破壁靈芝孢子粉對(duì)ConA誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度的影響

趙燕平馮彩珠付昌隆華海燕

破壁靈芝孢子粉對(duì)ConA誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度的影響

趙燕平1馮彩珠2付昌隆2華海燕3

目的探討破壁靈芝孢子粉對(duì)ConA誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型小鼠血清谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平及肝組織炎癥程度的影響。方法雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分成正常組10只，模型組、低劑量破壁靈芝孢子粉組（低靈組）、高劑量破壁靈芝孢子粉組（高靈組），各12只。除正常組外，其余各組用ConA 5mg/kg尾靜脈注射，隔天1次，共2周，建立免疫性肝損傷小鼠模型。正常組和模型組小鼠分別用等容量生理鹽水灌胃，低靈組及高靈組小鼠分別給予破壁靈芝孢子粉1.0g/kg、2.0g/kg灌胃。4周后檢測(cè)各組小鼠血清ALT、AST水平及觀察肝組織炎癥程度。結(jié)果低靈組、高靈組小鼠血清ALT、AST水平明顯低于模型組[ALT：（129.62±44.65）U/L、（92.76±33.78）U/L比（201.78±62.47）U/L，P＜0.05；AST：（134.38±42.67）U/L、（101.76±34.56）U/L比（223.63±77.31）U/L，P＜0.05]；高靈組小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度明顯低于低靈組（P＜0.05）；低靈組及高靈組小鼠肝細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度比模型組明顯減輕（P＜0.05）；結(jié)論破壁靈芝孢子粉能改善ConA誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度。

小鼠；ConA；免疫損傷；破壁靈芝孢子粉；ALT；AST；肝組織炎癥

KEY WORDSmice;ConA;immune injury;broken Ganoderma lucidum spore powder;ALT;AST;inflammation of liver tissue

隨著慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病中免疫反應(yīng)機(jī)制的研究深入，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為機(jī)體的免疫功能低下，尤其是細(xì)胞免疫功能低下，是導(dǎo)致乙型肝炎病毒（HBV）感染后發(fā)病及病情向慢性化轉(zhuǎn)歸的重要因素，只有使機(jī)體產(chǎn)生有效的抗病毒免疫應(yīng)答，才能真正達(dá)到臨床完全控制病毒復(fù)制甚至清除病毒的目的[1-2]。現(xiàn)有的抗病毒藥物難以達(dá)到理想的抗病毒療效，因此尋找一種安全有效的免疫調(diào)節(jié)劑成為慢乙肝臨床治愈的突破口。ConA是誘導(dǎo)免疫性肝損傷的經(jīng)典試劑，其作用機(jī)制與T細(xì)胞和KC細(xì)胞相關(guān)，與人類慢性肝炎發(fā)病機(jī)制非常相似[3-4]。破壁靈芝孢子粉是一種珍貴的藥用真菌，具有免疫調(diào)節(jié)及保肝解毒作用。為探討破壁靈芝孢子粉是否對(duì)慢性肝炎存在免疫調(diào)節(jié)作用，本研究采用刀豆蛋白A（ConA）造模，破壁靈芝孢子粉干預(yù)，觀察模型小鼠血清谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平及肝組織炎癥程度變化，以期為慢性乙型病毒性肝炎的破壁靈芝孢子粉治療慢性乙型病毒性肝炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)Balb/c雄性小鼠46只，體質(zhì)量20～30g，6～8周齡，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（瀘）2013-2016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境內(nèi)，使用許可證號(hào)SYXK（浙）2013-0184，環(huán)境溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度50%～65%，飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水。

