小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸和附睪中SOD表達(dá)的影響

王帥，劉奇凡，劉登旺，陳根元，張玲

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸和附睪中SOD表達(dá)的影響

王帥，劉奇凡，劉登旺，陳根元，張玲

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

【目的】研究小花棘豆毒性成分對(duì)家兔睪丸、附睪組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及基因表達(dá)的影響?！痉椒ā繉?8只雄性家兔隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，試驗(yàn)組分別按照Ⅰ組15%(苦馬豆素含量30 mg/kg)、Ⅱ組30%(苦馬豆素含量60 mg/kg)、Ⅲ組45%(苦馬豆素含量90 mg/kg)的比例添加小花棘豆，對(duì)照組僅飼喂苜蓿干草，試驗(yàn)期70 d。分別于攻毒后第14、35、70 d每次每組隨機(jī)采集4只家兔的睪丸和附睪組織，通過羥胺法檢測(cè)SOD活性的變化，real-time PCR檢測(cè)SOD mRNA的表達(dá)，免疫組化和Western Blot檢測(cè)SOD蛋白的表達(dá)?！窘Y(jié)果】從第35 d開始，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組家兔附睪、睪丸中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均極顯著下降(P﹤0.01)，mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，而且其差異性隨中毒時(shí)間的延長(zhǎng)而變化?！窘Y(jié)論】小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔睪丸、附睪中SOD活性與表達(dá)異常，且與小花棘豆中毒呈現(xiàn)一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)。

小花棘豆；家兔；睪丸；附睪；超氧化物歧化酶

0 引 言

【研究意義】小花棘豆(OxytropisglabraDC)是新疆南疆地區(qū)分布廣泛，危害嚴(yán)重的有毒植物，放牧家畜在冬季及初春因飼草不足而被迫大量采食從而導(dǎo)致中毒，其中約50%的中毒家畜死亡[1]。中毒家畜主要表現(xiàn)為繁殖機(jī)能障礙，研究表明中毒動(dòng)物的卵巢、睪丸等器官指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組，且均與小花棘豆中毒極顯著相關(guān)，目前放牧家畜小花棘豆中毒已嚴(yán)重危害南疆地區(qū)草原畜牧業(yè)的發(fā)展[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，小花棘豆中毒可通過影響高爾基體和溶酶體中的α-甘露糖苷酶的活性與表達(dá)，造成細(xì)胞中甘露糖蓄積，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[3,4]，進(jìn)一步研究表明其可通過影響細(xì)胞中p53、Bcl-2和Bax的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而且這種損傷作用與中毒動(dòng)物抗氧化機(jī)能受損有關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6-8]小花棘豆中毒導(dǎo)致的動(dòng)物細(xì)胞空泡變性與自由基引起的空泡變性有一定的相似性，而且中毒動(dòng)物表現(xiàn)為抗氧化酶活性下降，自由基含量升高，血液運(yùn)氧能力嚴(yán)重受損，表明小花棘豆毒性成分可顯著影響動(dòng)物機(jī)體的抗氧化機(jī)能。【本研究切入點(diǎn)】超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是動(dòng)物機(jī)體清除體內(nèi)自由基、降低脂質(zhì)過氧化的重要酶之一。根據(jù)SOD結(jié)合金屬離子的不同，將其分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD、Fe/Zn-SOD和Fe/Mn-SOD 6種類型，其中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在細(xì)胞中廣泛存在，是維持氧自由基平衡的重要金屬酶。但目前有關(guān)小花棘豆毒性成分對(duì)動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶表達(dá)的影響未見報(bào)道。研究小花棘豆毒性成分對(duì)家兔睪丸、附睪組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及基因表達(dá)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究小花棘豆中毒家兔睪丸及附睪中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD mRNA及蛋白表達(dá)的變化，明確小花棘豆中毒對(duì)雄性家兔繁殖器官的損傷機(jī)制，為動(dòng)物小花棘豆中毒的防治提供。

