響應(yīng)面法優(yōu)化酶解制備核桃多肽工藝

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(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

響應(yīng)面法優(yōu)化酶解制備核桃多肽工藝

陳樹俊,李樂(lè),石玥,胡潔,徐曉霞,李佳益,張君梅,王翠連

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

核桃,多肽,響應(yīng)面法,工藝優(yōu)化,抗氧化活性

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃、萬(wàn)歲子等,屬于胡桃科核桃屬植物[1],不僅富含優(yōu)質(zhì)脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素[2],還有豐富的卵磷脂、氨基酸及不飽和脂肪酸,不含膽固醇,而且味美可生食,可作為多種食品輔料,是一種優(yōu)良的滋補(bǔ)品[3]。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源,其中含有18種氨基酸,精氨酸和谷氨酸含量很高[4],其酶解產(chǎn)物核桃生物活性多肽是目前的研究重點(diǎn)[5],具有濃度高、溶解性好、抗氧化性強(qiáng)等特性[6],是很好的生產(chǎn)高蛋白流體的食品原料,此外,核桃肽還可做發(fā)酵火腿、酸奶以及風(fēng)味酒等發(fā)酵食品的原料或添加劑[7]。已有相關(guān)研究報(bào)導(dǎo):高瑞雄[8]等選用納豆芽孢桿菌對(duì)冷榨核桃粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制得了核桃多肽；宗玉霞[9]以核桃粕為原料,經(jīng)木瓜蛋白酶水解后,得到了核桃多肽水解液飲料；王端[10]等以脫脂核桃粉為原料,對(duì)其進(jìn)行酶解從而成功制備出核桃多肽。目前我國(guó)核桃制品仍以干果及其粗加工品為主[11],營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用程度不高[12]。核桃的深加工產(chǎn)品較少,如何有效的利用核桃的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其藥用成分不僅可以拓展核桃的利用途徑,還可以促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展,提高農(nóng)民收入。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

核桃粉 蛋白含量84.79%,山西大學(xué)生物工程基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室自制;中性蛋白酶(60000 U/g)、酸性蛋白酶(50000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(20000 U/g) 食品級(jí),Solarbio北京索萊寶科技有限公司;酪蛋白磷酸肽CPP(Gly-Gly-Tyr-Arg) Sigma公司;甲醛溶液 36%～40%,成都市科龍化工試劑廠;總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程有限公司;2,2-二苯代苦味?；诫伦杂苫?DPPH·) Sigma公司;氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、鹽酸、三氯化鐵等 均為分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

JYL-c010料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;B25 Series實(shí)驗(yàn)室分散乳化均質(zhì)機(jī) 上海貝而特機(jī)電設(shè)備科技有限公司;WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Labscale TFF System小型切向流超濾系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;全不銹鋼HH-M8八孔恒溫水浴鍋 上海赫田科學(xué)儀器有限公司;電子分析天平 上海卓精公司;SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;81-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器廠;其它為常規(guī)儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磨漿及評(píng)價(jià)指標(biāo) 磨漿過(guò)程能夠使蛋白質(zhì)溶出,這在很大程度上增加了蛋白水解酶的作用位點(diǎn),為后續(xù)酶解提供基礎(chǔ)條件。以蛋白溶出率為指標(biāo),將高蛋白核桃粉與水以一定比例(料液比分別為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22 g/mL)通過(guò)料理機(jī)進(jìn)行攪拌(16000 r/min,30 s),再轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室高剪切分散乳化均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行剪切(18000 r/min,3 min),得到核桃漿。

蛋白質(zhì)質(zhì)量根據(jù)GB/T 5009.5-2010進(jìn)行測(cè)定,按照下式計(jì)算蛋白質(zhì)溶出率。

蛋白質(zhì)溶出率(%)=核桃漿蛋白質(zhì)總質(zhì)量/核桃粉蛋白質(zhì)總質(zhì)量×100

1.2.2 核桃蛋白酶解工藝

1.2.2.1 蛋白酶的選擇 以多肽質(zhì)量濃度和水解度為指標(biāo),在加酶量7000 U/g,溫度45 ℃,pH 7.00,時(shí)間3 h條件下分別用中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)核桃漿進(jìn)行酶解,比較4種酶的酶解效果,選出適宜的蛋白酶。

在酶總量7000 U/g及其它條件不變的前提下,分別將兩種最適蛋白酶按照1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1復(fù)配,對(duì)核桃漿進(jìn)行酶解。蛋白酶在酶解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些苦味肽,因此在確定最適復(fù)配比后與風(fēng)味蛋白酶(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)協(xié)同水解去除苦味,改善口感。

