益生乳酸菌的生理特性研究及其在發(fā)酵果蔬飲料中的應(yīng)用

杭 鋒， 陳 衛(wèi)

(1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436； 2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

益生乳酸菌的生理特性研究及其在發(fā)酵果蔬飲料中的應(yīng)用

杭 鋒1,2， 陳 衛(wèi)2,*

(1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436； 2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

作為世界上最大的水果蔬菜生產(chǎn)國(guó)家之一，中國(guó)的水果蔬菜資源非常豐富，但其鮮銷狀況卻不容樂觀。此外，隨著生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，人們逐漸接受益生乳酸菌發(fā)酵技術(shù)開發(fā)的新型發(fā)酵果蔬飲料，這主導(dǎo)了果蔬飲料發(fā)展的方向。研究評(píng)價(jià)了不同種屬乳酸菌的耐酸性和耐膽鹽能力，得到5株能較好適應(yīng)人體胃腸環(huán)境的菌株，并應(yīng)用于復(fù)合果蔬汁的快速發(fā)酵。通過(guò)感官評(píng)定，確定了混合果蔬汁的優(yōu)化比例。通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件并進(jìn)行單菌發(fā)酵和混合菌種發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5株乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的pH值均有大幅下降，酸度增加；發(fā)酵果蔬汁儲(chǔ)藏第1周出現(xiàn)酸的轉(zhuǎn)化；混合菌株發(fā)酵產(chǎn)品的酸度幾乎是單一菌株發(fā)酵產(chǎn)品的2倍，酸的轉(zhuǎn)化發(fā)生在冷藏第2周。

復(fù)合果蔬汁； 發(fā)酵果蔬飲料； 乳酸菌； 生理特性； 發(fā)酵工藝

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)主要包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和明串珠菌屬(Leuconostoc)，其概念為一類能代謝碳水化合物，并在代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)的總稱。多數(shù)的乳酸菌在世界范圍內(nèi)被公認(rèn)為“generally recognized as safe(GRAS)”等級(jí)的食品微生物[1]，已廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)的各個(gè)方面。最初，生活在人體腸道，可控制腸道微生態(tài)平衡，對(duì)宿主健康發(fā)揮有益作用的活性微生物，被命名為“益生菌(probiotics)”。益生菌這個(gè)詞匯來(lái)自于另一個(gè)詞匯“抗生素”?，F(xiàn)在聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)將益生菌定義為當(dāng)攝入一定量時(shí)，能對(duì)宿主產(chǎn)生有益效果的具有繁殖能力的微生物菌體[2]。然而并不是所有乳酸菌都能表現(xiàn)出益生菌的特性，需要達(dá)到足夠的活菌數(shù)才能發(fā)揮出其卓越的益生功能，所以乳酸菌的益生功能和菌株種類以及活菌數(shù)量有著密切關(guān)系[3-4]。食品中最為常用的是兩種乳酸菌：乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。其他的微生物如乳球菌(Lactococcus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、鏈球菌(Streptococcus)、芽胞桿菌(Bacillus)也是益生菌的重要組成部分[5]。

在國(guó)際益生菌研究領(lǐng)域，近幾十年來(lái)，乳酸菌發(fā)酵飲品的消費(fèi)量日益龐大，呈倍數(shù)遞增，市場(chǎng)占有率也在與日俱增。研究表明，如今發(fā)酵乳酸菌飲料在飲料制品市場(chǎng)占有將近90%的份額，但遺憾的是，這其中大多數(shù)是被日本和西方國(guó)家占有，比如美國(guó)就占了33%的份額。在國(guó)內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵奶飲料銷售額在2005～2010年增長(zhǎng)量竟然高達(dá)73%。這些數(shù)據(jù)表明乳酸菌發(fā)酵飲料在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的發(fā)展前景十分廣闊，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力也很強(qiáng)，我們要抓住市場(chǎng)機(jī)遇，挖掘乳酸菌飲料的發(fā)展?jié)摿?。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的原料，不再僅僅局限于乳制品，變得越來(lái)越多樣化，可為糧食、果蔬、海洋資源和野生資源的一種或多種[6-8]。也可開發(fā)具有特殊功能的乳酸菌發(fā)酵飲品，強(qiáng)化其保健功能。同時(shí)開發(fā)新型發(fā)酵劑也是日后研究的重點(diǎn)方向。復(fù)合果蔬汁發(fā)酵飲料是果蔬原料經(jīng)適當(dāng)處理得到果肉與汁液，接種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵制得的飲品，富含多種維生素和礦物質(zhì)，具有良好的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生乳酸和多種風(fēng)味物質(zhì)，在保留原有果蔬特有風(fēng)味的同時(shí)，賦予其全新的保存性能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-10]。我國(guó)水果和蔬菜資源十分豐富，但具有時(shí)令性，保藏加工能力低，鮮銷狀況比較嚴(yán)峻的缺點(diǎn)，造成部分果蔬原料的浪費(fèi)。通過(guò)乳酸菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，不但解決了資源浪費(fèi)，而且果蔬乳酸菌飲料作為當(dāng)前新興的保健飲料，已然成為一個(gè)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。因此，研究根據(jù)蘋果、胡蘿卜、番茄、黃瓜、山楂和山藥等的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，開發(fā)生產(chǎn)相應(yīng)的乳酸菌飲料具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)槿樗峋嬃系拈_發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1原料

