一株產(chǎn)乙醇細菌的分離篩選與鑒定

陳夢娟

周紅麗2

蔣立文2

鄧青青1

朱韻奕1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

一株產(chǎn)乙醇細菌的分離篩選與鑒定

陳夢娟1

周紅麗2

蔣立文2

鄧青青1

朱韻奕1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

以湖南省盛產(chǎn)的4種刺葡萄為原料，經(jīng)過分離篩選與鑒定，從米刺葡萄表面獲得編號為MUY3的一株產(chǎn)乙醇的細菌。MUY3在28 ℃發(fā)酵48 h后，其發(fā)酵液中乙醇體積分數(shù)可達到10.67%。通過繪制生長曲線、同化試驗、甲基紅試驗、耐高滲透壓試驗等對其生理生化特征進行研究。同時采用16S rDNA序列鑒定及進化樹分析對該細菌進行鑒定。結果表明，MUY3與Enterobacterxiangfangensis strain 10-17最為接近，相似度達100%，所以該菌種為Enterobacterxiangfangensis strain 10-17。

刺葡萄；乙醇；16S rDNA；Enterobacterxiangfangensis strain 10-17；生理生化特征

隨著中國人均GDP的不斷增長以及中西方文化的深入交流，葡萄酒文化越來越受到國人的重視，中國的葡萄酒產(chǎn)業(yè)取得了長足發(fā)展[1]，葡萄酒的年均消費量也在不斷的增加[2]。近幾十年，許多葡萄酒生產(chǎn)商采用國外進口酵母進行純種發(fā)酵，以提高生產(chǎn)效率并且使釀造過程便于控制，保證安全高效生產(chǎn)[3]，但這也導致葡萄酒生產(chǎn)出現(xiàn)較為嚴重的“同質(zhì)化”現(xiàn)象[4]，對中國的葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來沖擊。因此，為了釀造出風格獨特又具有典型性[5]的葡萄酒已經(jīng)成為了一個世界性的課題。

刺葡萄在湖南鳳凰、吉首等地已有較大的種植基地，果實產(chǎn)量較高，品質(zhì)優(yōu)良并含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[6-7]，是釀造葡萄酒的優(yōu)質(zhì)原料。用刺葡萄釀制的葡萄酒，顏色深紅艷麗，并且風味品質(zhì)極佳[8]。目前，刺葡萄酒的釀造中多采用已有活性干酵母[9]進行純種發(fā)酵，雖然提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和可預測性[10]，但產(chǎn)品缺乏特色。本研究擬從成熟葡萄果實的果皮和果肉[11]、葡萄酒的自然發(fā)酵醪[12]、葡萄種植園的土壤[13-14]等相關環(huán)境中篩選適合本土葡萄釀造的葡萄酒釀造菌種，為刺葡萄酒釀造做好菌種儲備。目前已有學者[15]從上述環(huán)境中分離得到酵母菌并應用于葡萄酒的釀造中，然而從葡萄果皮上篩選具有優(yōu)良發(fā)酵性能的細菌菌種則暫未有報道。

本研究從湖南懷化刺葡萄的表面分離得到的一株產(chǎn)乙醇能力較強的細菌，通過對該細菌進行菌種鑒定及碳源同化、氮源同化、耐高滲透壓試驗[16]等生理生化研究，以期將其運用于葡萄酒釀造領域中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

刺葡萄：米刺葡萄，湖南省懷化市；

氯化鈉、無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1) TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)上層培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，大豆胨3.0 g，葡萄糖6.0 g，氯化鈉2.5 g，硫代硫酸鈉0.5 g，瓊脂15 g，L-鹽酸胱氨酸0.25 g，維生素K 1 g，亞硫酸鈉0.1 g，TTC 0.5 g，蒸餾水1 000 mL。

(2) TTC底層培養(yǎng)基(即PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯浸出粉300 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，最終pH為(6.0±0.2)。

(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

(4) 12.5%豆芽汁培養(yǎng)基：稱取125 g黃豆芽放入1 L水中，煮沸0.5 h后過濾，并補充蒸餾水至1 L，即成12.5%豆芽汁培養(yǎng)基，在121 ℃滅菌20 min。