1 材料與方法

1.1 材 料

小花棘豆采自和田地區(qū)策勒縣，取地上部分，樣品為風(fēng)干樣。

總SOD(T-SOD)檢測(cè)試劑盒，SOD分型(Cu/Zn、Mn)試劑盒，南京建成生物科技有限公司；家兔SOD抗性一抗，英國(guó)Abcam；SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，博士德公司；總RNA提取試劑盒，Real-time q PCR試劑盒， TAKARA(大連)有限公司。

5810R型高速冷凍離心機(jī)，5331型PCR儀，Realplex2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorff；CX31型生物顯微鏡，日本Olympus； DSC型切片機(jī)，HI1220型溫控烤片臺(tái)，德國(guó)Leica；Trans-Blot Turbo型半干轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方 法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理

雄性家兔48只，體質(zhì)量(2.0±0.1) kg，平均分為對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組僅飼喂青苜蓿干草，3個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂摻入小花棘豆15%、30%和45%(按氣相色譜法計(jì)算苦馬豆素含量分別為30、60和90 mg/kg[9])的混合干草，試驗(yàn)期70 d。試驗(yàn)第14 d、第35 d和第70 d各組分別剖殺4只家兔取睪丸及附睪，部分組織勻漿后檢測(cè)SOD活性，部分組織于Bouin’s 液固定后進(jìn)行免疫組化染色，部分組織用于Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)。

1.2.2 小花棘豆中毒家兔睪丸、附睪中SOD活性的檢測(cè)

將家兔睪丸、附睪組織按1∶9(m/v)制備組織勻漿液，1 500 r/min離心后取上清，按照檢測(cè)試劑盒說明書步驟加入試劑，渦旋混勻，37℃孵育40 min，加入顯色劑顯色后靜置10 min，檢測(cè)OD550值。

1.2.3 Real-Time q PCR檢測(cè)小花棘豆中毒家兔睪丸、附睪中SODmRNA表達(dá)水平

試驗(yàn)所用引物參考GenBank中公布的家兔T-SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和β-actin基因序列，利用Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)，引物由TAKAEA(大連)有限公司合成，引物信息見表1。利用試劑盒提取家兔睪丸及附睪細(xì)胞總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：RT Primer Mix 1.0 μL，Prime Script?RT Enzyme Mix I 1.0 μL，Prime Script?Buffer 5× 4.0 μL， RNA提取液10.0 μL，ddH2O 4.0 μL，合計(jì)20.0 μL；反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time q PCR反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix ExTaqTM 2× 10.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye II 50× 0.4 μL，cDNA液2.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL，合計(jì)20.0 μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s， 95℃變性5 s，60℃退火34 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。表1

表1 引物設(shè)計(jì)

Table 1 Primer design

項(xiàng)目Item引物和探針序列(5＇-3＇)Primerandprobesequence(5＇-3＇)產(chǎn)物大小(bp)Sizeofproduct(bp)GeneBank登錄號(hào)AccessionNo．T-SOD上游(Upstream)：AATGCCCGCCAAAGCAGTT下游(Downstream)：TTAAATCTTGGCCAAGCCAAT497BC002066Cu/Zn-SOD上游(Upstream)：GAGCCTTTCCCCCGAGTCAT下游(Downstream)：GTTCACCTTCAGTCAGCCCT152FJ546075Mn-SOD上游(Upstream)：GTGGGCCGCTCTAGGCACCA下游(Downstream)：CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG245NM＿017050β-actin上游(Upstream)：ATTAACGCGCAGATCATGCAG下游(Downstream)：TTTCAGATAGTCAGGTCTGACGTT483X02231

1.2.4 免疫組化檢測(cè)小花棘豆中毒家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)

常規(guī)石蠟包埋家兔睪丸和附睪組織，切片厚度0.5 μm，然后按照試劑盒說明書，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，甲醇-H2O2處理，抗原修復(fù)，胎牛血清封閉，加入兔抗性一抗，加入鼠抗兔二抗，加入SABC復(fù)合物反應(yīng)后進(jìn)行DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。同時(shí)以 PBS取代一抗作為陰性對(duì)照，鏡檢觀察。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)小花棘豆中毒家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)水平

