一致性.綜合上述研究結(jié)果可知,鄰苯二甲酸酯類污染物對(duì)不同類生物的甲狀腺素含量的影響可能存在差異.

近年來,關(guān)于DEHP代謝物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)也開始受到關(guān)注.Zhai等[41]的研究發(fā)現(xiàn)DEHP的代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP)能夠顯著影響斑馬魚仔魚中的T3、T4含量,LOEC值為200μg/L,在該濃度下的MEHP暴露后,斑馬魚仔魚中T3含量顯著上升,而T4含量則顯著下降.而根據(jù)本研究和Jia等的研究,DEHP影響斑馬魚胚胎甲狀腺素含量的LOEC值分別為500μg/L和 400μg/L.以上結(jié)果表明,MEHP對(duì)魚類甲狀腺的干擾能力可能比DEHP更強(qiáng).相反,葉婷等比較DEHP和MEHP對(duì)海洋青鳉的內(nèi)分泌干擾作用后,發(fā)現(xiàn)0.1和0.5mg/L的DEHP長期暴露可通過激活肝性激素受體調(diào)控肝雌激素響應(yīng)基因(VTG和Chg)和過氧化物增殖激活受體(PPARα和PPARγ)的表達(dá)而對(duì)海洋青鳉產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng),并且顯示出性別特異性,而MEHP對(duì)海洋青鳉的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)弱于 DEHP[42].綜合上述結(jié)果說明,以不同指標(biāo)評(píng)價(jià)鄰苯二甲酸酯類污染物的內(nèi)分泌干擾能力,可能得到不同的結(jié)論.

除發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾作用外,鄰苯二甲酸酯類污染物還可導(dǎo)致魚類出現(xiàn)氧化應(yīng)激作用和免疫反應(yīng).Huang等的研究發(fā)現(xiàn),0.1和 1mg/L的 DEHP暴露后,海洋青鳉(Oryzias melastigma)肝臟中免疫基因IL-1β和CCL20表達(dá)量顯著上調(diào),而 CAT和 GPx基因表達(dá)水平未見明顯變化[43].Xu等[44]發(fā)現(xiàn) 2μmol/L(約為 0.28mg/L)的DBP可導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng),包括巨噬細(xì)胞減少和免疫相關(guān)基因表達(dá)異常.為比較鄰苯二甲酸酯類污染物引起的三種毒性效應(yīng)的敏感性,將以斑馬魚胚胎為模式生物的研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比(表 2),根據(jù)已報(bào)道的 LOEC數(shù)據(jù),在DEHP和DBP暴露后,胚胎發(fā)育指標(biāo)比內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和免疫反應(yīng)指標(biāo)更加敏感.

表2 DEHP和DBP暴露后斑馬魚胚胎中三類毒性指標(biāo)敏感性比較Table 2 Comparison of sensitivity of three categories of indicators towards DEHP and DBP exposure

4 結(jié)論

4.1 試驗(yàn)濃度下(10～500μg/L)DEHP和DBP能誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)心率下降、自主運(yùn)動(dòng)異常、脊柱彎曲和心包水腫等一系列發(fā)育影響,并能顯著抑制心臟發(fā)育相關(guān)蛋白Nkx2.5的含量.

4.2 500μg/L的DEHP和DBP暴露后,斑馬魚胚胎中三碘甲狀腺原氨酸和四碘甲狀腺原氨酸含量顯著上升.表明DEHP和DBP對(duì)斑馬魚胚胎同樣具備內(nèi)分泌干擾作用.

4.3 10μg/L的DEHP和DBP即可對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育造成影響,這一濃度低于兩種污染物在一些水域的檢出濃度,因此DEHP和DBP對(duì)環(huán)境中水生生物的危害急需重視.

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Effects of two phthalate esters on zebrafish embryos.

MU Xi-yan1*, LI Cheng-long2, HUANG Ying1, SHEN Gong-ming1, LI Xu-xing1, LEI Yun-lei1, HUANG Lan2, PANG Sen2, LI Ying-ren1, LI Xue-feng2, WANG Cheng-ju2*(1.Fishery Resource and Environment Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China；2.College of Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193). China Environmental Science, 2017,37(9)：3566～3575

The effects of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and dibutyl phthalate (DBP) on morphological indicators during zebrafish embryonic development were investigated in this study. In addition, the protein level of Nkx2.5 and LOX (two proteins that are associated with embryonic development) as well as the thyroid hormone level (triiodothyronine (T3) and tetraiodothyronine (T4)) were detected after DEHP and DBP exposure. The results indicated that the exposure of tested concentrations (10～500μg/L) of DEHP and DBP could induce a suite of abnormities on zebrafish embryos, including abnormal spontaneous movement, heart rate decrease, pericardial edema and spinal curvature, which occurred along with the decrease of Nkx2.5level. ELISA assay results showed that the level of T3 and T4 significantly increased after exposure of 500 μg/L DEHP and DBP, which indicated that PAEs have endocrine disrupting effects on fish during early life stage. Furthermore, the LOEC of DEHP and DBP towards zebrafish embryos was 10μg/L, which was close to their detected concentrations in environmental water areas. Thus their potential risk on environmental aquatic organisms during early life stages should be concerned.

DEHP；DBP；zebrafish embryo；developmental toxicity；hormone level

X171.5

A

1000-6923(2017)09-3566-10

2017-02-10

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2016C008);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2017HY-ZD0201)

* 責(zé)任作者, 博士, muxiyan@cafs.ac.cn;wangchengju@cau.edu.cn

穆希巖(1987-),男,博士,北京人,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心助理研究員.主要研究方向?yàn)闈O業(yè)污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究.發(fā)表論文20余篇.