綠豆芽生產(chǎn)過程中微生物的生長、分布及消毒劑處理效果評價

羅 欣

傅 亮

郝天瑤

方良月

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

綠豆芽生產(chǎn)過程中微生物的生長、分布及消毒劑處理效果評價

羅 欣

傅 亮

郝天瑤

方良月

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

研究綠豆芽生產(chǎn)過程中微生物的生長情況及種類分布，采用2種不同類型的消毒劑進(jìn)行處理及效果評價，并用16S rRNA方法對豆芽中主要微生物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，成品綠豆芽中的微生物總量為5.8×107CFU/g，微生物的種類主要為克雷伯氏菌(Klebsiella)、不動桿菌(Acinetobacter)、腸桿菌(Enterobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等。有效氯濃度1 000～3 000 mg/L的NaClO處理芽菜30 min，菌落總數(shù)分別降至1.2×107～1.0×105CFU/g，而直接處理單獨(dú)培養(yǎng)的模型對照組則平均降至2.3×104～1.0×103CFU/mL。25 mg/L AgNO3可使菌落總數(shù)降至3.8×105CFU/g，消毒效果同樣差于模型對照組。掃描電子顯微鏡觀察分析芽菜表面微生物可形成明顯可見的生物膜，顯著強(qiáng)化了細(xì)菌對消毒劑的耐受力。

綠豆芽；微生物；菌種鑒定；消毒劑；生物膜

綠豆芽在中國芽菜消費(fèi)中占比最大，口感好，營養(yǎng)豐富[1]。芽菜以鮮活的形式上市，極富脆性，含有豐富的VC，是人們生活中不可缺少的食品原料。近年來，中國芽菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，從作坊式發(fā)豆芽方式逐步轉(zhuǎn)為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，出現(xiàn)了大量日產(chǎn)50～100 t的芽菜工廠。但目前，在中國的果蔬生產(chǎn)中，由于采摘不當(dāng)，貯藏不善，運(yùn)輸不及時或生理病害及微生物污染的影響，往往導(dǎo)致20%～30%的損耗[2-3]。規(guī)?；a(chǎn)后芽菜產(chǎn)業(yè)遇到了三大技術(shù)問題：① 芽菜生產(chǎn)多采用淋水保溫(20～25 ℃)發(fā)芽方式，生產(chǎn)過程中極易出現(xiàn)團(tuán)狀、窩狀式爛菜或大面積爛根問題，嚴(yán)重影響芽菜品質(zhì)與產(chǎn)量；② 芽菜的保鮮期極短，常溫下只有1～2 d，在低溫冷藏條件下也只有3～5 d，嚴(yán)重制約了芽菜產(chǎn)能和銷售半徑，極大影響了企業(yè)效益；③ 有關(guān)芽菜的安全性問題頻發(fā)[4]。2000年，美國爆發(fā)了由沙門氏菌污染的綠豆芽而引發(fā)的食源性疾病[5]；2011年，德國爆發(fā)了腸出血性大腸桿菌污染芽菜事件，近30人死亡[6]。由于豆種含有天然內(nèi)生菌，生產(chǎn)過程中進(jìn)行保溫淋水，生產(chǎn)周期長達(dá)4～7 d，芽菜本身也易受到機(jī)械性損傷導(dǎo)致汁液流出，這些條件都為微生物的生長及繁殖創(chuàng)造了良好條件?？梢哉f，芽菜生產(chǎn)過程中的微生物問題直接影響了芽菜規(guī)?；a(chǎn)后的質(zhì)量及安全。因此，分析芽菜生產(chǎn)過程中微生物的生長、分布規(guī)律及對消毒效果進(jìn)行評價成為解決上述3個技術(shù)問題的基礎(chǔ)。