1.2.2.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以多肽質(zhì)量濃度和水解度為指標(biāo),選取pH(6.60、6.80、7.00、7.20、7.40、7.60)、溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(4000、5000、6000、7000、8000、9000 U/g)、時(shí)間(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)4因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。酶解初始條件pH 7.00,溫度45 ℃,加酶量7000 U/g,時(shí)間3.0 h,控制變量法進(jìn)行單因素條件篩選。

1.2.2.3 酶解響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以多肽質(zhì)量濃度和水解度兩個(gè)指標(biāo)為響應(yīng)值,選取pH、溫度、加酶量、時(shí)間4因素,采用Design-Expert V 8.0.6.1軟件進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of central composite experiment

1.2.2.4 蛋白酶解效果指標(biāo)測(cè)定 水解度測(cè)定:氨基酸態(tài)氮含量根據(jù)GB/T 5009.39-2003中甲醛滴定法測(cè)定,按照下式計(jì)算水解度(DH)。

多肽質(zhì)量濃度測(cè)定:用三氯乙酸水溶液(TCA,50 mg/mL)先后配制成0.000、0.172、0.344、0.516、0.688、0.860、1.032、1.204、1.376和1.548 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg(酪蛋白磷酸肽)四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別定容于10 mL容量瓶中,分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液6.0 mL與4.0 mL雙縮脲試劑混合均勻,靜置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液在540 nm下測(cè)定OD值(第一管做空白對(duì)照)。以肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x(mg/mL),OD值為縱坐標(biāo)y制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到公式:y=0.1351x+0.0092,R2=0.9947。

移取2.5 mL樣品溶液,加入2.5 mL 100 mg/mL三氯乙酸(TCA)水溶液,漩渦混合儀上混合均勻,靜置10 min。4000 r/min離心15 min,上清液用50 mg/mL TCA水溶液定容至25 mL容量瓶,搖勻[18-19]。再按照標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,對(duì)照所求標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得出樣品溶液中多肽質(zhì)量濃度(mg/mL)。計(jì)算公式為:

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的多肽質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.2.3 不同分子量核桃多肽制備 將最佳酶解條件下得到的核桃蛋白酶解液12000 r/min離心20 min,取上清液,經(jīng)小型切向流超濾系統(tǒng)依次通過(guò)5、10和30 kDa分子量的超過(guò)濾膜進(jìn)行分離,具體操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行,依次制備分子量為≤5、5～10、10～30和≥30 kDa核桃多肽溶液。

1.3數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Excel和Origin 6.0軟件進(jìn)行分析作圖,各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示,響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析采用Design-Expert V 8.0.6.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1核桃磨漿料液比的確定

如圖1所示，隨料液比增大，蛋白質(zhì)溶出率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20 g/mL時(shí)，蛋白質(zhì)溶出率變化開始趨于平緩，說(shuō)明此時(shí)通過(guò)磨漿大部分核桃蛋白質(zhì)已基本溶出，達(dá)到最佳磨漿效果，再繼續(xù)加大料液比溶液過(guò)稀導(dǎo)致蛋白質(zhì)量濃度過(guò)低不利于后續(xù)酶解操作，綜合考慮選取料液比1∶20 g/mL,此時(shí)蛋白質(zhì)量濃度為3.62 g/100 mL。

圖1 不同料液比對(duì)蛋白質(zhì)溶出率的影響Fig.1 Effect of walnut-to-water on dissolution rate of protein

2.2核桃蛋白酶解工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 蛋白酶的選擇 由圖2可知,從多肽質(zhì)量濃度和水解度兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看,堿性和木瓜蛋白酶的水解效果均高于中性和酸性蛋白酶,經(jīng)中性蛋白酶酶解的核桃漿顏色變暗,且有異味,酸性蛋白酶水解效果較差,故選擇堿性和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)配。如圖3所示,堿性和木瓜蛋白酶的復(fù)配起到了“協(xié)同增效”的作用[21],且在堿性與木瓜蛋白酶復(fù)配比例為1∶1時(shí)多肽質(zhì)量濃度和水解度均達(dá)到最高,因此最佳配比確定為1∶1。由于核桃漿在蛋白酶解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些苦味肽,風(fēng)味蛋白酶的添加可以切斷苦味肽鍵,從而改善蛋白液的口感[21]。圖4為不同風(fēng)味蛋白酶添加量的水解效果,可以明顯看出風(fēng)味蛋白酶添加量從2000 U/g起,再添加酶量并不能提高水解效果,故最終確定風(fēng)味蛋白酶添加量為2000 U/g。

