一種間接免疫熒光實驗封片印章的研制

許興路， 譚太昌

1.黑龍江省醫(yī)院 放射免疫特檢科，黑龍江 哈爾濱 150036；2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院 檢驗科，四川 成都 610072

一種間接免疫熒光實驗封片印章的研制

許興路1， 譚太昌2

1.黑龍江省醫(yī)院 放射免疫特檢科，黑龍江 哈爾濱 150036；2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院 檢驗科，四川 成都 610072

目的設(shè)計一種用于解決間接免疫熒光實驗過程中快速準確滴定封片液的工具（簡稱封片印章）。方法根據(jù)普通印章的原理，采用聚甲基丙烯酸甲酯材料制成封片印章。結(jié)果該設(shè)計解決了封片液快速均勻滴定的問題，目前已試用于全國20家醫(yī)院的間接免疫熒光實驗中，并得到一致認可。該封片印章滴定封片液速度快，封片液滴大小一致，液滴距離均勻，與熒光片對應(yīng)整齊，顯著提高了封片效率和封片質(zhì)量。結(jié)論該產(chǎn)品可以廣泛應(yīng)用于間接免疫熒光實驗封片過程及具有同類封片需求的實驗中，將來還可以應(yīng)用在有封片需求的自動化儀器上。

封片印章；間接免疫熒光實驗；封片；封片介質(zhì)

引言

間接免疫熒光實驗（Indirect Immuno fluorescence Assays， IFA）[2]是自身抗體臨床檢測經(jīng)典的不可或缺的實驗方法，廣泛應(yīng)用于自身抗體的快速篩查、確立臨床診斷方向及發(fā)現(xiàn)新抗體[3-6]。目前IFA通常采用手工操作，部分實驗室已經(jīng)采用了自動化儀器完成操作[6-8]。然而，無論是手工操作，還是自動化儀器操作，都無法回避滴定封片液進行封片的步驟。即使是自動化儀器，也沒有給出完善的自動封片解決方案。兩種方法都需要實驗人員手持封片液滴定塑料瓶，一滴一滴地滴在蓋玻片或基質(zhì)片的特定位置，滴定若干封片液滴。并且，要求封片液滴大小均一，位置準確。然后蓋上基質(zhì)片(倒扣反應(yīng)實驗)或蓋玻片[5,10-11]。所有這些操作，需要實驗人員技術(shù)嫻熟，耐心仔細。面對數(shù)以百計的實驗量，對實驗人員的耐性和耐力都是很大的挑戰(zhàn)。封片印章的設(shè)計就是為了解決封片液滴定難題，簡化滴定操作，提高封片質(zhì)量和效率，減輕實驗人員工作量，是實現(xiàn)封片自動化及標準化的最佳解決方案。

1 材料與方法

1.1 原理

采用印章的工作方式，制作有若干引腳的印章樣工具即封片印章。用封片印章的引腳蘸取封片液，利用封片液粘稠的物理特性，引腳可以黏附一定量的封片液。當封片印章的引腳在蓋玻片上按下并抬起后，會有部分封片液黏附在蓋玻片上，從而實現(xiàn)封片液的滴定。

1.2 封片印章引腳攜帶封片液試驗

1.2.1 實驗?zāi)康?/p>

選出滿足滴定量的滴定引腳規(guī)格及合適的封片液深度。間接免疫熒光實驗封片過程中，封片液滴定量有嚴格的規(guī)定（10 μL）[11]。滴定量少則無法很好吸附蓋玻片；滴定量過多，會使封片液溢出。封片液滴定量與引腳的直徑及引腳在封片液中的浸入深度正相關(guān)。基于這兩個因素，設(shè)計實驗選出最理想的引腳直徑和封片液深度范圍。

1.2.2 實驗設(shè)計

制作直徑分別為2、2.5、3、3.5、4 mm的印章引腳，封片液深度分別準備2、3、4、5、6、7、8、9、10 mm；用不同直徑的引腳分別蘸取不同深度的封片液，點在蓋玻片上，要求每個規(guī)格的引腳要蘸取相同深度的封片液5次，用游標卡尺測量液滴的直徑，取其均值；結(jié)果統(tǒng)計S表示液滴直徑小或液滴量少；M表示液滴直徑適中或液滴量適中；L表示液滴直徑大或液滴量大。

1.2.3 實驗結(jié)果

封片印章引腳直徑及封片液深度遴選結(jié)果，見表1。

表1 封片印章引腳選擇方案及結(jié)果

1.2.4 實驗結(jié)論

直徑2.5 mm和3.0 mm的引腳可以滴定出直徑適中的液滴,封片液深度在3.0～7.0 mm的引腳可以滴定出封片液量適中的液滴。其中直徑2.5 mm的引腳適合的封片液深度范圍狹窄，只有封片液深度在6～7 mm時才可滴定出適中的液滴；而直徑為3.0 mm的引腳是印章引腳最佳直徑，封片液的深度控制在3.0～7.0 mm間均能得到適中的液滴，一次灌注封片液可滴定更多液滴。