蘋果、胡蘿卜、番茄、黃瓜、山楂、山藥均采購(gòu)于無(wú)錫市歐尚超市高浪路店。

乳酸菌菌種(發(fā)酵乳桿菌T3、鼠李糖乳桿菌237、植物乳桿菌ST-Ⅲ、干酪乳桿菌30和嗜酸乳桿菌137)均來(lái)自于江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2儀器

梅特勒- 托利多儀器有限公司的pH計(jì)和EL3002型電子天平，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的GRP- 9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱和DGG- 9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，日本ALP公司的CL- 40M全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋，海爾集團(tuán)的生物安全柜，日本島津公司的GCMS- QP2010型氣相色譜儀，賽默飛世爾科技的MULTISCAN GO型全波長(zhǎng)自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

研究根據(jù)蘋果、胡蘿卜、番茄等的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn), 結(jié)合乳酸菌的益生功能，旨在開發(fā)蘋果、胡蘿卜、番茄、黃瓜、山楂、山藥等的乳酸菌飲料。

1.2.1混合汁比例的確定

實(shí)驗(yàn)以蘋果、胡蘿卜、番茄、黃瓜為主要實(shí)驗(yàn)原料，同時(shí)輔助添加藥食同源的山楂和山藥2種原料，對(duì)6種果蔬的混合果蔬汁進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵?；旌瞎咧?，各種果蔬的添加比例各不相同，營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味也各異。果蔬汁的配比對(duì)發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)狀況有較大影響；混合果蔬汁經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵后，風(fēng)味和成分會(huì)發(fā)生顯著改變，但原有的果汁風(fēng)味也會(huì)有所保留，因此混合果蔬汁發(fā)酵前需要對(duì)果蔬汁的組成配比進(jìn)行優(yōu)化，選出口感風(fēng)味、色澤營(yíng)養(yǎng)俱佳的混合果蔬汁飲品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.1 蘋果汁、胡蘿卜汁、番茄汁、黃瓜汁、山楂汁的混合比例

胡蘿卜汁呈現(xiàn)鮮艷的橘紅色，添加量過(guò)多過(guò)少，對(duì)混合果蔬汁的顏色有較大的影響。番茄汁含有乳酸菌生長(zhǎng)繁殖的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，過(guò)少不利于乳酸菌的發(fā)酵，過(guò)多則會(huì)有較重的番茄味，遮蓋其他果蔬的風(fēng)味。分別將上述5種果汁進(jìn)行不同比例的混合，以感官評(píng)分篩選出色澤優(yōu)良、風(fēng)味較佳、組織狀態(tài)良好的混合汁比例。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表1(總計(jì)100分)。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)1

1.2.1.2 山藥汁添加的比例

山藥汁呈現(xiàn)乳白色，淀粉含量較高，淀粉的高溫糊化會(huì)影響果汁的組織狀態(tài)。在混合汁中添加2%，5%，10%的山藥汁，對(duì)滅菌后的混合汁風(fēng)味和組織形態(tài)進(jìn)行感官評(píng)分，選出最適宜的山藥汁添加量，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2(總計(jì)100分)。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)2