孔凡春等[7]利用臭氧控制微生物的生長以延長果蔬的貨架期，但過度使用會導(dǎo)致脫色和風(fēng)味變化。H.H.Jin等[8]研究了用ClO2和氣調(diào)包裝聯(lián)合使用的方法殺滅綠豆芽中沙門氏菌和李斯特菌的效果，可降低原豆芽菜中的微生物數(shù)量，但會影響芽菜的質(zhì)量和口感。M.L.Bari等[9]采用細(xì)菌素聯(lián)合植酸檸檬酸等使用，以減少鮮切果蔬中李斯特菌數(shù)量。更有J.X.Ye等[10]使用噬菌體抑制苜蓿菜中沙門氏菌的生長及M.L.Bari等[11]研究了在低溫條件下運(yùn)用物理輻射的方法殺滅豆芽菜中李斯特菌。上述研究雖有一定的抑菌效果，但未從根本上認(rèn)識芽菜與微生物之間的關(guān)系。

NaClO是鮮切果蔬和自來水消毒中常用的消毒劑[12]，對微生物有很好的殺滅效果，按規(guī)定量使用具有安全高效的特點(diǎn)。另外，Ag+是一種無機(jī)消毒劑[13]，廣泛用于水和其它領(lǐng)域。在美國、加拿大等地被認(rèn)為是一種安全的消毒劑，其作用機(jī)理是Ag+與微生物中巰基結(jié)合，使某些酶失活，從而達(dá)到殺菌或抑菌作用，當(dāng)菌體被殺滅后Ag+又被釋放出來，保持持續(xù)的消毒作用[14]。根據(jù)美國FDA 21 CFR 172.167條規(guī)定允許AgNO3在瓶裝水中使用，并作為抗菌劑來防止水中微生物的污染；趙清鳳等[13]采用AgNO3研究了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌作用及機(jī)制，取得了一定的抗菌效果。

本研究擬討論綠豆芽發(fā)芽過程中的微生物生長規(guī)律、種類的分布，初步探討2種常見的消毒劑對芽菜消毒除菌的效果，并分析芽菜中微生物難以有效清除的原因，旨在為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、安全和保鮮期更長的產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆：市售；

平板計數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、營養(yǎng)肉湯等培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

電子天平：HR-120型，上海精密儀器廠；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HN-403型，上海邦西儀器科技有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1BU型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

蒸汽滅菌鍋：YQX-SG46-280S型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；

PCR儀：VERITI 2.0型，美國AB公司；

電泳儀：HE99型，美國通用電氣公司；

凝膠成像系統(tǒng)：BOX EF型，美國基因有限公司；

豆芽機(jī)：DYJ-A01型，中山榮威電器廠；

掃描電子顯微鏡(SEM)：TM3030型，日本日立有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆芽生長過程中菌落總數(shù)的測定 稱取健康飽滿的綠豆60 g，無菌水沖洗數(shù)次，除去表面灰塵、雜質(zhì)。豆芽機(jī)用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精洗滌，臭氧柜內(nèi)消毒3 h后無菌水洗凈。綠豆放入豆芽機(jī)發(fā)芽，每隔8 h更換無菌水。根據(jù)不同發(fā)芽時間取樣，按GB 4789.2—2010測定菌落總數(shù)。

1.2.2 綠豆芽中細(xì)菌分離與鑒定

(1) 細(xì)菌分離：取成熟完整的綠豆20 g，以有效氯濃度為3 000 mg/L的NaClO溶液浸泡豆種30 min，取出后用無菌水清洗3～5次后發(fā)芽，發(fā)芽4 d后用PCA平板培養(yǎng)基進(jìn)行濃度梯度培養(yǎng)。選取菌落形態(tài)不同、菌落獨(dú)立清晰、出現(xiàn)頻率最高的10種菌進(jìn)行單獨(dú)純化培養(yǎng)，純化10次，得到菌種分別編號M1～M10。

(2) DNA提取：采用DNA提取試劑盒分別提取10種菌的DNA。

(3) 16S rRNA的PCR擴(kuò)增：將提取的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，體系見表1。擴(kuò)增引物為通用引物27F和1495R。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