提取家兔睪丸和附睪組織中的蛋白，采用4%的濃縮膠和15%的分離膠，樣品中加入1/5體積的5×Loading buffer，煮沸 10 min，SDS-PAGE電泳后將膜蛋白轉(zhuǎn)移到 NC 膜上，TBST稀釋脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育(4℃)過夜，PBST洗滌后二抗避光孵育1 h(室溫)，PBST 洗滌后ECL顯色，拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA方法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸、附睪中SOD活性的影響

小花棘豆攻毒可導(dǎo)致家兔睪丸、附睪組織中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性顯著下降。第14 d時(shí)試驗(yàn)I組和試驗(yàn)II組家兔睪丸、附睪組織中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)III組家兔睪丸、附睪組織中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；第35 d時(shí)和第70 d時(shí)所有試驗(yàn)組家兔睪丸、附睪組織中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。小花棘豆毒性成分可顯著影響家兔睪丸、附睪組織中的SOD酶活性。表2，表3

2.2小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸、附睪組織中T-SOD基因表達(dá)的影響

研究表明，各試驗(yàn)組家兔睪丸、附睪組織中T-SOD均有表達(dá)。第14 d時(shí)試驗(yàn)I組和試驗(yàn)Ⅱ組家兔睪丸、附睪組織中T-SODmRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P﹤0.05)，但試驗(yàn)III組家兔睪丸、附睪組織中T-SODmRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P﹤0.01)；試驗(yàn)第35 d起所有試驗(yàn)組家兔睪丸、附睪組織中T-SODmRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照(P﹤0.01)。表4，表5

表2 家兔睪丸組織中SOD活性的變化(U)

Table 2 Effects of contents of SOD in testis tissue of rabbits

時(shí)間Time對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIIIT-SOD活性ContentofT-SOD14d63 72±2 93Aa52 61±3 51ABb47 24±4 45ABbc40 02±3 57Bc35d65 28±4 01Aa43 26±4 49Bb40 37±3 66Bbc33 32±4 73Bc70d65 17±2 41Aa36 20±3 06Bb31 41±3 83Bb28 56±2 01BbCu/Zn-SOD活性ContentofCu/Zn-SOD14d37 15±2 26Aa27 78±2 33ABb26 04±2 14ABb24 32±2 31Bb35d38 86±3 17Aa20 55±2 08Bb18 98±1 98Bb16 02±2 11Bb70d36 65±2 54Aa19 86±2 13Bb15 31±1 37Bbc10 34±1 53BcMn-SOD活性ContentofMn-SOD14d22 45±2 87Aa15 31±1 72ABb14 99±1 63ABb13 72±1 27Bb35d22 26±2 53Aa13 56±1 38Bb12 23±1 58Bbc8 56±1 13Bc70d21 77±2 34Aa13 10±1 41Bb11 81±1 70Bbc8 02±1 28Bb

注: 同行數(shù)據(jù)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下同

Note： The difference between data in the same row with the different lowercase letters is significant(P<0.05), and difference between data with the different uppercase letters is very significant(P<0.01),the same as follow

表3 家兔附睪組織中SOD活性變化

Table 3 Effects of contents of SOD in epididymis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIIIT-SOD活性ContentofT-SOD1455 08±3 14Aa44 86±2 85ABb40 71±3 55ABb37 62±2 74Bb3555 62±3 79Aa31 36±3 04Bb32 03±3 76Bb21 22±2 58Bc7055 27±3 65Aa29 85±2 11Bb25 56±2 32Bbc18 46±1 77BcCu/Zn-SOD活性ContentofCu/Zn-SOD1428 96±2 33Aa19 09±2 14ABb18 54±2 96ABb16 44±1 75Bb3526 25±2 76Aa15 36±1 79Bb14 12±1 66Bb12 12±1 51Bb7029 31±2 63Aa14 86±1 73Bb13 71±1 57Bb7 94±1 28BcMn-SOD活性ContentofMn-SOD1420 21±1 97Aa12 42±1 36ABb12 51±1 73ABb11 02±1 43Bb3521 06±2 25Aa10 85±1 26Bb10 03±1 41Bb8 63±1 35Bb7019 66±2 59Aa9 74±1 15Bb8 83±0 97Bb7 62±0 55Bb