(5) 無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.2 g，七水合硫酸鎂0.2 g，二水合硫酸鈣0.2 g，瓊脂20 g，碳酸鈣0.2 g，蒸餾水1 000 mL。

(6) 緩沖葡萄糖蛋白水：磷酸二氫鉀5 g，多胨7 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1 000 mL，矯正pH為7.0。

1.1.3 主要儀器設備

分光光度計：722N型，上海菁華科技儀器有限公司；

電子天平：TP-620A型，湘儀天平儀器設備有限公司；

智能生化培養(yǎng)箱：LRH-250型，上海飛越實驗儀器有限公司；

低溫高速離心機：Centrifuge 5424R型，德國Eppendorf公司；

數(shù)顯三用恒溫水箱：HH-420型，上海浦東物理光學儀器廠；

PCR儀：T100型，美國BIO-RAD公司。

1.2 菌種分離與篩選

1.2.1 分離培養(yǎng) 取25 g新鮮成熟的米刺葡萄果實放入225 mL的已滅菌生理鹽水中，在24 ℃ 40 KHz的超聲清洗器中超聲2 min制成混濁液。經(jīng)過梯度稀釋后，選取適當?shù)南♂尡稊?shù)取100 μL均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，于(28±1) ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取具有典型特征的菌落進行染色鏡檢，并進行平板反復劃線純化后，將其接到斜面培養(yǎng)基上于4 ℃保藏備用。

1.2.2 TTC平板初篩 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是一種顯色劑，當TTC接受細菌脫氫酶作用而釋放出游離氫后會產(chǎn)生顯色反應使菌落顯出紅色，此過程中釋放的氫越多，紅色越深，反之，則紅色越淺[17-18]。

將斜面培養(yǎng)基上保藏的菌株接入TTC底層培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)48 h，待菌落充分長成后，倒入一層較薄的TTC上層培養(yǎng)基將底層培養(yǎng)基完全覆蓋，然后在(28±1) ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取顏色較深的菌落將其保藏備用。

1.2.3 搖瓶復篩 將TTC平板初篩得到的菌株分別接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在(28±1) ℃條件下發(fā)酵48 h后，測定發(fā)酵液中是否有乙醇產(chǎn)生，及發(fā)酵液中乙醇的含量，挑選出乙醇產(chǎn)量高的菌株做進一步的鑒定。試驗設置3個平行。

1.3 生長曲線的繪制

首先將低溫保藏的菌種接入100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)24 h進行活化。然后按照5%的接種量接入到裝有300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于(28±1) ℃培養(yǎng)，每2 h取一次樣，用可見光光度計測定OD600值，根據(jù)測定得到的光密度值繪制該菌種的生長曲線[19]。

1.4 菌種的鑒定

使用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測菌株的DNA，對提取的DNA進行PCR擴增16S rDNA，通用引物為(27-F: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492-R: TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。PCR反應體系為50 μL(DNA模板2 μL、上下游引物各為1 μL、緩沖液5 μL、dNTPs 4 μL、Tap酶0.25 μL、MgCl24 μL、ddH2O 32.75 μL)。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物送至測序公司進行測序，將測序得到的基因序列在NCBI上進行BLAST比對，從中選取同源性高的菌株，再使用MEGA 7.0軟件，NJ方法，構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 生理生化鑒定

1.5.1 碳源同化試驗 采用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、檸檬酸、可溶性淀粉、甘露醇、纖維二糖、山梨醇、棉子糖。將12.5%的豆芽汁培養(yǎng)基進行分裝，每只試管中裝入10 mL培養(yǎng)基，并于121 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時，加入10%的無菌糖溶液625 μL。然后將待測試菌種進行活化后，按照5%的接種量接入到已準備好的培養(yǎng)基中，(28±1) ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察是否出現(xiàn)渾濁，如果培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁則為陽性，反之則為陰性。以不含糖的試管為陰性對照管，每種碳源試驗設置3個平行。