1.2 藥物和試劑破壁靈芝孢子粉（壽仙谷藥業(yè)公司生產(chǎn)），使用時(shí)用生理鹽水調(diào)配成兩種濃度備用：低劑量組0.1g/mL和高劑量組0.2g/mL；刀豆蛋白A（ConA）購(gòu)自Sigma公司（C2010，批號(hào)80M7680V），使用時(shí)溶于生理鹽水；谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑購(gòu)自德國(guó)DiaSys DiagoticsSystemsGmbH（批號(hào)分別為07235/ 00002244、07218/00001951）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組造模與給藥將46只Balb/c雄性小鼠正常飼養(yǎng)1周后用隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：正常組10只，模型組、低劑量破壁靈芝孢子粉組（低靈組）和高劑量破壁靈芝孢子粉組（高靈組）各12只。正常小鼠正常飼養(yǎng)。模型組及低靈組、高靈組小鼠給予ConA 5mg/kg尾靜脈注射，隔天1次，共2周。造模成功后，正常組及模型組予生理鹽水0.1mL/10g灌胃，低靈組和高靈組分別用破壁靈芝孢子粉以1.0g/kg及2.0g/ kg灌胃，共4周。

2.2 血清ALT、AST檢測(cè)4周后摘除小鼠眼球取血，檢測(cè)ALT、AST水平，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成。

2.3 肝組織病理學(xué)檢查取小鼠肝組織經(jīng)固定、包埋、切片、染色后鏡檢，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心病理室及解放軍117醫(yī)院病理科協(xié)助完成。肝組織炎癥活動(dòng)度積分標(biāo)準(zhǔn)按王泰齡等方案[5]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以（） 表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 破壁靈芝孢子粉對(duì)小鼠血清ALT、AST水平的影響實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于灌胃操作失誤，導(dǎo)致高靈組死亡2只，低靈組死亡1只。破壁靈芝孢子粉干預(yù)后，高、低靈組小鼠ALT、AST水平較模型組明顯降低，高靈組較低靈組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。提示破壁靈芝孢子粉可以改善ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（U/L，）

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（U/L，）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與低靈組比較，▲P＜0.05；ALT：谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST：門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶

組別正常組模型組高靈組低靈組鼠數(shù)10 12 10 11 ALT 67.45±23.46 201.78±62.47* 92.76±33.78△▲129.62±44.65△AST 86.45±28.76 223.63±77.31* 101.76±34.56△▲134.38±42.67△

3.2 破壁靈芝孢子粉對(duì)小鼠肝組織炎癥程度的影響光鏡下觀察顯示，正常組小鼠肝小葉清晰,肝索呈放射狀排列，規(guī)則有序，肝竇未見(jiàn)異常；模型組小鼠肝組織均出現(xiàn)明顯病變，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞普遍變性，混濁腫脹，胞漿疏松，部分呈氣球樣變，可見(jiàn)明顯的點(diǎn)、灶狀壞死，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞炎性浸潤(rùn)尤為明顯；低靈組及高靈組小鼠在肝細(xì)胞變性及壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕（P＜0.05）；高靈組小鼠肝細(xì)胞變性及壞死較低靈組明顯減輕（P＜0.05）。見(jiàn)表2、插頁(yè)圖1～4。

表2 各組小鼠肝組織炎癥程度比較（）

表2 各組小鼠肝組織炎癥程度比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與低靈組比較，▲P＜0.05

組別正常組模型組高靈組低靈組鼠數(shù)10 12 10 11肝細(xì)胞壞死肝細(xì)胞變性炎細(xì)胞浸潤(rùn)-++-++-++ 101010 0 1 0 + 0 0 6 5 0 4 3 4 +++ 0 8* +++ 0 9* +++ 0 7* 0△▲2△0 3 2 + 0 0 6 3 0 3 1 6 0△▲0△0 0 0 + 0 0 4 5 0 5 6 6 0△0△

4 討論

機(jī)體感染HBV后引起細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，并激發(fā)自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，導(dǎo)致機(jī)體特異性免疫功能損傷，無(wú)法控制病毒復(fù)制和清除，致使HBV感染慢性化甚至進(jìn)展為肝硬化、肝癌。只有使機(jī)體產(chǎn)生了有效的抗病毒免疫應(yīng)答，才能真正達(dá)到臨床完全控制病毒復(fù)制甚至清除病毒的目的，但是現(xiàn)有的抗病毒藥物未能達(dá)到理想的抗病毒療效。目前，臨床上應(yīng)用較多的慢性乙型病毒性肝炎免疫調(diào)節(jié)劑主要有胸腺肽、治療性乙肝疫苗、重組細(xì)胞因子等[6-7]，以上免疫調(diào)節(jié)治療療效肯定，但價(jià)格昂貴、注射不便導(dǎo)致依從性差，且很多免疫細(xì)胞因子治療局限在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或小樣本臨床研究，目前難以普及。