表4 家兔睪丸T-SOD基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Table 4 Effects of relative expression of T-SOD mRNA in testis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIII140 0223±0 0069Aa0 0171±0 0047ABb0 0159±0 0063ABb0 0143±0 0072Bb350 0226±0 0071Aa0 0132±0 0067Bb0 0128±0 0054Bb0 0100±0 0036Bb700 0219±0 0068Aa0 0113±0 0044Bb0 0094±0 0026Bb0 0085±0 0024Bb

表5 家兔附睪T-SOD基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Table 5 Effects of relative expression of T-SOD mRNA in epididymis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIII140 0191±0 0054Aa0 0135±0 0022ABb0 0122±0 0028ABb0 0115±0 0042Bb350 0186±0 0037Aa0 0111±0 0017Bb0 0104±0 0024Bb0 0096±0 0019Bb700 0193±0 0060Aa0 0105±0 0015Bb0 0093±0 0016Bb0 0083±0 0014Bb

2.3小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸、附睪組織中Cu/Zn-SOD基因表達(dá)的影響

研究表明，第14 d時(shí)試驗(yàn)I組和試驗(yàn)II組家兔睪丸、附睪組織中Cu/Zn-SODmRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P﹤0.05)，但試驗(yàn)III組家兔睪丸、附睪組織中Cu/Zn-SODmRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P﹤0.01)；試驗(yàn)第35 d起所有試驗(yàn)組家兔睪丸、附睪組織中Cu/Zn-SODmRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照(P﹤0.01)。表6，表7

表6 家兔睪丸Cu/Zn-SOD基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Table 6 Effects on relative expression of Cu/Zn-SOD mRNA in testis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIII140 0112±0 0031Aa0 0080±0 0012ABb0 0073±0 0013ABb0 0061±0 0012Bb350 0119±0 0029Aa0 0062±0 0017Bb0 0057±0 0014Bb0 0050±0 0013Bb700 0117±0 0036Aa0 0056±0 0020Bb0 0049±0 0016Bb0 0038±0 0010Bb

表7 家兔附睪Cu/Zn-SOD基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Table 7 Effects of relative expression of Cu/Zn-SOD mRNA in epididymis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIII140 0097±0 0022Aa0 0062±0 0016ABb0 0057±0 0014ABb0 0051±0 0017Bb350 0096±0 0027Aa0 0053±0 0017Bb0 0044±0 001Bb0 0040±0 0012Bb700 0097±0 0031Aa0 0051±0 0015Bb0 0043±0 0013Bb0 0038±0 0011Bb

2.4小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸、附睪組織中Mn-SOD基因表達(dá)的影響

試驗(yàn)第14 d時(shí)試驗(yàn)I組家兔睪丸、附睪組織中Mn-SODmRNA表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)II組Mn-SODmRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照(P﹤0.05)，試驗(yàn)III組Mn-SODmRNA表達(dá)量極顯著低于對(duì)照(P﹤0.01)；試驗(yàn)第35 d和第70 d時(shí)小花棘豆攻毒家兔睪丸、附睪組織中Mn-SODmRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照(P﹤0.01)。研究表明，小花棘豆毒性成分可顯著降低SOD基因的表達(dá)，影響機(jī)體自由基代謝對(duì)照。表8，表9

表8 家兔睪丸Mn-SOD基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Table 8 Effects on relative expression of Mn-SOD mRNA in testis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIII140 0075±0 0029Aa0 0061±0 0017ABab0 0052±0 0016ABbc0 0039±0 0012Bc350 0072±0 0024Aa0 0038±0 00015Bb0 0031±0 0014Bbc0 0025±0 0006Bc700 0074±0 0022Aa0 0033±0 0009Bb0 0024±0 0010Bb0 0021±0 0006Bb

表9 家兔附睪Mn-SOD基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Table 9 Effects of relative expression of Mn-SOD mRNA in epididymis tissue of rabbits

時(shí)間Time(d)對(duì)照組Controlgroup試驗(yàn)I組TestgroupI試驗(yàn)II組TestgroupII試驗(yàn)III組TestgroupIII140 0083±0 0025Aa0 0065±0 0020ABab0 0052±0 0017ABbc0 0042±0 0014Bc350 0082±0 0017Aa0 0041±0 0013Bb0 0034±0 0012Bb0 0029±0 0007Bb700 0079±0 0023Aa0 0035±0 0008Bb0 0028±0 0006Bb0 0023±0 0004Bb