1.2.2菌種的活化

為了保證發(fā)酵菌株的活性，必須將菌種活化3代。實(shí)驗(yàn)中菌種活化采用將保藏狀態(tài)的菌種接入MRS培養(yǎng)基中，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)從而獲得活力旺盛、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物的方法。保藏狀態(tài)的菌種一般需要培養(yǎng)2～3代，使其逐步適應(yīng)環(huán)境，便于后期發(fā)酵?；静襟E：將保藏狀態(tài)的菌種置于室溫狀態(tài)；吸取50 μL的原始菌液接種至5 mL的MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；吸取第一代的培養(yǎng)物50 μL至新的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，即得到活化菌種。

1.2.3發(fā)酵條件的確定

由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，蔗糖量(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)對(duì)混合果蔬汁的發(fā)酵結(jié)果均有影響。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三水平四因素的正交試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定混合汁中的活菌數(shù)、pH值、酸度，并進(jìn)行感官評(píng)分，確定發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化工藝參數(shù)，因子水平對(duì)照表見表3，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表4。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

表4 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)3

1.2.4單一菌種和混菌發(fā)酵

優(yōu)化發(fā)酵條件下，分別向混合汁中接入5種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)、pH值，并進(jìn)行感官評(píng)分，每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

優(yōu)化發(fā)酵條件下，根據(jù)單菌發(fā)酵結(jié)果，隨機(jī)選擇5組菌種復(fù)配方案(T3+237、ST-III+30、ST-III+137、30+237、5種)進(jìn)行混菌發(fā)酵，根據(jù)感官評(píng)分確定較優(yōu)復(fù)配菌種組合。

1.3 分析方法

1.3.1總酸測(cè)定

總酸含量測(cè)定(以乳酸計(jì))采用酸堿滴定的方法[11]。具體操作步驟：吸取混合汁發(fā)酵液 20 mL，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，邊滴定邊用磁力攪拌器攪拌，同時(shí)測(cè)定pH值，滴定至pH值8.2，立刻記下消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，按式(1)計(jì)算混合汁發(fā)酵液中的乳酸含量：

(1)

式中：C為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V為滴定至pH值8.2時(shí)消耗的NaOH溶液的用量， mL；K為乳酸轉(zhuǎn)化系數(shù)，0.09 mL/mmol；W為吸取的發(fā)酵液的量，mL。

1.3.2感官評(píng)定評(píng)分方法

10位有品嘗經(jīng)驗(yàn)的老師和研究生作為評(píng)價(jià)員進(jìn)行品評(píng)并打分，感官總評(píng)分取所有指標(biāo)的評(píng)分之和，將總分平均即為感官評(píng)分。

1.3.3乳酸菌計(jì)數(shù)

在無(wú)菌條件下吸取樣品100 μL，轉(zhuǎn)移至900 μL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，將加有樣品的MRS液體培養(yǎng)基搖勻，再?gòu)募佑?00 μL樣品的試管中吸取100 μL轉(zhuǎn)移至另一已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中(900 μL)，重復(fù)此過(guò)程直至稀釋到所需濃度。吸取一定濃度的菌液50 μL均勻涂布在加有固體MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，按式(2)計(jì)算活菌數(shù)：

樣品活菌數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×2。

(2)

1.3.4pH值的測(cè)定

用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果應(yīng)用ANOVA(Tukey’s)的方法進(jìn)行顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，隨后應(yīng)用Origin 8.6進(jìn)行結(jié)果圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合汁比例分析

2.1.1蘋果汁、胡蘿卜汁、番茄汁、黃瓜汁、山楂汁混合比例分析

胡蘿卜汁呈現(xiàn)鮮艷的橙紅色，混合汁色澤會(huì)隨著胡蘿卜汁比例的增加而逐漸加深。番茄汁的風(fēng)味較為濃郁，添加量過(guò)大會(huì)遮蓋其余果蔬的風(fēng)味，添加量過(guò)低會(huì)阻礙乳酸菌的生長(zhǎng)。黃瓜汁有獨(dú)有的清香味，適宜的添加量可以中和濃郁的番茄味。蘋果汁和山楂汁的風(fēng)味較清淡，在小范圍內(nèi)對(duì)混合果汁的整體風(fēng)味影響不大。感官評(píng)定結(jié)果如表5。

