2型糖尿病小鼠心臟缺血—再灌注后GDF11的表達變化

馮建宇 馮建梅 譚延振 馮笑

【摘 要】目的：觀察2型糖尿病小鼠心臟GDF11表達情況及心肌GDF11的表達與糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)系。方法：40只C57BL/6J小鼠隨機分為正常假手術(shù)組（Con+Sham）、正常缺血再灌注組（Con+MIR）、糖尿病假手術(shù)組（DM+Sham）、糖尿病缺血再灌注組（DM+ MIR）。 用高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素建立 2型糖尿病小鼠模型。用結(jié)扎心臟冠狀動脈左前降支 30 min 后再灌注建立心肌 I/R 損傷模型。用 Western blot 法檢測心肌中 GDF11 的表達量。結(jié)果： 與正常對照組相比，糖尿病組心肌組織 GDF11 的表達量明顯下調(diào)均（ P <0.01）；缺血再灌注后正常組和糖尿病組心肌組織 GDF11 的表達量均較缺血前顯著降低（均 P <0.01） ，尤其在糖尿病組下降更顯著（均 P <0.01）。結(jié)論：2型糖尿病小鼠心肌 GDF11 表達水平降低和缺血再灌注后心肌組織 GDF11 的表達量下降，提示GDF11可能與2型糖尿病心肌變化及心臟缺血/再灌注后心功能降低有關(guān)，其機制有待進一步研究。

【關(guān)鍵詞】GDF11；2型糖尿?。蝗毖?再灌注損傷；心肌

糖尿病人群不僅罹患缺血性心臟?。?ischemic heart disease，IHD）的發(fā)病率高于正常人群，且糖尿病心肌對缺血損傷易感性增加，其心臟損傷程度及病死率均會進一步顯著增加[1，2]。生長轉(zhuǎn)化因子11（growth differentiation fact 11，GDF11），也叫骨形態(tài)發(fā)生蛋白11（bone morphogenetic protein 11，BMP11），是TGF-β超家族的一員，最近也被證實在心臟保護中發(fā)揮積極作用。已有研究證實同屬TGF-β超家族成員的GDF-15對缺血或 I/R 引起的心臟損傷具有拮抗作用[3]。然而2型糖尿病心肌變化及心臟缺血/再灌注后心功能降低與GDF11是否相關(guān)尚未有研究報道。本實驗旨在觀察2型糖尿病小鼠心臟GDF11表達情況及心肌GDF11的表達變化與糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料 選擇4周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重14～16g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。抗 GDF11 抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 2型糖尿病小鼠模型的建立及分組 40只小鼠隨機分為A組（正常對照組，n=20）和B組（糖尿病組，n=20），其中A組給予常規(guī)飼料，自由飲水。B組給予高脂飲食（購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，D12451）喂養(yǎng)，自由飲水。小鼠分別給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng)4周，在第4周末，禁食8 h。B組腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ，50mg/kg體重，Sigma公司，溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，pH4.4），A組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。STZ注射的整個操作在冰浴上進行，保證整個注射過程在15 min內(nèi)完成。注射后繼續(xù)各自的飼料喂養(yǎng)4周，在第8周末，小鼠禁食8 h后，用滅菌小剪刀剪尾取血，應(yīng)用血糖儀測定血糖，血糖≥11.1 mmol/L被認為糖尿病模型成功。飼養(yǎng)過程中保證充足的水和食物，并每天更換鼠籠和墊料一次。B組全部造模成功。

小鼠隨機分為4組，每組10只：①正常假手術(shù)組（Con+Sham）；②正常缺血再灌注組（Con+MI/R）；③糖尿病假手術(shù)組（DM+Sham）；○4糖尿病缺血再灌注組（DM+MI/R）。

1.3 小鼠MI/R 模型的建立 麻醉小鼠，手術(shù)暴露心臟，用6-0絲線在小鼠心臟左前降支距根部2～3 mm 處打一活結(jié)，造成心肌缺血，待 30 min 后，打開活結(jié)進行心肌再灌注。

1.4 心功能檢測 每組5只小鼠手術(shù)后 24 h利用 Vevo2100小動物超聲儀（VisualSonics，Toronto，Canada）檢測并計算左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）等心功能的變化，測量5個心動周期，取平均值作為最后檢測數(shù)據(jù)。