2.5免疫組化法檢測(cè)小花棘豆中毒家兔睪丸、附睪中SOD基因蛋白定位

SOD基因蛋白定位結(jié)果顯示，對(duì)照組家兔睪丸和附睪頭、附睪體、附睪尾均檢測(cè)到SOD蛋白表達(dá)，其中家兔睪丸管腔上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞(圖1A)和附睪體假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞、附睪頭管腔假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞、附睪尾單層柱狀上皮細(xì)胞(圖1D)均有極為強(qiáng)烈的陽性表達(dá)。小花棘豆攻毒后可見試驗(yàn)I組家兔睪丸細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)含部分淺藍(lán)色的SOD陽性細(xì)胞，其多分布于靠近曲精細(xì)管管壁部(圖1B)，而試驗(yàn)II組和試驗(yàn)III組家兔睪丸細(xì)胞中SOD蛋白顆粒數(shù)量減少，幾乎只分布于曲精細(xì)管的管壁部分(圖1C)。與對(duì)照組相比，小花棘豆攻毒組家兔附睪中SOD陽性細(xì)胞幾乎完全消失(圖1E；圖1F)。研究表明，小花棘豆毒性成分可導(dǎo)致家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)下降，而且這種趨勢(shì)在中、高劑量組中尤為明顯。圖1

圖1 SOD蛋白在對(duì)照家兔(A), 小花棘豆中毒家兔(B、C)睪丸組織及對(duì)照家兔(D), 小花棘豆中毒家兔(E、F)附睪組織中的分布

Fig.1 Distributions of SOD of testis in control group (A) and O. glabra poisoning groups (B,C), SOD of epididymis in control group (D) and O. glabra poisoning groups (E,F)

2.6 Western Blot檢測(cè)小花棘豆中毒家兔睪丸、附睪中SOD基因蛋白表達(dá)

Western Blot顯示，與對(duì)照家兔相比，第14 d時(shí)試驗(yàn)I組與試驗(yàn)II組家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，試驗(yàn)III組家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)極顯著低于對(duì)照(P<0.01)；第35 d和第70 d時(shí)所有試驗(yàn)組家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)均極顯著低于對(duì)照(P<0.01)。小花棘豆毒性成分可顯著影響家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)量，而且與劑量呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。圖2～4

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05；**表示與對(duì)照組比較，P<0.01，下同

Note：*Compared with control group,P<0.05;**Compared with control group,P<0.01,the same as follow

圖2 小花棘豆中毒家兔睪丸中SOD蛋白表達(dá)變化

Fig.2 The change of O.glabra poisoning on the expression of SOD in testis of rabbits

圖3 小花棘豆中毒家兔附睪中SOD蛋白表達(dá)變化

Fig.3 The change of O.glabra poisoning on the expression of SOD in epididymis of rabbits

注：1對(duì)照組睪丸；2試驗(yàn)I組睪丸；3試驗(yàn)II組睪丸；4試驗(yàn)III組睪丸；5對(duì)照組附睪；6試驗(yàn)I組附睪；7試驗(yàn)II組附睪；8試驗(yàn)III組附睪

Note： 1 Testis in control group; 2 Testis in test group I; 3 Testis in test group II; 4. Testis in test group III; 5 Epididymis in control group; 6 Epididymis in test group I; 7 Epididymis in test group II; 8 Epididymis in test group III

圖4 小花棘豆攻毒下家兔睪丸、附睪中SOD蛋白表達(dá)

Fig.4 Effects of O.glabra poisoning on the expression of SOD in testis and epididymis of rabbits