由表5可以看出，當(dāng)蘋果汁∶胡蘿卜汁∶番茄汁∶黃瓜汁∶山楂汁=40∶25∶15∶15∶5時(shí)，混合汁兼具番茄味和清新的黃瓜味，顏色鮮艷，所以選擇該比例較為合適。

2.1.2山藥汁比例分析

山藥汁呈乳白色，且有較高的淀粉，高溫易糊化，影響果蔬汁的組織形態(tài)。采用在混合汁中逐步添加山藥汁的方法，滅菌后進(jìn)行感官評(píng)分，如圖1。

表5 混合汁感官評(píng)定結(jié)果

圖1 山藥汁添加量對(duì)混合汁風(fēng)味的影響Fig.1 Effects of different Chinese yam addition on mixed juice flavor

從圖1可以看出，隨著山藥汁添加量的增加，混合汁的感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇在混合汁中加入2%的山藥汁。

通過(guò)兩次感官評(píng)分,適當(dāng)調(diào)整除山藥外的5種果蔬汁比例，得出混合汁較優(yōu)的比例為蘋果汁∶胡蘿卜汁∶番茄汁∶黃瓜汁∶山楂汁∶山藥汁=38∶25∶15∶15∶5∶2。

2.2 發(fā)酵條件分析

為了確定混合汁最佳發(fā)酵工藝條件，查閱文獻(xiàn)可知，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、蔗糖量均會(huì)影響混合汁的發(fā)酵。所以，以蔗糖量(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)為考察因素，以混合汁發(fā)酵液的感官評(píng)分為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)5種菌的混合汁發(fā)酵工藝進(jìn)行四因素三水平的L9(34)試驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值、酸度和活菌數(shù)。

發(fā)酵乳桿菌T3正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。根據(jù)感官評(píng)分，初步選出1，2，5，6為較適宜發(fā)酵乳桿菌T3的發(fā)酵條件。在初選的基礎(chǔ)上，選擇產(chǎn)酸較好，活菌數(shù)較高的2號(hào)、5號(hào)兩組發(fā)酵條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表7。

表6 發(fā)酵乳桿菌T3正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 發(fā)酵乳桿菌T3正交試驗(yàn)的pH值、酸度、活菌數(shù)

植物乳桿菌ST-Ⅲ正交試驗(yàn)結(jié)果見表8。根據(jù)感官評(píng)分，初步選出2，3，5，9為較適宜植物乳桿菌ST-Ⅲ的發(fā)酵條件。在初選的基礎(chǔ)上，選擇產(chǎn)酸較好，活菌數(shù)較高的2號(hào)和9號(hào)兩組發(fā)酵條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表9。

表8 植物乳桿菌ST-Ⅲ正交試驗(yàn)結(jié)果

干酪乳桿菌30正交試驗(yàn)結(jié)果見表10。根據(jù)感官評(píng)分，初步選出2，7，8為較適宜干酪乳桿菌30的發(fā)酵條件。在初選的基礎(chǔ)上，選擇產(chǎn)酸較好，活菌數(shù)較高的2號(hào)和7號(hào)兩組發(fā)酵條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表11。

表9 植物乳桿菌ST-Ⅲ正交試驗(yàn)的pH值、酸度、活菌數(shù)

表10 干酪乳桿菌30正交試驗(yàn)結(jié)果

表11 干酪乳桿菌30正交實(shí)驗(yàn)的pH值、酸度、活菌數(shù)

鼠李糖乳桿菌237正交試驗(yàn)結(jié)果見表12。根據(jù)感官評(píng)分，初步選出1，2，4，6，9為較適宜鼠李糖乳桿菌237的發(fā)酵條件。在初選的基礎(chǔ)上，選擇產(chǎn)酸較好，活菌數(shù)較高的2號(hào)和6號(hào)兩組發(fā)酵條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表13。

表12 鼠李糖乳桿菌237正交試驗(yàn)結(jié)果

表13 鼠李糖乳桿菌237正交試驗(yàn)的pH值、酸度、活菌數(shù)