1.5.2 氮源同化試驗 采用的氮源有：L-賴氨酸、硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸銨、天門冬素。在無氮培養(yǎng)基上分別加入以上氮源作為培養(yǎng)基的唯一氮源，加入量為0.078%，并于115 ℃滅菌20 min。按5%的接種量將已活化的菌種接入制備好的培養(yǎng)基中，于(28±1) ℃培養(yǎng)48 h。試驗設置3個平行，以不加氮源的無氮培養(yǎng)基作為陰性對照。根據(jù)菌種在不同氮源培養(yǎng)基上生長情況，判斷氮源是否能夠被菌株同化。

1.5.3 甲基紅試驗 挑取少量新鮮的待測試培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中，于(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，48 h后每24 h取培養(yǎng)液加入甲基紅試劑1～2滴，立即觀察現(xiàn)象。直至發(fā)現(xiàn)陽性或第5天仍為陰性即可判定結果。滴入指示劑，呈鮮紅色或橘紅色為陽性；橘黃色或黃色為陰性。

1.5.4 耐乙醇試驗 向帶有杜氏小管且已滅菌的培養(yǎng)基中添加乙醇，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇體積分數(shù)達到10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，混勻后接入已活化好的菌種，(28±1) ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌體生長情況和產(chǎn)氣情況。通過試驗結果縮小耐受限值范圍，并再進行試驗確定。

1.5.5 耐高滲透壓試驗 將經(jīng)過隔夜活化的菌種劃線接種于葡萄糖濃度為25%，30%，35%，40%，45%的PDA培養(yǎng)基上，放置于(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，進行檢查。試驗過程中需采取蠟紙封口等措施預防培養(yǎng)基干燥。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

從米刺葡萄表面篩選出一株產(chǎn)乙醇能力較強的細菌，編號為MUY3，在(28±1) ℃的恒溫條件下靜置發(fā)酵48 h后，其發(fā)酵液中的乙醇濃度可達到10.67%。

2.2 MUY3的形態(tài)特征

MUY3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌落呈規(guī)則的圓形，白色，表面光滑且凸起，直徑達1.5～2.0 mm，見圖1。經(jīng)過革蘭氏染色后在油鏡下觀察，細胞為直桿狀、無芽孢的革蘭氏陰性細菌，見圖2。圖3為MUY3在TTC平板上生長48 h的菌落特征。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色結果(1 000×)

圖3 TTC平板結果

2.3 MUY3的鑒定

采用細菌通用引物對MUY3的高度保守序列區(qū)域進行PCR擴增，得到了大約1 500 bp的擴增片段，其擴增產(chǎn)物較純，見圖4。在NCBI上對比后選擇同源性較高的菌株并構建系統(tǒng)進化樹，見圖5。從進化樹可知MUY3與Enterobacterxiangfangensis strain 10-17 的親緣關系最近，同源性可信度為100%。因此，MUY3可以初步判定為Enterobacterxiangfangensis strain 10-17。

圖4 MUY3 16S rDNA PCR擴增結果

圖5 菌株MUY3的系統(tǒng)進化樹

2.4 菌株的生長曲線

由圖6可知，當菌種接種入培養(yǎng)基8 h后進入對數(shù)期，18 h后進入穩(wěn)定期。如果在試驗或生產(chǎn)中為獲得生理特性穩(wěn)定、代謝旺盛[20]的細菌則可活化10～18 h。

圖6 MUY3的生長曲線

2.5 生理生化試驗

2.5.1 同化試驗 MUY3可以利用的碳源、氮源范圍較廣，并且該菌種利用葡萄糖和蔗糖作為碳源時，其發(fā)酵液中渾濁度和產(chǎn)氣量明顯高于其他碳源，試驗結果見表1、2。

表1 碳源同化試驗?

? “+”表示培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁；“-”表示培養(yǎng)基中無渾濁。

表2 氮源同化試驗?