圖2 不同蛋白酶的水解效果Fig.2 Effect of different protease on hydrolysis

圖3 堿性和木瓜蛋白酶不同復(fù)配比例的水解效果Fig.3 Effect of mixing ratios of the alkaline protease and papain on hydrolysis

圖4 風(fēng)味蛋白酶不同添加量的水解效果 Fig.4 Effect of dosage of flavourzyme on hydrolysis

2.2.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 pH對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響 如圖5所示,隨pH增大,多肽質(zhì)量濃度和水解度均呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì),這是由于每一種酶都有其適應(yīng)的pH范圍,偏酸或偏堿都會(huì)破壞酶結(jié)構(gòu),影響酶與底物相互作用[22]。在pH為7.0時(shí)多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最大值7.50 mg/mL,水解度也達(dá)到最大值10.06%,因此選擇最適pH 7.0。

圖5 pH對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.5 Effect of pH on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.2 溫度對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響 如圖6所示,在一定溫度范圍內(nèi),提高溫度會(huì)使多肽質(zhì)量濃度和水解度增加,升溫會(huì)提高分子運(yùn)動(dòng)程度,增大酶與底物的碰撞幾率從而加速酶促反應(yīng);但酶也是蛋白質(zhì),溫度過(guò)高會(huì)破壞酶分子結(jié)構(gòu)從而失活使多肽質(zhì)量濃度和水解度降低,在50 ℃時(shí)多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最大值8.07 mg/mL,水解度達(dá)到最大值11.15%,因此選擇最適溫度50 ℃。

圖6 溫度對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.3 加酶量對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響 如圖7所示,酶解液多肽質(zhì)量濃度和水解度隨加酶量加大而增大,達(dá)到8000 U/g時(shí),變化平緩。原因可能是,酶量的增加能夠促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行,但底物是有限的,當(dāng)酶量達(dá)到飽和時(shí),過(guò)多的酶未能參加反應(yīng),反而給酶解液帶來(lái)雜質(zhì)[6],考慮到節(jié)約成本,提高多肽質(zhì)量的因素,最適酶量定為8000 U/g,此時(shí)多肽質(zhì)量濃度8.69 mg/mL,水解度11.45%。

圖7 加酶量對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.7 Effect of different enzyme volume on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.2.4 時(shí)間對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響 如圖8所示,從2.5 h到3.0 h,多肽質(zhì)量濃度和水解度增加比較明顯,繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間多肽質(zhì)量濃度和水解度變化趨于平緩,這是由于產(chǎn)物濃度的增加抑制了反應(yīng)的進(jìn)行[6]。為了節(jié)省能源、降低成本,在生產(chǎn)過(guò)程中選擇最適時(shí)間3.0 h,此時(shí)多肽質(zhì)量濃度7.77 mg/mL,水解度9.71%。

圖8 時(shí)間對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.8 Effect of different time on peptide mass concentration and degree of hydrolysis

2.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)表2多肽質(zhì)量濃度(Y1)和水解度(Y2)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合后,得到核桃蛋白酶解的多肽質(zhì)量濃度和水解度對(duì)pH(A)、溫度(B)、加酶量(C)、時(shí)間(D)各因素變量的二次多元回歸方程分別為:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and test results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

注:***差異極顯著,p<0.001;**差異高度顯著,p<0.01;*差異顯著,p<0.05。

2.2.4 各因素交互作用的響應(yīng)面分析 根據(jù)各二次回歸方程可以做出響應(yīng)面分析圖,可以直觀反映出各自變量和所擬合的響應(yīng)面形狀對(duì)各響應(yīng)值的影響。

圖9 四因素對(duì)多肽質(zhì)量濃度的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface of four factors on peptide mass concentration

2.2.4.1 各因素交互作用對(duì)多肽質(zhì)量濃度的響應(yīng)曲面分析 各因素交互作用對(duì)多肽質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖9所示,由圖9(a)可知,以加酶量和時(shí)間為中心水平值時(shí),樣品多肽質(zhì)量濃度隨著溫度和pH的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),等高線較密集,且呈現(xiàn)為橢圓形,表明溫度和pH交互作用顯著。由圖9(c)可知,以溫度和加酶量為中心水平值時(shí),樣品多肽質(zhì)量濃度隨pH增加先上升后下降,隨時(shí)間上升而后趨于平緩,等高線呈橢圓形,表明時(shí)間和pH交互作用顯著。

2.2.4.2 各因素交互作用對(duì)水解度的響應(yīng)曲面分析 各因素交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖10所示,由圖10(a)可知,樣品水解度隨著溫度和pH增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),且等高線較為密集,接近橢圓形,說(shuō)明溫度和pH交互作用對(duì)水解度影響顯著。由圖10(e)可知,樣品水解度隨時(shí)間增大而先上升后趨于平緩,等高線接近橢圓形,表明溫度和時(shí)間交互作用對(duì)水解度影響顯著。