3 討 論

SOD廣泛分布于動(dòng)物體各組織中，是消除超氧陰離子毒性效應(yīng)的最重要的酶，目前研究認(rèn)為SOD可維護(hù)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，以及快速的、特異性的消除O2-對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷，任何利用氧的機(jī)體沒有SOD或相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)機(jī)制是不能生活[10]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔睪丸、附睪中SOD酶活性、基因mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量下降，而且這種變化趨勢(shì)與小花棘豆飼喂量相關(guān)。任有蛇等[11]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物睪丸、附睪中SOD活性極低時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物不孕不育。張春香等[12]通過添加外源性物質(zhì)提高了動(dòng)物附睪中的SOD活性，有效延長(zhǎng)了精液保存時(shí)間，并提高了動(dòng)物受精率。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒可導(dǎo)致雄性家畜精子數(shù)量降低，精子畸形率顯著升高，從而造成繁殖機(jī)能下降，可能與小花棘豆毒性成分導(dǎo)致的繁殖器官抗氧化酶活性下降有關(guān)。

Cu/Zn-SOD是動(dòng)物機(jī)體中一種重要的抗氧化酶，可有效清除機(jī)體超氧自由基，繁殖器官中的Cu/Zn-SOD可保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化物的損傷，維持精子形態(tài)和功能正常[13]。目前有關(guān)植物毒性成分對(duì)雄性動(dòng)物繁殖器官中Cu/Zn-SOD影響的研究較少，早期研究認(rèn)為Cu/Zn-SOD分布于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞漿、精子滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及頂體，并在附睪頭、附睪體和附睪尾中均有分布[14]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒可顯著抑制Cu/Zn-SOD酶活性、基因 mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量，并導(dǎo)致其在動(dòng)物睪丸、附睪中的分布減少，結(jié)果表明，小花棘豆毒性成分可顯著影響Cu/Zn-SOD酶的翻譯、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。張春香等[12]研究發(fā)現(xiàn)Cu/Zn-SOD酶活性與精液中精子數(shù)量、精子活力、精子密度和質(zhì)膜完整性呈正相關(guān)，與精子畸形率呈負(fù)相關(guān)。Waheed等[15]研究認(rèn)為Cu/Zn-SOD酶對(duì)精子發(fā)生過程中的精原細(xì)胞有重要的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)[5]小花棘豆中毒導(dǎo)致家兔睪丸精原細(xì)胞凋亡率極顯著升高，可能與睪丸中Cu/Zn-SOD酶的活性極低相關(guān)。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)的SOD主要有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，二者合成不足或者功能缺陷，都將導(dǎo)致體內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)失衡。目前研究認(rèn)為Cu/Zn-SOD主要是清除在類固醇合成時(shí)產(chǎn)生的超氧游離基清除劑[16]，Mn-SOD則是在兒茶酚胺合成時(shí)的超氧游離基清除劑[17]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒可影響家兔睪丸、附睪中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的翻譯、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，而且對(duì)Cu/Zn-SOD的影響較為顯著；可能與合成和分泌過多的不同激素所產(chǎn)生的超氧游離基堆積有關(guān)。小花棘豆中毒對(duì)機(jī)體抗氧化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用以及細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變，還需要進(jìn)一步的研究探索。

4 結(jié) 論

小花棘豆中毒可顯著影響家兔睪丸與附睪組織中SOD酶的活性與表達(dá)，攻毒35 d后，小花棘豆中毒家兔睪丸、和附睪組織中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均極顯著低于對(duì)照(P<0.01)，T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SODmRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照(P<0.01)。小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔睪丸、附睪抗氧化能力下降，從而導(dǎo)致其繁殖機(jī)能損傷。

References)

[1] 王帥,賈琦珍,陳根元,等. 不同生長(zhǎng)時(shí)期小花棘豆?fàn)I養(yǎng)成分與苦馬豆素含量比較[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2015, 52(8): 1 505-1 509.

WANG Shuai, JIA Qi-zhen, CHEN Gen-yuan, et al. (2015). Comparison of nutritional evaluation and swainsonine ofOxytropisglabraDC during different growing periods [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(8): 1,505-1,509. (in Chinese)

[2]賈琦珍,陳根元,廖秋萍,等. 小花棘豆中毒對(duì)家兔臟器指標(biāo)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014,53(12):2 584-2 586.

JIA Qi-zhen, CHEN Gen-yuan, LIAO Qiu-ping, et al. (2014). Effects ofOxytropisglabraDC poisoning on organ index of rabbits [J].HubeiAgriculturalSciences, 53(12): 2,584-2,586. (in Chinese)

[3]王帥,陳根元,賈琦珍,等.小花棘豆中毒對(duì)家兔丘腦-垂體-性腺軸α-甘露糖苷酶的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016, 44(8):41-48.