? “+”表示培養(yǎng)基上有菌落長成；“-”表示培養(yǎng)基上無菌落長成。

2.5.2 甲基紅試驗 培養(yǎng)48 h后，每24 h取培養(yǎng)液滴入少量甲基紅試劑觀察培養(yǎng)液顏色的變化。結果顯示，培養(yǎng)48，72，96 h時培養(yǎng)液為淡黃色，培養(yǎng)120 h時(即第5天)培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，記為MR試驗為“-”，表明MUY3產(chǎn)酸能力較弱，見圖7。

圖7 甲基紅試驗

2.5.3 耐乙醇試驗 一般葡萄酒含乙醇的體積分數(shù)在10%～15%[21]。由表3可知，MUY3對乙醇有較高的耐受性，當體積分數(shù)為10%～15%時，對該菌種的發(fā)酵無明顯影響，并且其最大耐受限度范圍為30%～35%。因此，使發(fā)酵液中的乙醇體積分數(shù)達到30%，31%，32%，33%，34%，35%，以同樣的方法再進行試驗，得到結果見表4。所以得出菌種MUY3對乙醇的最大耐受限度為30%(體積分數(shù))。

2.5.4 耐高滲透壓試驗 本試驗采用葡萄糖進行培養(yǎng)基中糖濃度的調(diào)節(jié)，見表5，其耐滲透壓的極限值為40%，且在該濃度下MUY3存活率偏低。

3 結論

本研究從湖南懷化米刺葡萄表面篩選出一株能產(chǎn)乙醇的細菌，編號為MUY3，被初步鑒定為Enterobacterxiang-fangensis strain 10-17，并對其部分發(fā)酵特性進行了研究。菌株MUY3能耐高滲透壓，具有較強的發(fā)酵性能，在28 ℃恒溫培養(yǎng)條件下發(fā)酵48 h后，其發(fā)酵液中產(chǎn)乙醇量為10.67%，而耐受乙醇體積分數(shù)可達到30%，并且該菌種能利用多種碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、D-木糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖)和氮源(L-賴氨酸、硝酸銨、天門冬素)。

表3 MUY3在不同體積分數(shù)乙醇中的產(chǎn)氣情況?

? “-”表示不產(chǎn)氣；“+”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的1/5；“++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的2/5；“+++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的3/5；“++++”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的4/5；“+++++”表示氣體量充滿杜氏小管。

表4 MUY3的乙醇耐受限度?

? “-”表示不產(chǎn)氣；“+”表示產(chǎn)氣量為杜氏小管的1/5。

表5 高滲透壓試驗?

? “-”表示無菌落長成；“+”表示有菌落長成。

目前菌種Enterobacterxiangfangensis strain 10-17的相關研究較少，暫時無法取代酵母菌在葡萄酒釀造中的應用，主要的原因是無法確定發(fā)酵過程中有哪些副產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時也無法確定副產(chǎn)物對葡萄酒品質(zhì)是否有影響。為解決上述問題，對Enterobacterxiangfangensis strain 10-17進行菌種改良及發(fā)酵副產(chǎn)物的研究將成為今后科研工作者的研究方向。

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Isolation, screening and identification of an ethanol-producing bacterium

CHENMeng-juan1

ZHOUHong-li2

JIANGLi-wen2

DENGQing-qing1

ZHUYun-yi1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.HunanKeyLaboratoryofFoodBiotechnology,Changsha,Hunan410128,China)

From four kinds ofVitisdavidii, widely planted in Hunan Province, an ethanol-producing bacterium named MUY3 was obtained from the surface of the rice grape by separation screening and identification. Its physiological and biochemical characteristics were investigated, including the cultivation of growth curve, assimilation test, methyl red test and high osmotic pressure test. Moreover, its 16S rDNA sequence was analyzed, and the phylogenetic tree analysis were used to identify this bacterium. The results showed that MUY3 was close toEnterobacterxiangfangensis and the similarity was 100%. Therefore, the strain was identified asEnterobacterxiangfangensis 10-17.

Vitisdavidii; ethanol; 16S rDNA;Enterobacterxiangfangensis strain 10-17; Physiological and biochemical characteristics

湖南省教育廳重點項目(編號：14A072)

陳夢娟，女，湖南農(nóng)業(yè)大學在讀碩士研究生。

周紅麗(1972—)，女，湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院教授，博士，碩士生導師。E-mail: xuanxuan310@126.com

2017—01—28

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.007