肺癌患者血小板中VEGF與TSP-1測(cè)定的臨床應(yīng)用價(jià)值

董行 羅以勤 葉書來(lái)

肺癌患者血小板中VEGF與TSP-1測(cè)定的臨床應(yīng)用價(jià)值

董行 羅以勤 葉書來(lái)

目的 探討血小板中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）與凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）測(cè)定在肺癌進(jìn)展中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)71例最終確診為肺癌的患者及35例健康體檢者的血小板與貧血小板血漿（PPP）中的VEGF與TSP-1水平。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，肺癌未轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移患者血小板中VEGF水平及VEGF/ TSP-1比值均明顯升高（P＜0.05）；肺癌轉(zhuǎn)移患者血小板中VEGF及VEGF/TSP-1比值高于肺癌未轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；肺癌未轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移患者血小板中TSP-1水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；肺癌組與對(duì)照組所有個(gè)體的貧血小板血漿中的VEGF與TSP-1均低于檢測(cè)下限而未能檢出。結(jié)論 肺癌患者血小板中VEGF與TSP-1平衡關(guān)系發(fā)生改變，并且血小板VEGF與VEGF/TSP-1水平有助于反映肺癌的轉(zhuǎn)移情況。

肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 凝血酶敏感蛋白-1 血小板

目前，肺癌的發(fā)病率和病死率迅速上升，已躍居全世界癌癥死因的第一位，嚴(yán)重危及人類的身體健康。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)olkman提出了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成的理論[1]。腫瘤血管的生成依賴于血管形成促進(jìn)因子和抑制因子之間的平衡調(diào)節(jié)[2]。研究發(fā)現(xiàn)外周血血管形成調(diào)節(jié)因子水平能夠反映腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后，所以血管形成調(diào)節(jié)因子有可能成為一種新的腫瘤標(biāo)記物[3]。然而，血液中大部分血管形成調(diào)節(jié)因子來(lái)源于血小板，如血管形成促進(jìn)因子（VEGF）70%以上由血小板釋放，這也就是除具有止血、組織修復(fù)等功能外，血小板在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的原因之一[4]。血管形成相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白存在于血小板α顆粒，避免血液中各種血漿蛋白酶的降解[5]，因此相對(duì)于血清、血漿，檢測(cè)血小板中此類蛋白能更好地反映腫瘤進(jìn)程中血管生成調(diào)節(jié)因子的真實(shí)水平[5，6]。本研究通過(guò)檢測(cè)肺癌患者血小板中具有代表性的VEGF和抑制因子（TSP-1）的水平，初步探討血小板中血管形成調(diào)節(jié)因子在肺癌進(jìn)展中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

1 對(duì)象

1.1 肺癌組：按照最新的肺癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集2015年5月～2016年5月的肺癌患者71例，男44例，女27例。其中肺癌未轉(zhuǎn)移患者33例，年齡32～71歲，平均年齡52.64歲；肺癌轉(zhuǎn)移患者38例，年齡45～79歲，平均年齡62.85歲。

1.2 對(duì)照組：在采集肺癌患者血液標(biāo)本的同時(shí)，在排除具有各種血管病變的疾?。ㄈ缣悄虿　⒏哐獕旱龋┖?，隨機(jī)選取性別、年齡均相近的體檢者35例為對(duì)照組，其中男21例，女14例，年齡41～68歲，平均年齡56.75歲。

2 儀器與試劑 CTAD（枸櫞酸鹽、茶堿、腺苷、潘生?。┛鼓埽ㄉ虾？迫A公司）；Sysmex KX-2100血球分析儀（日本Sysmex公司）；Thermo scientific恒溫離心機(jī)（美國(guó)）；RIPA裂解液（上海碧云天）；CUSABIO ELISA試劑盒（美國(guó)CUSABIO BIOTECH公司）

3 方法

3.1 血標(biāo)本采集：使用CTAD抗凝管采集空腹靜脈血約3ml。CTAD抗凝血用于制備貧血小板血漿和一定濃度的血小板。所采集的血液標(biāo)本須在2h內(nèi)進(jìn)行處理。