WANG Shuai, CHEN Gen-yuan, JIA Qi-zhen, et al. (2016). Effects ofOxytropisglabraDC poisoning on α-mannosidase of Hypothalamus-Pituitary-Gonad in rabbit [J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition) , 44(8): 41-48. (in Chinese)

[4]王帥,陳根元,賈琦珍,等.小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸α-甘露糖苷酶的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015, 35(4):640-644.

WANG Shuai, CHEN Gen-yuan, JIA Qi-zhen, et al. (2015). Effects ofOxytropisglabraDC poisoning on α-mannosidase in rabbit testis [J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 35(4): 640-644. (in Chinese)

[5]王帥, 賈琦珍, 陳根元, 等.小花棘豆中毒對(duì)家兔生精細(xì)胞p53, Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(5): 1 115-1 122.

WANG Shuai, JIA Qi-zhen, CHEN Gen-yuan, et al. (2016). Effects ofOxytropisglabraDC Poisoning on Expression ofp53,Bcl-2 and Bax in spermatogenic cells of rabbits [J].GenomicsandAppliedBiology, 35(5): 1,115-1,122. (in Chinese)

[6]王帥, 陳根元, 張玲,等. 苦馬豆素對(duì)家兔腦組織抗氧化功能的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 33(8): 1 272-1 277.

WANG Shuai, CHEN Gen-yuan, ZHANG Ling, et al. (2013). Effects of swainsonine on antioxydic function of brain tissue in rabbits [J].ChineseJournalofVeterinarySciences, 33(8): 1,272-1,277. (in Chinese)

[7]賈琦珍,陳根元,胡建軍,等. 家兔小花棘豆中毒與血液生化指標(biāo)的相關(guān)性研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2013, 50(11):2 125-2 129.

JIA Qi-zhen, CHEN Gen-yuan, HU Jian-jun, et al. (2013). Study on correlation between serum biochemical indexes andOxytropisglabraDC poisoning in rabbits [J].XinjiangAgriculturalSciences,50(11): 2,125-2,129. (in Chinese)

[8]王帥, 賈琦珍, 陳根元, 等. 小花棘豆中毒對(duì)家兔運(yùn)氧能力和抗氧化損傷的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2014,50(12): 44-46.

WANG Shuai, JIA Qi-zhen, CHEN Gen-yuan, et al. (2014). Study on oxygen transport and anti-oxidative damage ofOxytropisglabraDC poisoning in rabbits[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine, 50(12): 44-46. (in Chinese)

[9]王帥,陳根元,胡建軍,等.氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的含量[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2011, 48(4):723-728.

WANG Shuai, CHEN Gen-yuan, HU Jian-jun, et al. (2011). Determination of Swainsonine inOxytrpisglabraDC in South XinJiang by internal standard gas chromatography [J].XinjiangAgriculturalSciences, 48(4): 723-728. (in Chinese)

[10] Partyka, A., Lukaszewicz, E., & Nizański, W. (2012). Lipid peroxidation and antioxidant enzymes activity in avian semen.AnimalReproductionScience, 134(3-4): 184-190.

[11]任有蛇, 秦小偉, 郭麗娜, 等. 日糧納米鋅水平對(duì)公羊睪丸和附睪Cu-Zn SOD 表達(dá)的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014,45(10): 1 622-1 630.

REN You-she, QING Xiao-wei, GUO Li-na, et al. (2014). Effect of the supplementation of different Nano-zinc levels on expression of copper zinc superoxide in testis and epididymis of ram lambs [J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 45(10): 1,622-1,630. (in Chinese)

[12]張春香, 秦小偉, 郭麗娜, 等. 納米鋅水平對(duì)公羊精液品質(zhì)、抗氧化酶活性及附睪Cu-Zn SOD 表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2015, 48(1): 154-164.