嗜酸乳桿菌137正交試驗(yàn)結(jié)果見表14。根據(jù)感官評(píng)分，初步選出1，2，3，4，6為較適宜嗜酸桿菌137的發(fā)酵條件。在初選的基礎(chǔ)上，選擇產(chǎn)酸較好，活菌數(shù)較高的2號(hào)和4號(hào)兩組發(fā)酵條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表15。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果極差R分析表明，對(duì)干酪乳桿菌30和發(fā)酵乳桿菌T3，混合汁發(fā)酵的影響因素由大到小依次為B(發(fā)酵溫度)、D(發(fā)酵時(shí)間)、C(接種量)、A(蔗糖量)；對(duì)植物乳桿菌ST-Ⅲ，混合汁發(fā)酵的影響因素由大到小依次為B(發(fā)酵溫度)、A(蔗糖量)、C(接種量)、D(發(fā)酵時(shí)間)；對(duì)鼠李糖乳桿菌237，混合汁發(fā)酵的影響因素由大到小依次為C(接種量)、B(蔗糖量)、D(發(fā)酵溫度)、A(發(fā)酵時(shí)間)；對(duì)嗜酸乳桿菌137，混合汁發(fā)酵的影響因素由大到小依次為A(蔗糖量)、D(發(fā)酵時(shí)間)、B(發(fā)酵溫度)、C(接種量)。在篩選出的2組較優(yōu)發(fā)酵條件中，2號(hào)為適合5種菌的較優(yōu)發(fā)酵條件。所以選擇混合汁的發(fā)酵工藝為A1B2C2D2，即蔗糖量4%，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量4%，發(fā)酵時(shí)間8 h。

表14 嗜酸乳桿菌137正交試驗(yàn)結(jié)果

表15 嗜酸乳桿菌137正交試驗(yàn)的pH值、酸度、活菌數(shù)

2.3 單一菌種發(fā)酵分析

優(yōu)化發(fā)酵條件下，在混合汁中分別接種經(jīng)活化的嗜酸乳桿菌137、植物乳桿菌ST-Ⅲ、發(fā)酵乳桿菌T3、干酪乳桿菌30、鼠李糖乳桿菌237進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵和儲(chǔ)存過(guò)程中混合汁pH值、酸度和感官評(píng)分的變化。

5種乳酸菌發(fā)酵0～8 h，pH值均有大幅下降，從6.07降至4.00左右，其中干酪乳桿菌的降幅最為明顯，從6.07降至3.71(見圖2)。冷藏8～20 h，除發(fā)酵乳桿菌T3外，其余4種乳酸菌的pH值基本維持穩(wěn)定。冷藏20 h～1周，發(fā)酵果蔬汁的pH值有顯著上升，增幅最大的是發(fā)酵乳桿菌T3，從3.35增加至4.92。冷藏1～2周，5種菌的pH值均有明顯下降。

圖2 單一菌種發(fā)酵pH值的變化Fig.2 pH alteration of single strain

5種菌的酸度隨著時(shí)間的變化總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在冷藏2周后達(dá)到最高點(diǎn)；其中干酪乳桿菌30的酸度變化最為明顯，從0.81%增加至4.22%。結(jié)果如圖3。

圖3 單一菌種發(fā)酵酸度變化Fig.3 Acidity alteration of single strain

發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物對(duì)感官評(píng)分具有先上升后下降的影響(見圖4)，在4 ℃條件下冷藏20 h時(shí)達(dá)到最高得分，其中，感官評(píng)分得分最高的為鼠李糖乳桿菌237，得分可達(dá)92分。

圖4 單一菌種發(fā)酵感官評(píng)分變化Fig.4 Sensory score alteration of single strain

綜合分析5種菌pH值、酸度、感官評(píng)分的變化，在30 ℃發(fā)酵8 h時(shí)，接入5種菌的混合果蔬汁的pH值均有大幅降低，而酸度和感官評(píng)分則顯著增加，這是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵產(chǎn)酸，使得pH值降低酸度升高，且發(fā)酵產(chǎn)酸以乳酸為主，其酸味較為柔和，風(fēng)味較好。后經(jīng)4 ℃冷藏至20 h時(shí)，5種乳酸發(fā)酵果汁的pH值均有小幅下降，酸度上升不明顯，感官評(píng)分稍有上升。表明發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)酸與醇類反應(yīng)生成脂類物質(zhì)，使果蔬汁具有宜人的芳香風(fēng)味，感官評(píng)分上升。冷藏1周時(shí)，5種乳酸菌的pH值有大幅升高，然而酸度還持續(xù)增加，表明此時(shí)間段內(nèi)發(fā)生了酸的轉(zhuǎn)化，有部分可游離出H+的酸轉(zhuǎn)化為不可游離出H+的酸，因?yàn)樗岫冗^(guò)高，使得口感不佳，感官評(píng)分降低。冷藏2周時(shí)，pH值持續(xù)降低，酸度增加，口感已不適宜食用。

