卷柏總黃酮提取工藝研究

李慶杰,王懷生,王蓮萍,趙昱瑋,張蓮珠,趙全成

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 長春 130021；2.吉林天藥藥物研發(fā)有限公司,吉林 長春 130012；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,吉林 長春 130021)

卷柏為卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或墊狀卷柏Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草，味辛性平，具有活血通經(jīng)功效，主要用于經(jīng)閉、痛經(jīng)，跌撲損傷等[1]。卷柏資源豐富,民間稱為“九死還魂草、長生不老草、萬年青”等，其中含有豐富的雙黃酮，是該屬植物的特征性成分，主要包括穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮、新柳杉雙黃酮等化合物。雙黃酮屬天然多酚類抗氧化劑，具有抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基的作用，現(xiàn)代藥理研究[2-4]表明，卷柏具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血糖、抗痛風(fēng)、增強人體免疫功能、抗衰老、抗腫瘤等作用，藥材中的黃酮是發(fā)揮藥效的主要成分。本實驗采用正交設(shè)計法，以總黃酮和穗花杉雙黃酮提取率為考察指標(biāo)，對卷柏總黃酮的提取工藝進行了研究。

1 儀器與試藥

LC-2010高效液相色譜儀(日本島津)，SPD 10A型紫外檢測器(日本島津)，UV-1701紫外分光光度計(日本島津)，分析天平(北京賽多利斯BSA224S)，超聲波清洗器(北京天鵬TP-300)，恒溫水浴。卷柏藥材購自吉林省宏檢醫(yī)藥藥材公司，經(jīng)鑒定為卷柏科植物卷柏 Selaginella tamariscina (Beauv.)Spring；穗花杉雙黃酮對照品(自制，高效液相色譜面積歸一化法測定，純度為99.64%)；水為娃哈哈純凈水，甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實驗設(shè)計 選用正交表L9(34),分別以總黃酮和穗花杉雙黃酮提取率作為考察指標(biāo)，對卷柏總黃酮提取過程中影響較大的乙醇濃度(A)、提取次數(shù)(B)、乙醇倍數(shù)(C)提取時間(D)4個因素進行考察，每個因素3個水平，見表1。

表1 因素水平表

2.2 提取方法 稱取藥材9分,每分50 g，按L9(34)正交表實驗，不同濃度乙醇回流提取，提取液濾過合并，減壓回收乙醇濃縮成稠膏狀，乙醇溶解并定容至250 mL容量瓶，作為儲備液。

2.3 紫外分光光度法測定樣品中卷柏總黃酮

2.3.1 供試品溶液制備 精密吸取1.25 mL儲備液至50 mL容量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，吸取稀釋液2.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取穗花杉雙黃酮對照品，精密稱定，加甲醇制成0.52 mg/mL的對照品溶液，精密吸取1.0 mL置10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度，得濃度為0.052 mg/mL的對照品溶液，分別精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻,在330 nm處測定吸光度。以吸光度和質(zhì)量濃度進行線性回歸，得回歸方程Y=62.184X+0.024 2，r=0.999 3。

2.4 高效液相色譜法測定樣品中穗花杉雙黃酮

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agela C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.3%乙酸水(40∶60)，流速1.0 mL/min，檢測波長330 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備 取正交實驗樣品儲備液1.25 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸取濃度為0.52 mg/mL對照品溶液各0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，吸取10 μL，分別注入液相色譜儀測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，穗花杉雙黃酮進樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程：Y=4 000 000X-16 844，r=0.999 7。結(jié)果表明，在0.13～1.3 μg范圍內(nèi)，穗花杉雙黃酮進樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 正交實驗結(jié)果 以總黃酮和穗花杉雙黃酮為指標(biāo)考察結(jié)果相一致，即因素B為主要影響因素，因素A為次要影響因素，因素C、D的不同水平對結(jié)果影響不大,綜合實驗結(jié)果及實際生產(chǎn)中節(jié)約成本的需要，暫定工藝為A3B3C1D1。

2.6 驗證實驗結(jié)果 按照最佳工藝A3B3C1D1因素水平，進行3次驗證實驗，在此基礎(chǔ)上，又追加2個條件進行實驗：A3B4C1D1，增加提取次數(shù)，即加8倍量80%乙醇提取4次，每次1 h。A4B3C1D1，提高乙醇濃度，即加8倍量95%乙醇提取3次，每次1 h。結(jié)果優(yōu)選工藝中總黃酮提取率為96.7%、穗花杉雙黃酮提取率為93.8%,與正交實驗中出現(xiàn)的最佳工藝相當(dāng)，表明該工藝比較穩(wěn)定；在優(yōu)選工藝基礎(chǔ)上增加提取次數(shù)、提高乙醇濃度，均未能顯著增加卷柏總黃酮、穗花杉雙黃酮提取率，綜合上述實驗結(jié)果，確定A3B3C1D1為最佳工藝條件，即每次8倍量80%乙醇，提取3次,提取時間為1 h。

3 討論

根據(jù)文獻[5-7]報道，卷柏總黃酮中含有穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮、新柳杉雙黃酮等多種雙黃酮成分，其中約80%左右為穗花杉雙黃酮，故總黃酮的含量測定選擇穗花杉雙黃酮作為對照品，以保證實驗結(jié)果更準(zhǔn)確客觀。

本實驗采用紫外分光光度法測定總黃酮與高效液相色譜法測定穗花杉雙黃酮相結(jié)合，增加了因素選擇的準(zhǔn)確性和可靠性，為下一步卷柏總黃酮的分離純化打下良好基礎(chǔ)。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

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