1.3 封片印章的設(shè)計

（1）材質(zhì)。為方便封片印章制造及滴定操作時定位，特采用 聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate，PMMA）材質(zhì)，PMMA俗稱有機玻璃，材質(zhì)透明，便于加工[12]。

（2）結(jié)構(gòu)。封片印章由印章體和印章引腳組成，印章主體采用厚7.0 mm長寬50 mm×20 mm的PMMA塊。根據(jù)以上試驗結(jié)果，印章引腳是10個直徑3.0 mm長度10.0 mm的PMMA圓柱體，圓柱體分兩排，分布印章體縱軸兩側(cè)，根據(jù)實驗基質(zhì)片間距，每個引腳的中心點間距是9.0 mm，圓柱體距離寬邊距離5.5 mm，距離窄邊距離7.0 mm。引腳分布與基質(zhì)片上基質(zhì)分布相同，形成一一對應(yīng)的關(guān)系。配合封片印章，還有一個印章盒，用于存放封片印章和蘸取封片液。封片印章設(shè)計結(jié)構(gòu)圖，見圖1。

1.4 封片印章的使用

封片印章的使用，具體參照如下的步驟：

（1） 灌注封片液。向封片印章盒的封片液槽加注封片液，液面深度控制在3.0～7.0 mm為宜。

（2）蘸取封片液。右手拇指和食指從右側(cè)捏住印章體窄邊，保持印章引腳朝下，露出印章背面，便于觀察印章引腳滴定位置。手持印章移動至封片印章盒的封片液槽處蘸取封片液，使印章引腳黏附足量封片液。

（3）滴定封片液。移動印章到達蓋玻片上方，對齊位置按下印章后稍微停頓后抬起。抬起印章時注意，印章拇指或食指端先抬起少許，再垂直抬起，防止印章引腳帶起蓋玻片。

（4）結(jié)束封片。進行下一個蓋玻片封片液滴定。

圖1 封片印章設(shè)計結(jié)構(gòu)圖

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用及普及情況

截止到投稿時，封片印章已在全國多達20家醫(yī)院實驗室使用，其中包括北京協(xié)和醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院等全國知名醫(yī)院。另外，還包括國外一家醫(yī)療機構(gòu)在使用。使用該產(chǎn)品時間最長的單位黑龍江省醫(yī)院已長達5年，累計封片10000余張。封片印章得到使用單位的一致好評。

2.2 產(chǎn)品優(yōu)缺點

通過各家醫(yī)院實際使用情況和反饋信息，可以得出如下結(jié)論。

2.2.1 封片印章優(yōu)點

（1）創(chuàng)新性發(fā)明。封片印章的研制及在間接免疫熒光實驗中使用，據(jù)調(diào)查屬于全世界首例，是填補該行業(yè)空白的工具。

（2）效率高。封片印章滴定速度顯著提高。封片印章具有10個滴定圓柱，一次可以滴定10個封片液滴，滴定速度比手持封片液滴定瓶一點一點滴定大大提升，減少實驗人員的工作量，簡化實驗操作流程。

（3）質(zhì)量保證。封片印章滴定質(zhì)量顯著改善。封片印章每個滴定引腳大小一致，位置固定，且與基質(zhì)片位置一一對應(yīng)。封片印章這些特點確保其滴定的封片液滴大小均一，間距相等。

（4）位置準確。封片印章滴定操作方便定位。封片印章采用透明PMMA材質(zhì)，方便實驗人員確定滴定位置，確保滴定液滴與基質(zhì)片一一對應(yīng)。

（5）方便自動化。封片印章已初步應(yīng)用到自動化間接免疫熒光實驗儀器上，解決了自動化儀器滴定封片液的難題，推動了間接免疫熒光實驗的自動化進程。

2.2.2 封片印章缺點及改進意見

（1）操作不夠方便。封片操作時需要拇指和食指捏住封片印章體窄邊的兩端，該手持方法不夠方便。解決辦法：給封片印章體頂部（見圖1 注7）設(shè)計一個把手，操作時捏住封片印章的把手，提高操作的舒適度。

（2）封片印章盒過小。封片印章盒過小，使用過程中蘸取封片液不方便且容易側(cè)翻，導(dǎo)致封片液外漏。解決辦法：設(shè)計更大的封片印章盒，或為現(xiàn)有封片盒固定更大的底座。

（3）封片印章引腳數(shù)目固定。間接免疫熒光實驗用到的基質(zhì)片有3、5、10個基質(zhì)3種規(guī)格，該封片印章只有10個引腳規(guī)格，不能滿足其他規(guī)格的要求。解決辦法：采用10引腳兼容其他兩個規(guī)格，由于實驗試劑盒配給的封片液足夠多，使用10個引腳規(guī)格兼容3、5個基質(zhì)的熒光片，封片液仍有剩余。而且如果3、5、10個引腳3種規(guī)格的封片印章同時使用，會給操作帶來不便。