表1 PCR擴(kuò)增體系

(4) PCR電泳檢測：吸取4 μL PCR產(chǎn)物與1 μL DNA Loading Buffer混勻，在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，100 V電泳45 min[16]。結(jié)束后EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

送至廣州生工生物工程公司測序。測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，與已知序列進(jìn)行Blast比較，采用Neighbour-joining法用Mega 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。確定與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的種屬。

1.2.3 不同消毒劑常規(guī)處理新鮮綠豆芽

(1) 配制有效氯濃度為1 000，2 000，3 000 mg/L的NaClO 溶液，稱取3份20 g的綠豆芽分別浸入不同濃度的NaClO溶液中，浸泡30 min。有效氯濃度以GB 19106—2013中碘量法確定。用無菌去離子水洗凈直至NaClO不得檢出。測量菌落總數(shù)，并進(jìn)行感官評定。

(2) 配制濃度為5，15，25 mg/L的AgNO3溶液，另取3份20 g綠豆芽浸入不同濃度的AgNO3溶液，浸泡30 min。用無菌去離子水洗凈至AgNO3殘留不得檢出。測量菌落總數(shù)，并進(jìn)行感官評定。

以上試驗(yàn)至少進(jìn)行3次平行，取平均值。另空白對照組用無菌水代替消毒液進(jìn)行相同步驟的處理。

1.2.4 不同消毒劑單獨(dú)處理綠豆芽中的細(xì)菌 取10 mL離心管多個，裝入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 mL，滅菌后分別接種已純化好的M1～M10菌種。37 ℃培養(yǎng)至菌體濃度107CFU/mL 左右，冷藏備用。并測量菌落總數(shù)。

在裝有菌液的離心管中分別加入NaClO和AgNO3，使?jié)舛扰c1.2.3相同，室溫下振搖30 min，測量離心管中的菌落數(shù)。作為模型對照。

1.2.5 感官評定 綠豆芽感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。挑選10位評價員，按GB 19547—2004的要求對綠豆芽進(jìn)行感官評價。

表2 綠豆芽感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope, SEM)觀察綠豆芽中菌的形態(tài) 取豆芽數(shù)根，在體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛中浸泡2 h，用磷酸緩沖液清洗30 min，體積分?jǐn)?shù)50%，70%，80%，90%濃度梯度的乙醇各清洗10 min，無水乙醇清洗30 min，醋酸異戊酯清洗30 min。臨界點(diǎn)干燥法干燥，樣品用導(dǎo)電膠固定在掃描電鏡樣品臺上，噴金后觀察[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆發(fā)芽過程中細(xì)菌總數(shù)生長規(guī)律

由圖1可知，經(jīng)無菌水洗凈后的豆種，細(xì)菌總數(shù)為4.2×103CFU/g(3.62 lg CFU/g)；避光淋水發(fā)芽12 h后，菌落總數(shù)增長到5.2×105CFU/g(5.72 lg CFU/g)；24 h后菌落總數(shù)快速增長至3.0×107CFU/g(7.48 lg CFU/L)；36 h后細(xì)菌總數(shù)增長趨勢緩慢；96 h后芽菜中的菌落總數(shù)約為5.8×107CFU/g(7.76 lg CFU/L)，說明芽菜發(fā)芽過程中，前期細(xì)菌快速繁殖，后期菌落總數(shù)保持相對穩(wěn)定。最終芽菜中的細(xì)菌總數(shù)含量極高，對芽菜的安全和保鮮都帶來了極大隱患。

圖1 綠豆發(fā)芽過程中細(xì)菌總數(shù)變化規(guī)律

2.2 綠豆芽細(xì)菌分離與鑒定

2.2.1 PCR電泳檢測結(jié)果 根據(jù)1.2.2提取各組DNA后，紫外檢測，可見清晰的PCR產(chǎn)物帶。如圖2所示，PCR產(chǎn)物帶都處于同一直線上，介于Marker分子量1 000～2 000 bp，可推斷該10種菌的PCR產(chǎn)物分子量約為1 400 bp。與空白相比產(chǎn)物單一無雜質(zhì)。