1.5 GDF11 表達量檢測 每組5只小鼠手術(shù)后 3 h后迅速凍存樣本。采用 Western blot 法進行檢測，心肌組織用預(yù)冷至 4℃ 的 PBS 清洗后移入預(yù)冷的裂解液中并剪碎。組織勻漿后 12 000 r/min 4℃ 離心 10 min，取上清。BCA 法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液并煮沸后得到上樣樣本，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將蛋白樣品?SDS-PGEA 電泳，用濕電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（ PVDF）上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉 2 h。按照分子量將PVDF 裁切分別和一抗一起孵育，4℃ 過夜；用 TBST 搖床漂洗3次（每次8 min），將膜與對應(yīng)二抗室溫一起孵育 2 h，再次用 TBST 搖床漂洗3次（每次8 min）后，滴加ECL發(fā)光液，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光檢測，并用配套軟件（ImageLab）進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果以x（_）±SE表示，利用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較用LSD-t檢驗，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能的比較 小鼠心肌缺血再灌注 24 h 后超聲心動圖顯示，正常缺血再灌注組（Con+MI/R）與正常假手術(shù)組（Con+Sham）相比、糖尿病缺血再灌注組（DM+ MI/R）與糖尿病假手術(shù)組（DM+Sham）相比， LVEF 與 LVFS 分別顯著下降（均P <0.01）。糖尿病缺血再灌注組（DM+ MI/R）較正常缺血再灌注組（Con+MI/R）心功能明顯下降（P <0.01），提示2型糖尿病加重心肌缺血/再灌注心功能損害。

2.2 各組 GDF11 蛋白表達的比較 Western blot 法檢測結(jié)果顯示，正常缺血再灌注組（Con+MI/R）與正常假手術(shù)組（Con+Sham）相比、糖尿病缺血再灌注組（DM+ MI/R）與糖尿病假手術(shù)組（DM+Sham）相比，GDF11表達顯著下調(diào)（均P <0.01）。糖尿病假手術(shù)組（DM+Sham）與正常假手術(shù)組（Con+Sham）相比、糖尿病缺血再灌注組（DM+ MI/R）與正常缺血再灌注組（Con+MI/R）相比GDF11表達顯著下調(diào)（均P <0.01），提示GDF11可能與2型糖尿病心肌變化及心臟缺血/再灌注后心功能降低有關(guān)。

3 討論

研究表明：2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus， T2DM）患者較非糖尿病患者缺血性心臟病發(fā)病率顯著提高，且糖尿病患者發(fā)生心肌梗死后的病死率更高；合并2型糖尿病時更易誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷（Myocardial Ischemia/Reperfusion， MI/R），糖尿病可導(dǎo)致心肌細胞凋亡增加，并增加其MI/R損傷的敏感性[1，2]。本實驗進一步證實2型糖尿病加重心肌缺血/再灌注心功能損害，與既往研究報道相符合[4，5]。但是，糖尿病患者心肌細胞對缺血性損傷敏感性增加的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍不完全清楚[6]。

已有研究證實GDF11在心臟保護中發(fā)揮積極作用。Lofredo等[5]將年輕小鼠和年老小鼠的脈管系統(tǒng)連接在一起共享血液循環(huán)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年老小鼠的心臟肥大得到了明顯的改善。Loffredo等[7]發(fā)現(xiàn)，小鼠血液中GDF11水平隨衰老會顯著下降，且GDF11的降低與老年性心臟肥大的發(fā)生密切相關(guān)。他們給心臟肥大的老年小鼠連續(xù)腹腔注射GDF11 30天后，老年小鼠的心臟肥大狀況也明顯改善。Loffredo等認為，GDF11通過調(diào)節(jié)FoxO3和smad2/3等信號通路而發(fā)揮心臟保護作用。Olson KA等[8]在2015年發(fā)表的一項928名穩(wěn)定型缺血性心臟病患者參與的研究中發(fā)現(xiàn)患者血漿較高水平的GDF11與其心血管事件和死亡率呈明顯負相關(guān)，提示GDF11可能在缺血心肌損傷及心肌保護中發(fā)揮重要作用。但GDF11是否直接參與心臟缺血再灌注損傷保護尚未有研究報道。

本研究結(jié)果首次表明：與正常小鼠相比，2型糖尿病小鼠心肌GDF11的表達量下調(diào)；I /R 損傷后心肌GDF11 水平顯著降低，糖尿病情況下GDF11 水平下降更明顯。所以，我們認為 GDF11 在2型糖尿病心肌變化中發(fā)揮著重要作用，GDF11可能是引起2型糖尿病患者心肌I/R損傷后心肌損傷加重的關(guān)鍵因素之一，GDF11將可能會成為預(yù)防和治療糖尿病患者缺血性心臟病的潛在治療靶點蛋白。本研究只是提示GDF11在2型糖尿病小鼠心肌I/R損傷中發(fā)揮調(diào)控作用，但對于GDF11如何調(diào)控糖尿病情況下加重心肌I/R損傷的機制，還有待于我們進一步研究。

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