2.4 混合菌種發(fā)酵分析

由于單菌發(fā)酵產(chǎn)物比較單一，而混合乳酸發(fā)酵多為異型乳酸發(fā)酵，終產(chǎn)物較為豐富，所以口感風(fēng)味更佳。

2.4.1混合菌種發(fā)酵過(guò)程中pH值、酸度和感官評(píng)分的變化

根據(jù)單菌發(fā)酵結(jié)果，隨機(jī)選擇5組混菌發(fā)酵組合(T3+237、ST-Ⅲ+30、ST-Ⅲ+137、30+237、5種)在優(yōu)化發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵和儲(chǔ)存過(guò)程中混合汁pH值、酸度和感官評(píng)分的變化，結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 混合菌種發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化Fig.5 pH alteration of mixed strain

由圖5可知，發(fā)酵0～8 h，5組混合菌株的pH值均有大幅下降(6.07降至3.85左右)，其中T3+237組合的降幅最為明顯，從6.07降至3.82。冷藏20 h時(shí)，5組混合菌的pH值持續(xù)下降。冷藏1周時(shí)，發(fā)酵果蔬汁的pH值達(dá)到最低點(diǎn)，降幅最大的是ST-Ⅲ+30組合，達(dá)到2.91。冷藏1周后，5種菌的pH值有顯著回升，2周后pH值基本回復(fù)到冷藏20 h時(shí)的狀態(tài)。

圖6 混合菌種發(fā)酵過(guò)程對(duì)滴定酸度的影響Fig.6 Acidity alteration of mixed strain

由圖6可知，5組混合菌的酸度隨著時(shí)間的變化總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在冷藏兩周時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，其中，T3+237組合的酸度變化最為明顯，從0.81%增加至6.69%。

圖7 混合菌種發(fā)酵過(guò)程對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.7 Sensory score alteration of mixed strain

圖7顯示，發(fā)酵產(chǎn)物的感官評(píng)分結(jié)果具有先上升后下降的變化趨勢(shì)，在4 ℃條件下冷藏20 h時(shí)達(dá)到最感官評(píng)定最高得分，其中，感官評(píng)分最高的為ST-Ⅲ+30組合，達(dá)到89分。

綜合分析5組混合菌株發(fā)酵產(chǎn)物的pH值、酸度、感官評(píng)分的變化，在30 ℃發(fā)酵0～8 h，5組混合菌株的混合果蔬汁的pH值均有大幅降低，酸度和感官評(píng)分顯著增加；8～20 h經(jīng)4 ℃冷藏，pH值均有小幅下降，酸度與感官評(píng)分上升不明顯；冷藏1周時(shí)，5種樣品的pH值持續(xù)下降達(dá)到最低值，然而酸度還持續(xù)增加，因?yàn)樗岫冗^(guò)高，口感較差，感官評(píng)分降低；冷藏2周時(shí)，pH值開始回升至冷藏20 h時(shí)的狀態(tài)，表明酸的轉(zhuǎn)化發(fā)生在此時(shí)間段內(nèi)，有部分可游離出H+的酸轉(zhuǎn)化為不可游離出H+的酸，酸度增加，感官評(píng)分降至最低，已不適宜食用。

2.4.2單一菌株和混合菌株發(fā)酵的差異

比較單菌發(fā)酵和混合菌株發(fā)酵產(chǎn)物pH值、酸度、感官評(píng)分的變化可知，接入混合菌株的發(fā)酵液pH值略低于接入單一菌株的發(fā)酵液，而酸度差異則十分明顯，混合菌株發(fā)酵產(chǎn)品酸度幾乎是單一菌株發(fā)酵產(chǎn)品的2倍，因?yàn)?種菌株混合后存在協(xié)同作用，生長(zhǎng)繁殖速度顯著增加；單一菌株發(fā)酵過(guò)程中，冷藏1周時(shí)即出現(xiàn)酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程，這一過(guò)程在混合菌株發(fā)酵中則延遲到了冷藏第二周。