靈芝，又稱“仙草”，是一種珍貴的藥用真菌。靈芝孢子是靈芝生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)的淡霧狀的極其微小的孢子，孢子內(nèi)含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成分物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、保肝解毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗病毒等許多藥理作用[8]。諸多研究[9-10]提示，破壁靈芝孢子粉可調(diào)節(jié)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，并能有效增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性和單核—巨噬細(xì)胞吞噬功能，且效果較未破壁靈芝孢子粉好。

刀豆蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的肝損傷是模擬與免疫相關(guān)肝病研究T細(xì)胞依賴的最好模型之一,其特點(diǎn)是白細(xì)胞分化抗原4（CD4+）T細(xì)胞增多所介導(dǎo)，與慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病的免疫反應(yīng)機(jī)制相似。我們以ConA誘導(dǎo)小鼠為模型，觀察破壁靈芝孢子粉干預(yù)后的血清ALT、AST及肝組織炎癥程度的變化，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)后小鼠血清ALT、AST水平較模型組明顯降低，且高劑量組護(hù)肝效果優(yōu)于低劑量組，藥物干預(yù)后的肝組織內(nèi)炎癥程度也較模型組明顯改善，但高、低靈組之間炎癥改善差別不明顯。說(shuō)明破壁靈芝包子粉可以改善ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫損傷，降低血清ALT、AST水平，且護(hù)肝效果隨劑量增大相應(yīng)增強(qiáng)。

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（收稿：2017-04-11 修回：2017-05-14）

Effect of Broken Ganoderma Lucidum Spore Powder on Serum ALT,AST Levels and Liver Inflammation in Mice with ConA-induced Immune Injury

ZHAO Yanping1,FENG Caizhu2,FU Changlong2,HUA Haiyan3.1

Department of Infectious Disease,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China;2 The First College of Clinical Medicine,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Department of Pathology, the 117th Hospital of PLA,Hangzhou(310007),China

ObjectiveTo investigate the effect of broken Ganoderma lucidum spore powder on serum ALT,AST levels and liver inflammation in mice with ConA-induced immune injury.MethodsBalb/c male mice were randomly divided into 4 groups∶normal group（n=10）,model group（n=12）,low dose group（with 1.0g/kg broken Ganoderma lucidum spore powder,n=12）and high dose group（with 2g/kg broken Ganoderma lucidum spore powder,n= 12）.Except normal group,the immune damage model was established by intravenous injection of ConA（5mg/kg）for 2 weeks.Normal group and model group were treated with normal saline.After 4 weeks,the levels of ALT, AST and the degree of liver inflammation were observed.ResultsThe ALT and AST levels of low dose group and high dose group were significantly lower than those of model group（ALT∶129.62±44.65U/L,92.76±33.78U/L vs 201.78±62.4U/L,P＜0.05;AST∶134.38±42.67U/L,101.76±34.56U/L vs 223.63±77.31U/L,P＜0.05）;the levels of ALT,AST and the inflammation of liver tissue in high dose group were lower and milder than those of low dose group（P＜0.05）.The degree of liver cell degeneration，necrosis and inflammation of low dose group and high dose group were significantly milder than those model group（P＜0.05）.ConclusionBroken Ganoderma lucidum spore powder can improve the level of serum ALT,AST and inflammation of liver tissue in mice with ConA-induced immune injury.

book=760,ebook=29

浙江省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.LQ14H90005）

1浙江省中醫(yī)院感染科（杭州310006）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州310053）；3中國(guó)人民解放軍117醫(yī)院病理科（杭州310007）

趙燕平，Tel：15924186653；E-mail：xiaoke_bao_a@163.com