M. DL2 000 DNA Marker M1～M10. 10種菌DNA經(jīng)PCR后的產(chǎn)物

圖2 PCR擴(kuò)增后凝膠電泳圖

Figure 2 The result of gel electrophoresis after PCR

2.2.2 綠豆芽中菌種種類分布 將M1～M10提取DNA測序后在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比較，結(jié)果見表3。菌株M2、M7、M9屬于克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，其中肺炎克雷伯氏菌對人致病性較強(qiáng)，是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌之一。菌株M5、M10屬于埃希氏菌屬(Escherichia)，M1、M4屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)，M3屬于假單胞菌(Pseudomonas)，M6屬于腸桿菌屬(Enterobacter)，M8屬于假食酸菌(Pseudacidovorax)。其中肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌容易產(chǎn)生細(xì)菌生物膜。此前已有學(xué)者[18]提出生物膜的概念，認(rèn)為自然界中99%的菌都可以附著于物體表面形成生物膜結(jié)構(gòu)。

分別選取與M1～M10 10種菌相似的幾種進(jìn)行比對，將相似度高的幾種序列通過MEGA7.0進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。M1～M10 10種菌的發(fā)育樹見圖3。

表3 綠豆芽中微生物種類分布

2.3 消毒劑常規(guī)處理綠豆芽

由圖4、5可知，新鮮豆芽中的原始菌落數(shù)為5.8×107CFU/g (7.77 lg CFU/g)，水洗30 min后，菌落總數(shù)減少至4.8×107CFU/g(7.69 lg CFU/g)。本試驗(yàn)選取了1 000，2 000，3 000 mg/L的NaClO浸泡豆芽30 min，分別將豆芽中的菌落總數(shù)減少至1.2×107，2.9×105，1×105CFU/g。但綠豆芽中菌落數(shù)仍達(dá)到1×105CFU/g (5 lg CFU/g)，遠(yuǎn)多于普通果蔬中的菌落數(shù)。經(jīng)感官評價，3 000 mg/L的NaClO 處理綠豆芽會造成顯著的化學(xué)性損傷，豆芽變軟、變黃，汁液流失明顯，貨架期大大縮短。

圖3 M1～M10 10種菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

采用不同濃度的AgNO3溶液清洗芽菜，結(jié)果表明5 mg/L的AgNO3溶液幾乎沒有消毒作用，15 mg/L的AgNO3溶液可以將菌落總數(shù)降低1.0～1.2 lg CFU/g，對豆芽消毒效果不顯著。增加AgNO3濃度至25 mg/L，可將菌落總數(shù)降至3.8×105CFU/g(5.5 lg CFU/g)，與對照相比降低了2.0～2.2 lg CFU/g，顯示出Ag+具有一定的消毒效果，但效果次于NaClO。25 mg/L AgNO3溶液對豆芽外觀有一定的影響，會使豆芽硬度和脆性降低。

圖4 有效氯濃度的NaClO對綠豆芽的消毒效果

圖5 AgNO3濃度對綠豆芽的消毒效果

2.4 消毒劑直接處理綠豆芽中細(xì)菌效果評價

由圖6可知，2種消毒劑對每種菌的消毒效果明顯，NaClO的消毒效果更優(yōu)于AgNO3。3 000 mg/mL NaClO溶液可使離心管中的菌減少(4.5～5.5 lg CFU/mL)，最后約剩1×103CFU/mL (3 lg CFU/mL)。特別是對M4Acinetobacterjunni的殺菌效果最強(qiáng)，最終殘留量為2.9 lg CFU/mL。25 mg/mL AgNO3溶液處理，菌落數(shù)下降3 lg CFU/mL，相比于相同方法處理的新鮮綠豆芽，殺菌效果平均提高了2～3 lg CFU/g。說明存在于豆芽中的細(xì)菌比單獨(dú)培養(yǎng)的模型對照組的同類細(xì)菌更難殺滅。

