高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立△

孫樂，彭軍，楊潤梅*，許利嘉

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

·基礎研究·

高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立△

孫樂1，彭軍2，楊潤梅1*，許利嘉1

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

目的：高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠模型。方法：大鼠隨機分為正常對照組和造模組，造模組大鼠喂飼高脂高糖飼料誘導4周后，腹腔注射STZ 30 mg·kg-1并繼續(xù)高脂飲食進行造模。造模8周后，測定大鼠空腹血糖(FBG)及胰島素含量，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，同時測定各組大鼠的肝功水平。將造模成功的大鼠根據(jù)血糖水平分為模型組、鹽酸二甲雙胍組。連續(xù)給藥4周即造模12周后進行大鼠糖耐量試驗，測定血清生化指標和肝臟脂質含量；另取部分肝臟組織進行病理學檢測。結果：注射STZ后，造模組大鼠出現(xiàn)明顯的體重下降、多飲多尿的糖尿病癥狀。造模8周和12周后，與正常對照組比較，模型組大鼠ISI明顯下降；FBG和血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性明顯升高。給藥4周后，與模型組相比，鹽酸二甲雙胍組大鼠ISI明顯升高，糖耐量(AUCG)、FBG、血清ALT活性以及肝臟中總膽固醇(TC)含量均明顯降低。結論：利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)配合腹腔注射STZ可以成功建立2型糖尿病與非酒精性脂肪肝大鼠模型。

2型糖尿?。环蔷凭灾靖?；高脂飲食；鏈脲佐菌素

隨著人們生活水平的提高，一些不健康的生活方式和飲食方式大量出現(xiàn)，導致2型糖尿病的發(fā)病率急劇上升。2型糖尿病是糖尿病的一種，又稱為非胰島素依賴型糖尿病(Non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)，是以機體胰島素分泌不足和胰島素抵抗為主要病理生理特征的一類慢性代謝性疾病[1]，可引發(fā)糖脂代謝紊亂的一系列并發(fā)癥，其中以非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)最為多發(fā)。目前臨床上對2型糖尿病尚無完全治愈的方法，只能采用控制或治療并發(fā)癥的手段來緩解糖尿病的發(fā)展。20世紀以后，分子生物學和遺傳學手段的應用從分子角度剖析了糖尿病的病因和遺傳特性，而建立一個穩(wěn)定的2型糖尿病模型對于深入研究其發(fā)病機理、預防和治療措施等至關重要。

高脂高糖飲食會造成大鼠胰島素抵抗和非酒精性脂肪肝，但僅憑高脂高糖刺激很難改變血糖水平，20世紀開始有研究者用鏈脲佐菌素(STZ)誘發(fā)糖尿病的產(chǎn)生[2]，STZ的作用機理是選擇性地破壞胰島β細胞，從而造成胰島素分泌降低，但形成的糖尿病模型不具有2型糖尿病的特征。因此本實驗將采用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素注射來建立穩(wěn)定的2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型，并應用鹽酸二甲雙胍驗證模型的穩(wěn)定性。

1 材料

1.1動物

雄性Wistar大鼠，體重190～210g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。

1.2飼料

大鼠常規(guī)飼料和高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)，生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2014-0008。高脂飼料配方如下：1%膽固醇，0.5%膽酸鹽，15%豬油，20%蔗糖，63.5%基礎飼料。

1.3動物飼養(yǎng)條件

大鼠在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度20～25℃，濕度40%～70%，10只/籠，定量給予常規(guī)飼料或高脂飼料，自由飲水。

1.4陽性對照藥

格華止(鹽酸二甲雙胍片)：中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：0.5g/片，批號：AAC8300，有效期至2017年6月。

1.5主要試劑

鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：Sigma公司，批號：18883-66-4；

血糖試紙：德國羅氏診斷有限公司，批號：23470337。

肝臟總膽固醇(TC)，批號：151841，有效期至2018年6月；肝臟甘油三酯 (TG)，批號：157201，有效期至2018年5月，以上測定試劑盒均來源于中生北控生物科技股份有限公司。

天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)，批號：AUZ2686，有效期至2017年1月；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，批號：AUZ2678，有效期至2017年1月，以上檢測試劑盒均由貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)(蘇州)有限公司提供。

1.6主要儀器

貝克曼AU480全自動生化分析系統(tǒng)；美國FLUKOF6/10超細勻漿器；美國Bio-TEK微孔板掃描分光光度計(MQX200)；上海安亭TGL-16G型臺式高速離心機。