3.2 定量血小板的制備：3 mlCTAD抗凝血顛倒混勻后于24℃條件下離心（150 g，10 min）。提取約1ml富血小板血漿（避免吸入紅細(xì)胞）于24℃條件下離心（900 g，20 min）。將上層的貧血小板血漿轉(zhuǎn)移至一個(gè)新EP管中，血小板沉淀通過(guò)含有CTAD的緩沖液清洗2次后，加入一定量的CTAD緩沖液以形成血小板懸液。此懸液通過(guò)Sysmex血球分析儀檢測(cè)血小板濃度后，對(duì)其調(diào)整為2×108/ ml濃度的血小板懸液。編號(hào)并分裝保存于–80℃冰箱待測(cè)。

3.3 貧血小板血漿的提?。河?.2步驟中所獲得的貧血小板血漿，經(jīng)再次離心（900 g，20 min）吸取上層血漿后編號(hào)，并分裝保存于-80℃冰箱中保存待測(cè)。

3.4 血小板、血漿中VEGF與TSP-1水平檢測(cè)：將分裝的血小板懸液和貧血小板血漿從低溫冰箱中取出，置于室溫下充分溶解，在血小板懸液中RIPA裂解液于4℃條件下充分裂解血小板。 然后將裂解后的血小板與血漿在室溫下離心（10 000 g，5 min）。吸取100 ul標(biāo)準(zhǔn)品和離心后的樣本上清加入微量孔中；37℃溫育2 h后棄去反應(yīng)板中的液體，在標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔中分別加入100 ul生物素標(biāo)記抗體，37℃溫育1 h。洗板后，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素抗體100 ul，37℃溫育1 h。溫育洗板后，依序每孔加入底物溶液90ul，37℃避光顯色。30 min內(nèi)，若肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3～4孔有明顯的梯度藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔的濃度及其光密度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)樣本光密度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各個(gè)樣本濃度。將由血小板樣本所得到的濃度換算成每106個(gè)血小板來(lái)表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

結(jié) 果

1 肺癌未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF高于對(duì)照組（P＜0.05），而兩組的血小板中TSP-1水平分別低于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。肺癌轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF高于未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），但血小板中TSP-1在兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，肺癌未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF/ TSP-1比值高于對(duì)照組（P＜0.05），且肺癌轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF/TSP-1比值高于肺癌未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。

表1 肺癌組與對(duì)照組血小板中VEGF、TSP-1檢測(cè)結(jié)果比較

2 肺癌組與對(duì)照組中所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象的貧血小板血漿VEGF與TSP-1水平均低于檢測(cè)限，結(jié)果表明采用CTAD的抗凝血中血小板并沒有發(fā)生活化而釋放VEGF。

肺癌是一種富含豐富血管的腫瘤，其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成。在腫瘤微環(huán)境中，新生血管的生成受到血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的平衡調(diào)控。作為最具有代表性的血管生成促進(jìn)因子，VEGF在促進(jìn)肺癌的血管生成以及肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了重要作用[7]。TSP-1是最早發(fā)現(xiàn)的一種具有代表性的內(nèi)源性血管生成抑制因子[8]。目前，對(duì)于VEGF和TSP-1在肺癌患者血小板中量的變化以及兩者之間的平衡關(guān)系還未見報(bào)道。

VEGF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，肺癌組織及其周圍細(xì)胞也能夠分泌VEGF[9]。因此，在肺癌患者的血循環(huán)中，VEGF升高可能主要來(lái)自于腫瘤組織及其周圍細(xì)胞。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，血小板具有選擇性的吸收血液中血管生成調(diào)節(jié)因子的作用[10]。以血小板為媒介，通過(guò)血小板傳遞VEGF到達(dá)腫瘤的微環(huán)境以促進(jìn)腫瘤的血管生成[11，12]。有研究表明，相對(duì)于血小板外的血漿成份，血小板的α顆粒中存在著各種高濃度的血管形成調(diào)節(jié)蛋白，如VEGF、PDGF、TSP-1等[5]。Peterson等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在血小板中VEGF濃度是相應(yīng)血漿的215倍[5]。因此，在腫瘤患者血小板中VEGF的濃度變化比其對(duì)應(yīng)的血漿濃度變化可能更加敏感。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組和對(duì)照組的所有貧血小板血漿樣本中，VEGF含量均低于試劑盒檢測(cè)下限而未能檢出，可見，采用CTAD的抗凝血中血小板并沒有發(fā)生活化而釋放VEGF。而且腫瘤的存在并沒有影響血漿樣本中VEGF量的變化，這主要是由于血小板選擇性吸收VEGF將其聚集到血小板內(nèi)；其次，在采集血標(biāo)本與提取血小板標(biāo)本時(shí)，血小板并沒有因?yàn)槿藶椴僮鞫鸹罨灾劣卺尫臯EGF到血漿中。表1結(jié)果顯示，肺癌未轉(zhuǎn)移組和轉(zhuǎn)移組血小板中的VEGF含量均明顯高于對(duì)照組，而肺癌轉(zhuǎn)移組血小板VEGF含量高于肺癌未轉(zhuǎn)移組?？梢?，在肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中，VEGF量的變化不僅反映腫瘤的存在和進(jìn)展，而且相對(duì)于貧血小板血漿，VEGF在血小板中量的變化也顯得尤為敏感。