（4）蓋玻片容易被黏附帶走。封片印章按下抬起時容易將蓋玻片黏附在封片印章引腳上，跟封片印章一起被帶走。該問題是操作熟練程度不夠?qū)е?，需要操作者遵守操作說明，經(jīng)過簡單的練習(xí)可避免。

3 討論

間接免疫熒光實驗是自身抗體檢測的重要方法，被美國風濕病學(xué)會（ACR）、歐洲自身免疫標準化促進會（EASI）等專業(yè)學(xué)會推薦為參考方法[13]。國內(nèi)的現(xiàn)狀是：絕大部分實驗室通過手工操作實現(xiàn)，少部分實驗室采用了自動化操作儀實現(xiàn)。國際上自動化操作解決方案有5個，分別是：AKENOMI，Medipan； Zenit lite，A. Menarini Diagnostics；Sprinter XL，Euroimmun；Helmed，Aesku. Diagnostics；AFT3000?，Immuno Concepts[14-16]，其中在國內(nèi)應(yīng)用的有Aesku的Helmed和Euroimmun的Sprinter XL。

間接免疫熒光實驗手工操作適合實驗樣本少，檢測項目少的實驗室[7-9]。如果實驗室樣本過多，就存在實驗每個步驟操作時間過長，前后樣本反應(yīng)時間不一致的問題，影響批內(nèi)實驗質(zhì)量[5]。另外，過多的實驗樣本，由人工操作出現(xiàn)差錯的概率也會增多。自動化解決方案的出現(xiàn)，很好的解決了以上問題，并且實驗的質(zhì)量也很好，完全達到手工實驗的效果。但是現(xiàn)有的自動化儀器都沒有對封片問題給出完善的解決方案，有的需要借助手工封片，有的省去封片步驟，失去封片液保護的基質(zhì)片，熒光非常容易被淬滅。

自動化解決方案對自動封片的缺失是受封片液的理化性質(zhì)影響導(dǎo)致的。封片液的主要成分是甘油，甘油是一種粘稠液體，在20℃的粘 度大約1500 cP，是水粘度的1000多倍[17]。使用常規(guī)柱塞泵或蠕動泵無法實現(xiàn)自動化滴定[5]。所以無論是手工操作的實驗室，還是自動化操作的實驗室，在封片問題上，都要靠實驗人員手動滴定封片液完成封片操作。

封片印章棄常規(guī)移液方式，恰恰利用封片液粘稠的特性，采用粘液吸附的原理[18]，實現(xiàn)封片液的滴定。并排的印章引腳陣列，一次可以滴定多個封片液滴，大大提高了操作效率，確保滴定質(zhì)量。該封片印章可以應(yīng)用在手工操作的間接免疫熒光實驗及有同類需求的實驗操作中，也可應(yīng)用在自動化的儀器上，促進間接免疫熒光操作全面的自動化。

4 結(jié)論

總之，封片印章的設(shè)計，具有實際應(yīng)用價值，有效解決了間接免疫熒光實驗中封片液滴定問題。提高了滴定效率和質(zhì)量，減少工作量，減化了實驗步驟，為自動化封片提供完善的解決方案。全國范圍的試用結(jié)果理想，可以進行全面的推廣應(yīng)用。

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本文編輯 袁雋玲

Preparation of a Mounting Stamper in Indirect Immunoin fluorescence Assays

XU Xinglu1, TAN Taichang2
1.Department of Radioimmunoassay, Heilongjiang Provincial Hospital, Haerbin Heilongjiang 160036, China; 2.Department of Medical Laboratory, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial people’s Hospital, Chengdu Sichuan 610072, China

ObjectiveTo design a tool for titrating sealing liquid (stamper for short) rapidly and accurately in indirect immunoinfluorescence assays (IFA for short).MethodsAccording to the principle of the common seal, the stamper was made by using polymethymethacrylate (PMMA).ResultsThis device had met the demand of titrating sealing liquid rapidly and equably. To date, the stamper had been used in IFA of 20 domestic hospitals, which had gained unanimous recognition. The stamper could improve the sealing ef ficiency and quality signi ficantly by its rapid titrating speed, equal droplet size, and uniform droplet distance.ConclusionThis device can be widely used in indirect IFA or other assays with similar demands of sealing and further applied to the automatic instruments with the need of sealing in the future.

stamper; indirect immuno fluorescence assays; sealing; mounting medium

446.6

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.09.013

1674-1633(2017)09-0056-03

2016-10-24

2017-01-04專利名稱：實用新型專利（ZL2016 2 0084176.4）。

譚太昌，副主任技師，主要研究方向為自身抗體檢測的智能化及自動化。

通訊作者郵箱：hljria@126.com