2 方法

2.1選模

35只Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)1周。于第2周起，根據(jù)體重隨機分為正常對照組(10只)和造模組(25只)，正常對照組喂飼基礎飼料、造模組喂飼高脂高糖飼料。誘導4周后，造模組大鼠腹腔注射鏈脲霉素(STZ)30mg·kg-1并繼續(xù)高脂飲食，正常對照組等體積腹腔內注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液并繼續(xù)正常飲食。第8周末，大鼠禁食不禁水過夜，測定以下2型糖尿病指標：空腹血糖(FBG)含量及胰島素含量，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。以FBG>11.1mmol·L-1且ISI降低認為模型建立成功。同時用全自動生化分析系統(tǒng)測定脂肪肝指標，即肝功能指標(ALT、AST)，測定方法分別為乳酸脫氫酶法和蘋果酸脫氫酶法。

將造模成功的大鼠(20只)隨機分為模型組、鹽酸二甲雙胍組，每組10只。鹽酸二甲雙胍組大鼠灌胃(ig.)給予200mg·kg-1劑量的藥物，連續(xù)給藥4周。在此期間除正常對照組喂飼基礎飼料外，其余兩組仍喂飼高脂高糖飼料，每周測定大鼠體重。給藥4周，即造模12周后，測定FBG、血胰島素含量等2型糖尿病指標，并利用血糖試紙進行糖耐量試驗(OGTT：分別測定FBG和ig.葡萄糖2g·kg-1后30、60、120、180min的血糖)。測定脂肪肝相關指標：利用全自動生化儀測定肝功指標；取肝臟組織，稱重，計算肝重指數(shù)(肝重/體重×100)；取部分肝臟組織制備10%肝勻漿，用CHOD-PAP和GPO-PAP法測定肝臟TC、TG含量；另取部分肝臟組織以10%甲醛固定，供病理學檢測使用，病理學檢測評分標準如下：-未見病變；+輕度病變；++中度病變；+++重度病變。流程圖如圖1所示。

圖1 2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠造模實驗流程示意圖

2.2數(shù)據(jù)處理

3 結果

3.1模型的建立結果

3.1.1一般觀察 高脂飼料誘導期間，各組大鼠活動正常。誘導4周后腹腔注射STZ進行造模，造模大鼠出現(xiàn)明顯的體重下降、多飲多尿的糖尿病癥狀。造模期間，模型組體重低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義；模型組大鼠一直持續(xù)多飲多尿的癥狀至實驗結束。實驗期間各組大鼠體重見圖2。

3.1.2造模8周后大鼠各項指標變化

3.1.2.1大鼠空腹血糖、血胰島素含量及胰島素敏感指數(shù)、糖耐量變化 造模8周后，模型組大鼠與正常組大鼠比較，空腹血糖明顯升高，而空腹血胰島素含量無明顯變化，由此換算出胰島素敏感指數(shù)明顯下降(見表1)。

表1 造模8周后大鼠空腹血糖、血胰島素含量及胰島素敏感指數(shù)

注：與正常組比較，***P<0.001。

3.1.2.2 大鼠肝重系數(shù)及血清ALT、AST活性變化 造模8周后，模型組大鼠與正常組大鼠比較，血清中ALT活性明顯升高，而AST活性無明顯變化。表明本次建立的模型大鼠存在一定的肝損傷(見表2)。

表2 造模8周各組大鼠血清ALT、AST活性 U·L-1

注：與正常組比較，*P<0.05。

3.1.3 造模12周后大鼠各項指標變化

3.1.3.1 大鼠空腹血糖、血胰島素含量及胰島素敏感指數(shù)、糖耐量變化 造模12周后，模型組大鼠與正常組大鼠相比，空腹血糖明顯升高，糖耐量曲線下面積(AUCG)明顯增大，空腹血胰島素含量明顯減少，胰島素敏感指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 造模12周(給藥4周)后模型大鼠空腹血糖、血胰島素含量及胰島素敏感指數(shù)、糖耐量的變化

注：與正常組比較，***P<0.001；與模型組比較，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001。

3.1.3.2 大鼠肝重系數(shù)及血清ALT、AST活性變化 造模12周后，模型組大鼠肝重系數(shù)、血清ALT活性明顯升高，與正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義，表明肝損傷在持續(xù)發(fā)生(見表4)。

表4 造模12周(給藥4周)后模型大鼠肝重系數(shù)及血清ALT、AST活性變化

注：與正常組比較，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，▲▲P<0.01。

3.1.4 大鼠肝脂水平 實驗結束時，模型組大鼠與正常對照組比較，肝臟中TC、TG均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，見表5。

表5 造模12周(給藥4周)后模型大鼠肝脂水平的變化 /mg·g-1

注：與正常組比較，***P<0.001；與模型組比較，▲P<0.05。

3.1.5 大鼠肝臟病理檢測結果 實驗結束時，正常組大鼠肝臟未見明顯病理改變。模型組大鼠出現(xiàn)10例(10/10)肝細胞腫脹，其中3例重度病變，6例中度病變，1例輕度病變；7例(7/10)輕度肝細胞脂肪變性；1例(1/10)肝臟內小灶性炎細胞浸潤。表明模型組大鼠出現(xiàn)了以肝細胞腫脹和輕度脂肪變性為主要表現(xiàn)的肝臟病變，見圖3、表6。