圖10 四因素對(duì)水解度的響應(yīng)曲面圖Fig.10 Response surface of four factors on degree of hydrolysis

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Design-Expert優(yōu)化后得到了兩個(gè)模型的最優(yōu)條件:pH7.11,溫度51.36 ℃,加酶量7998.11 U/g,時(shí)間3.05 h,此時(shí)多肽質(zhì)量濃度理論值最高為10.11 mg/mL,水解度理論值為11.72%。為驗(yàn)證最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,考慮到實(shí)際操作條件的可行性,設(shè)定最優(yōu)條件為:pH 7.10,溫度50 ℃,加酶量8000 U/g,時(shí)間3.0 h,在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后測(cè)得多肽質(zhì)量濃度平均值為10.01 mg/mL,水解度平均值為11.45%,與理論值接近,說(shuō)明經(jīng)過(guò)響應(yīng)曲面法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)可靠性較高,與實(shí)際情況相符合,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 不同分子量多肽抗氧化活性比較

2.3.1 不同分子量多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù) 由表4可知,酶解液經(jīng)超濾分離得到4種分子量多肽液,其中≤5 kDa分子量多肽液占多肽液的64.94%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,其次是5～10 kDa、≥30和10～30 kDa分子量多肽。

表4 不同分子量多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 The mass fraction of different molecular peptides

2.3.2 還原力分析 不同分子量多肽還原力均隨多肽質(zhì)量濃度增加而增大,且增加幅度相近,對(duì)多肽質(zhì)量濃度和吸光度值進(jìn)行線性擬合,以多肽質(zhì)量濃度為x,吸光度值為y,得到各分子量多肽還原力的線性回歸方程如表5所示,通過(guò)IC50的對(duì)比,可以得出還原力強(qiáng)弱順序依次是:≤5、10～30、≥30和5～10 kDa分子量多肽。

表5 不同分子量多肽還原力分析Table 5 Determination of reducing power of different molecular peptides

2.3.3 DPPH·清除能力分析 4種分子量多肽的DPPH·清除率均隨多肽質(zhì)量濃度增加而增大,以多肽質(zhì)量濃度為x,DPPH·清除率為y,得到各分子量多肽對(duì)DPPH·清除率線性回歸方程如表6所示,≤5 kDa的多肽增加趨勢(shì)高于其它三種多肽。由表6中IC50的對(duì)比可以得出DPPH·清除能力強(qiáng)弱順序依次是:≤5、≥30、5～10和10～30 kDa分子量多肽。

表6 不同分子量多肽DPPH·的清除能力分析Table 6 Determination of DPPH· scavenging capacity of different molecular peptides

2.3.4 ·OH清除能力分析 以多肽質(zhì)量濃度為x,·OH清除率為y,4種分子量多肽對(duì)·OH清除率線性回歸方程如表7,可以看出≥30 kDa的多肽增加趨勢(shì)不如其它三種多肽,通過(guò)IC50的計(jì)算得出·OH清除能力強(qiáng)弱順序依次是:≤5、5～10、10～30和≥30 kDa分子量多肽。

表7 不同分子量多肽·OH的清除能力分析Table 7 Determination of ·OH scavenging capacity of different molecular peptides

表8 不同分子量多肽的清除能力分析Table 8 Determination of · scavenging capacity of different molecular peptides

2.3.6 總抗氧化能力分析 按照試劑盒方法對(duì)四種分子量多肽進(jìn)行總抗氧化能力的測(cè)定,保證各分子量多肽質(zhì)量濃度均為10 mg/mL,測(cè)定結(jié)果見表9,四種分子量的多肽都有一定的總抗氧化能力,且≤5 kDa的多肽總抗氧化能力最強(qiáng),為14.18 U/mL。

表9 不同分子量多肽總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果Table 9 Total antioxidant capacity measurement results of different molecular peptides

3 結(jié)論與討論

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Optimizationofenzymatichydrolysisofwalnutpeptidebyresponsesurfacemethodology

CHENShu-jun,LILe,SHIYue,HUJie,XUXiao-xia,LIJia-yi,ZHANGJun-mei,WANGCui-lian

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

walnut;peptide;response surface methodology;process optimization;antioxidant activity

2017-02-28

陳樹俊(1964-)，男，本科，副教授，研究方向：食品新工藝與功能食品，E-mail：chenshujun515@163.com。

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(201603D221033-1)。

TS255.6

:A

:1002-0306(2017)16-0142-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.027