ZHANG Chun-xiang, QING Xiao-wei, GUO Li-na, et al. (2015). Effect of different Nano-Zinc levels in dietary on semen quality, activities of antioxidant enzyme and expression of copper zinc superoxide in epididymis of ram lambs [J].ScientiaAgriculturaSinica, 48(1): 154-164. (in Chinese)

[13] Rowe, M. P., Powell, J. G., Kegley, E. B., Lester, T. D., & Rorie, R. W. (2014). Effect of supplemental tracemineral source on bull semen quality.ProfessionalAnimalScientist, 30(1): 68-73.

[14] Huang, Y., Li, W., Zhao, X., Ding, L., Yu, G., & Dong, F., et al. (2013). Swainsonine differentially affects steroidogenesis and viability in caprine luteal cells in vitro.Theriogenology, 80(1): 41-49.

[15]Waheed, M. M., Gouda, E. M., & Khalifa, T. A. A. (2013). Impact of seminal plasma superoxide dismutase and glutathione peroxidase on cryopreserved buffalo spermatozoa.AnimalReproductionScience,142(3-4):126-130.

[16] Tsunoda, S., Kawano, N., Miyado, K., Kimura, N., & Fujii, J. (2012). Impaired fertilizing ability of superoxide dismutase 1-deficient mouse sperm during in vitro fertilization.BiologyofReproduction, 87(5): 517-527.

[17] Huang, Y., Dong, F., Du, Q., Zhang, H., Luo, X., & Song, X., et al. (2014). Swainsonine induces apoptosis through mitochondrial pathway and caspase activation in goat trophoblasts.InternationalJournalofBiologicalSciences, 10(7):789-797.

EffectsofOxytropisglabraDCPoisoningonExpressionofSuperoxideDismutaseinTestisandEpididymisofRabbits

WANG Shuai, LIU Qi-fan, LIU Deng-wan, CHEN Gen-yuan, ZHANG Ling

(CollegeofAnimalScience,TarimUniversity/KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 The aim of this study was to investigate the effects ofOxytropisglabra(O.glabra) DC poisoning on the activity and expression of the superoxide dismutase (SOD) gene in rabbit testis and epididymis.【Method】48 male rabbits were randomly divided into blank control group and experimental group I, II and III. The dried plant ofO.glabraDC was comminuted, then different amounts of the grass powder (15%, 30% and 45% and the corresponding swainsonine content was 30, 60, 90 mg/kg) were mixed with the forage in 3 experimental groups. The rabbits consumed the forages freely until typical symptoms were observed; the test period was 70 d. 4 rabbits were selected randomly from each group on the 14 th, 35 th and 70 th day respectively; the testis and epididymis were collected. The activity of SOD was measured by hydroxylamine method, the mRNA expression was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time PCR), the level of SOD protein expression was measured by immunohistochemical staining and Western Blot.【Result】The activity of SOD was measured by hydroxylamine method, the mRNA expression was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time PCR), the level of SOD protein expression was measured by immunohistochemical staining and Western Blot. The result showed that the activity of SOD, the expression of SOD mRNA and protein decreased in poisoning rabbits testis and epididymis were very significant lower than that of the control group (P<0.01) form 35 th day.【Conclusion】The results showed thatO.glabraDC has remarkable effects on the expression of SOD mRNA and protein in rabbit testis and epididymis, presenting a certain time dose effect. The activity and expression change in SOD is highly associated withO.glabraDC poisoning and it may play an important role in this process.

short ultivars; growth stages; major gene plus polygene inheritance; genetic analysis

Zhang Ling(1966-), female, native place:Hejian, senior experimentingist, regular college course, Hebei, research field: Grassland ecology.(E-mail)1044763025@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.021

2017-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“小花棘豆中毒對(duì)和田羊抗氧化機(jī)能的影響機(jī)制”(31460678)

王帥(1984-)，男，山西長(zhǎng)治人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物中毒病及毒理學(xué)，(E-mail)wangshuaidky@126.com

張玲(1966-)，女，河北河間人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)椴莸厣鷳B(tài)學(xué)，(E-mail)1044763025@qq.com

S856.9

：A

：1001-4330(2017)08-1540-10

Supported by: National Natural Science Foundation of China "Mechanisms of Antioxidant Ability in Hotan Sheep by Poisoning of Oxytropis glabra DC"( 31460678)