注：A.正常組；B.模型組；C.給藥組。圖3 肝臟組織病理切片HE染色(HE×100)

動物號肝細胞腫脹肝細胞脂肪變性炎細胞浸潤其他病變動物號肝細胞腫脹肝細胞脂肪變性炎細胞浸潤其他病變1----16+++--2----17+++--3----18++++--4----19++---5----20++---6----21+++--7----22+---8----23+++--9----24+---10----25++---11+---26++--12+++++-27+++--13+++--28++++-14+++--29----15++++--

注：-表示未見病變；+表示輕度病變；++表示中度病變；+++表示重度病變；正常組：1～10，模型組：11～20，給藥組：21～29。

3.2二甲雙胍對模型大鼠的作用

3.2.1二甲雙胍對模型大鼠空腹血糖、血胰島素含量及胰島素敏感指數(shù)、糖耐量的影響 給藥4周后，二甲雙胍能明顯降低模型大鼠空腹血糖，提高胰島素敏感指數(shù)，并改善模型大鼠糖耐量異常的狀況，與模型組大鼠相比，差異均有統(tǒng)計學意義(見表3)。

3.2.2二甲雙胍對模型大鼠肝重系數(shù)及血清ALT、AST活性的影響 給藥4周后，二甲雙胍能明顯降低模型大鼠血清ALT活性，與模型組大鼠相比，差異有非常顯著性意義；而對AST活性和肝重系數(shù)無明顯影響(見表4)。

3.2.3二甲雙胍對模型大鼠肝脂的影響 給藥4周后，二甲雙胍能明顯降低模型大鼠肝臟TC含量，但對TG含量沒有明顯影響(見表5)。

3.2.4二甲雙胍對模型大鼠肝臟病理的影響 給藥4周后，二甲雙胍組出現(xiàn)8例(8/9)肝細胞腫脹，其中5例中度病變，3例輕度病變；5例(5/9)輕度肝細胞脂肪變性；1例(1/9)肝臟內小灶性炎細胞浸潤(見圖3、表6)。與模型組相比，二甲雙胍組肝細胞腫脹和脂肪變性有所減輕，表明二甲雙胍對模型大鼠肝臟病變有一定的改善作用。

4 討論

2型糖尿病是由遺傳、環(huán)境等多種因素引起的代謝異常綜合征，表現(xiàn)為胰島素分泌相對匱乏或胰島素抵抗。2型糖尿病的發(fā)病率占全球糖尿病患者的90%～95%，目前已成為十分嚴重的威脅人類健康的慢性代謝性疾病[3]。伴隨2型糖尿病產(chǎn)生的并發(fā)癥嚴重威脅人類健康，其中非酒精性脂肪肝是最常見的并發(fā)癥。非酒精性脂肪肝是無酗酒而出現(xiàn)肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的肝病綜合征[4]。目前關于非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制尚未完全明確，與肥胖、糖尿病、高血壓、胰島素抵抗、脂肪酸代謝紊亂和高脂血癥等很多因素都有關[5-6]。因此建立一個穩(wěn)定的2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的動物模型有利于對這兩種疾病各自的發(fā)病機制及兩者之間的相互作用機制進行研究。本研究應用高脂飲食誘導聯(lián)合STZ注射造模，建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型，符合這兩種疾病的臨床病因病機和發(fā)病過程。

長期高脂高糖飲食會造成大鼠胰島素抵抗，胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病基礎[7-8]。STZ分子結構中的葡萄糖基使STZ選擇性地進入胰島β細胞，其解離的自由基可以破壞DNA結構，并抑制DNA多聚酶的活性，細胞內DNA含量減少，從而高度選擇性地損傷大鼠胰島β細胞，造成血糖的明顯上升[2，9]。但是，單純的STZ注射不能維持模型大鼠的持續(xù)高血糖狀態(tài)，同時繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng)造成持續(xù)的胰島素抵抗，從而維持模型的穩(wěn)定[10-11]。我們的研究結果顯示大鼠高糖高脂飲食誘導4周后腹腔注射STZ造模，能使大鼠空腹血糖明顯升高，胰島素敏感指數(shù)明顯下降，并出現(xiàn)體重下降、多飲多尿的糖尿病癥狀，這些癥狀一直持續(xù)至建模12周實驗結束時。然而在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)建模8周時模型組大鼠的胰島素水平并沒有明顯降低，而到了建模12周時才顯著降低?？赡苁怯捎赟TZ注射造成大鼠胰島β細胞部分被破壞，初期出現(xiàn)了胰島素代償性分泌，而隨著造模時間的延長，這種代償作用逐漸消失。同時，與正常對照組比較，造模大鼠肝臟總膽固醇、甘油三酯含量均明顯升高，肝臟病理檢測結果顯示造模大鼠肝臟病變表現(xiàn)為肝細胞腫脹和輕度脂肪變性，同時血清中丙氨酸氨基轉移酶活性明顯升高，表明大鼠模型具有明顯的非酒精性脂肪肝特征。綜上所述，本研究利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ成功建立了2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型。