圖6 不同消毒劑處理豆芽后菌落總數(shù)條形圖

2.5 掃描電鏡(SEM)觀察結(jié)果

圖7為子葉，大量菌體聚集在芽菜細(xì)胞表面。菌體與菌體之間，菌體與芽菜細(xì)胞之間多數(shù)呈絲狀連接，絲狀物分布廣泛，局部區(qū)域絲狀物連接成膜狀。菌體表面也有大量的絲狀或成膜狀物覆蓋、纏繞。圖8為豆芽下胚軸，其表面微生物分布密集，數(shù)量遠(yuǎn)多于子葉部位。圖8箭頭所示部位是微生物已大量聚集。微生物之間和微生物與芽菜細(xì)胞之間也有大量的絲狀物存在，絲狀物的積累最后會成膜并包裹微生物。

圖7 綠豆芽子葉微生物SEM顯微觀察圖

圖8 綠豆芽下胚軸微生物SEM觀察圖

3 結(jié)論

綠豆芽中的微生物以克雷伯氏菌屬和埃希氏菌屬數(shù)量最多，二者均屬于條件致病菌，處理不當(dāng)將對人體健康造成危害。采用不同消毒劑進(jìn)行浸泡消毒，可使豆芽中的細(xì)菌總數(shù)降低一定的數(shù)量，但仍然約有5 lg CFU/g。當(dāng)采用同樣的方法單獨(dú)處理10種菌的培養(yǎng)物，最終可將的菌總數(shù)降到約3 lg CFU/mL，殺菌效果相比于含菌芽菜的處理有顯著差異。通過掃描電鏡直接觀察豆芽表面微生物，可看到大量絲狀物分布在微生物細(xì)胞之間，絲狀物的積累形成厚實(shí)的膜狀物，包裹著大量菌體。初步判斷為細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)。

芽菜是一種較為脆弱的蔬菜，難以耐受高強(qiáng)度消毒劑的處理，而且微生物聚集成膜加大了消毒的難度。故為了有效降低芽菜的原始含菌量，溫和有效地消除致病菌，而不破壞芽菜本身口感，提高芽菜的保鮮和安全性，需進(jìn)一步探究其生物膜的特點(diǎn)及如何破壞芽菜表面導(dǎo)致細(xì)菌成膜的生物聚合基質(zhì)。

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Growth and distribution of microorganisms in the production of green bean sprouts and evaluation of disinfectant treatment

LUOXin

FULiang

HAOtian-yao

FANGLiang-yue

(DepartmentofFoodScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China)

The distribution of microbes in the process of green bean sprouts, and the treatment and effect of the two different types disinfectants were studied. The results showed that the total amount of microorganisms in the mung beans sprouts was 5.8 × 107CFU/g, and the microbial species were mainlyKlebsiella,Acinetobacter,EnterobacterandPseudomonas. The total amount of microorganisms in the mung bean sprouts was decreased to 1.0 × 105CFU/g when the effective chlorine concentration was 1 000～3 000 mg/L NaClO, while the model control group decreased to 1.0 × 103CFU/g. The effect of Ag+was worse than NaClO, but it also showed a similar law. Using the scanning electron microscopy(SEM)to observe the sprouts, the surface of microbes formed a visible biofilm, which significantly enhanced the tolerance of bacteria to disinfectants.

mung bean sprouts; microorganisms; identification of bacteria; disinfectant; biofilm

羅欣，女，暨南大學(xué)在讀碩士研究生。

傅亮(1968—)，男，暨南大學(xué)副教授，博士。 E-mail：tfuliang@jnu.edu.cn

2017—05—19

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.011