3 結(jié) 論

以蘋果、胡蘿卜、番茄、黃瓜、山楂和山藥為原料，對(duì)益生乳酸菌發(fā)酵混合果蔬汁進(jìn)行了研制。通過(guò)評(píng)價(jià)耐酸耐膽鹽性質(zhì)，篩選出5株(嗜酸乳桿菌137、植物乳桿菌ST-Ⅲ、干酪乳桿菌30、發(fā)酵乳桿菌T3和鼠李糖乳桿菌237)能較好適應(yīng)人體胃腸環(huán)境的菌株。通過(guò)感官評(píng)定確定混合汁配比為蘋果∶胡蘿卜∶番茄∶黃瓜∶山楂∶山藥=38∶ 25∶15∶15∶5∶2。通過(guò)正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分為指標(biāo)確定優(yōu)化發(fā)酵條件∶蔗糖添加量4%，發(fā)酵溫度30 ℃，乳酸菌接種量4%，發(fā)酵時(shí)間8 h，滅菌條件為105 ℃持續(xù)8 min。在較優(yōu)發(fā)酵條件下，對(duì)單菌發(fā)酵產(chǎn)物的pH值、酸度、感官評(píng)分進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的pH值均有大幅下降，酸度增加?；旌暇N發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混合菌種發(fā)酵產(chǎn)物的pH值略低于單一菌種，混合菌株發(fā)酵產(chǎn)品的酸度幾乎是單一菌株的2倍，酸的轉(zhuǎn)化發(fā)生在冷藏第二周。綜上所述，研究通過(guò)混合果蔬汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得出了較優(yōu)的發(fā)酵工藝條件，并進(jìn)行了單菌種和混合菌種發(fā)酵的差異性研究，從而獲得了具有營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味和保健功效的乳酸發(fā)酵飲品。

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(責(zé)任編輯：張逸群)

ResearchofBeneficialLacticAcidBacteriaandItsApplicationforFermentedFruitandVegetableJuices

HANG Feng1,2, CHEN Wei2,*

(1.StateKeyLaboratoryofDairyBiotechnology/ShanghaiEngineeringResearchCenterofDairyBiotechnology,DairyResearchInstituteofBrightDairyandFoodCoLtd,Shanghai200436,China; 2.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)

China is one of the largest fruit and vegetable producing countries in the world, but the current situation of fresh sales is severe. Since the increasing of people’s living standards and the health awareness, the probiotic lactic acid bacteria fermentation technology has been applied in developing new fermented fruit and vegetable drinks. It has become the main direction of the current fruit and vegetable drinks producing. The experiment researches the ways of screening the probiotic lactic acid bacteria and the processing technology of composite fruit and vegetable juice fermented beverage, main contents and conclusions are as follows. By evaluating the ability of bile and acid resistance of different species of lactic acid bacteria, 5 species which can better adapt to the human gastrointestinal environment have been screened and applied to the rapid fermentation of a mixed drink. The combination of mixed juice was determined through the sensory evaluation. Through orthogonal test, the optimum fermentation conditions were decided. The monoxenie fermentation was conducted under the optimal fermentation conditions. Test results showed that the pH of five kinds lactic acid bacteria fermentation products have reduced significantly while the acidity increased. The acid conversion in fermented juice took place after one week storage. The results of mixed strain fermentation showed that the acidity of the mixed fermentation product was almost as twice as the monoxenie fermentation products, acid conversion occurred after two weeks in a refrigerator.

mixed fruit and vegetable juice; fermented fruit and vegetable juice; lactic acid bacteria; physiological property; fermentation

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.005

2095-6002(2017)04-0033-09

杭鋒，陳衛(wèi). 益生乳酸菌的生理特性研究及其在發(fā)酵果蔬飲料中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(4):33-41. HANG Feng, CHEN Wei. Research of beneficial lactic acid bacteria and its application for fermented fruit and vegetable juices[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):33-41.

2017-05-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31530056)。

杭 鋒，男，高級(jí)工程師，博士，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究；

TS275.5； Q939.9

： A

*陳 衛(wèi)，男，教授，博士，主要從事食品微生物學(xué)方面的研究，通信作者。