為了進一步驗證該大鼠模型，本研究利用其評價了常用降糖藥二甲雙胍的作用。二甲雙胍自1957年問世以來，在臨床上作為降糖藥應用已經(jīng)有超過50年的歷史，其治療糖尿病的作用機制復雜，主要包括：可直接抑制肝臟的糖異生作用從而降低空腹血糖[12]；提高肌肉和脂肪組織對葡萄糖的攝取和利用率[13]；減少小腸對葡萄糖的吸收；激活腺苷酸AMP活化的蛋白激酶(AMPK)通路，促進脂肪酸進入線粒體進行脂肪酸β氧化，從而減少脂肪的合成[14]。同時二甲雙胍作為胰島素增敏劑可以增強胰島素與外周組織胰島素受體的親合力，促進葡萄糖的攝取和利用，改善組織對胰島素的敏感性[15]。除了作為降糖藥被廣泛應用，目前二甲雙胍在治療非酒精性脂肪肝、多囊卵巢綜合征、癌癥等方面的潛力也被挖掘出來，逐漸成為研究的熱點。有研究表明二甲雙胍可改善肥胖小鼠肝臟的脂肪變性，對脂肪肝具有一定的治療作用[16]。然而目前二甲雙胍降脂的分子機制不甚明確，可能與腺苷酸活化蛋白激酶AMPK介導的脂肪酸氧化增加和脂肪合成減少有關[17]。本研究結果顯示鹽酸二甲雙胍連續(xù)給藥四周能明顯降低模型大鼠空腹血糖，提高胰島素敏感指數(shù)，改善糖耐量異常的狀況；同時能明顯降低肝臟TC含量。肝臟病理結果顯示，鹽酸二甲雙胍可以改善模型大鼠的肝細胞腫脹和脂肪變性情況，減輕脂肪肝病變。因此可以認為該2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型適合于降糖藥物的篩選和評價研究。并且，此模型造模方法簡單、易復制、模型穩(wěn)定，可以廣泛用于2型糖尿病及其并發(fā)癥非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制研究。

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EstablishmentofRatModelofType2DiabeteswithStreptozotocinandHigh-fatDiet

SUN Le1，PENG Jun2，YANG Runmei1*，XU Lijia1

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Peking Union Medical College，Beijing 100093，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China)

Objective：To establish a rat model of type-2 diabetes with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by streptozotocin (STZ) and high-fat diet.Methods：35 Wistar male rats were randomly divided into two groups：the control group and the model group，which were given the control diet and the high-fat diet respectively.The rats in the model group were induced diabetes by intraperitoneal injection of 30 mg·kg-1STZ after 4 weeks.Then we measured and analyzed the changes of fasting blood glucose level (FBG)，insulin concentrations，and insulin sensitivity index (ISI) at the 8thweek.The rats in the model group that were successfully induced diabetes were further divided into two groups based on FBG：the model group and metformin group.The rats in the metformin group were administered with 200 mg·kg-1metformin for 4 weeks.At the end of the experiment，the oral glucose tolerance test (OGTT) was performed，also the FBG，ISI，hepatic lipid concentrations were detected.Results：The rats in the model group showed the typical symptoms of diabetes：weight loss，polydipsia and polyuria.Moreover，compared to the control group，the FBG significantly increased (P<0.001)and ISI significantly decreased (P<0.001) in the rats of model group at the 8th and 12thweek.At the 12thweek，the AUCG significantly decreased (P<0.001)，and the FBG，serum ALT activity significantly decreased (P<0.01) and hepatic TC concentration obviously decreased (P<0.5) in the metformin group compared with the model.Conclusion：A stable rat model for type-2 diabetes was successfully established by the induction of high-fat diet combined with the injection of STZ.The effect of metformin in the experiment suggests that the model was proper for evaluating the hypoglycemic agent.

Type-2 diabetes；nonalcoholic fatty liver disease；high-fat diet；streptozotocin

協(xié)和青年基金資助項目(3332015142)；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程(2016-I2M-1-012)

] 楊潤梅，副研究員，研究方向：中藥藥理學；E-mail：rmyang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.018

2016-11-22)

*[