TSP-1作為一種具有代表性的抑制腫瘤血管形成的內(nèi)源性抑制因子[8]。雖然外周血中TSP-1的量與肺癌組織中表達(dá)量的關(guān)系需要進(jìn)一步研究，但本研究結(jié)果顯示，血小板中TSP-1含量在肺癌患者中降低較明顯。此外，TSP-1與VEGF在肺癌患者外周血中的平衡關(guān)系也發(fā)生了較明顯的變化。目前，在血小板α顆粒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在著很多血管形成的促進(jìn)和抑制因子[4]，其中具有代表性的就有VEGF與TSP-1。另外，作為反映血小板是否活化的敏感指標(biāo)，在相應(yīng)的貧血小板血漿中，TSP-1在各組中的水平均低于檢測(cè)限以下?？梢?，在血小板提取的過(guò)程中并沒有發(fā)生活化。

本研究采用CTAD抗凝血來(lái)避免血小板活化，通過(guò)研究血小板中VEGF與TSP-1的含量及其變化來(lái)反映肺癌的血管形成與腫瘤進(jìn)展，以此研究肺癌及其他類型的腫瘤提供了潛在的腫瘤標(biāo)記物。此外，本研究也為如何使用VEGF的抗體作為藥物，以及如何構(gòu)建含有高濃度TSP-1的血小板來(lái)治療腫瘤提供了依據(jù)。

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The Application Value of Platelet VEGF and TSP-1 Detections in the Lung Cancers

DONG Hang，LUO Yi-qin，YE Shu-lai.
Department of Laboratory Medicine，Anhui Provincial Hospital（Southern Branch）230001

Objective To investigate the clinical application of platelet vascular endothelial growth factor（VEGF）and TSP-1 determination in the progression of lung cancers. Methods The levels of VEGF and TSP-1 in platelets and platelet-poor plasma（PPP）in 71 patients with lung cancers and 35 healthy controls were determined by ELISA method. Results The levels of platelet VEGF and VEGF/TSP-1 in patients with unmetastatic lung cancers and metastatic lung cancers were significantly higher than those in healthy controls （P＜0.05）； the levels of platelet VEGF and VEGF/ TSP-1 in patients with metastatic lung cancers were significantly higher than those in patients with unmetastatic lung cancers （P＜0.05）. Moreover，the levels of platelet TSP-1 in patients with unmetastatic lung cancers and metastatic lung cancers were remarkably lower than those in healthy controls （P＜0.05）. However，the PPP VEGF and TSP-1 in the patients and control group were undetactable （＜7.18 pg/ml）. Conclusions The balance between the levels of VEGF and TSP-1 is shifted in the peripheral blood of patients with lung cancers，and the levels of platelet VEGF and VEGF/TSP-1 will help to reflect the progression of lung cancers.

Lung cancer VEGF TSP-1 Platelet

R734.2 R446.11

A

1671-2587（2017）04-0397-04

2016-11-25）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.025

230001 安徽省立醫(yī)院南區(qū)檢驗(yàn)科

董行（1984–），男，安徽宿松人，檢驗(yàn)師，主要從事血液病檢驗(yàn)診斷，（E-mail）258028284@qq.com。