米曲霉YP4-1發(fā)酵豆醬過程中的氨基酸態(tài)氮含量測定

唐國瑾，孫曉東，王輝，武亞楠，劉睿

(大連民族大學 環(huán)境與資源學院，遼寧 大連 116600)

米曲霉YP4-1發(fā)酵豆醬過程中的氨基酸態(tài)氮含量測定

唐國瑾，孫曉東*，王輝，武亞楠，劉睿

(大連民族大學 環(huán)境與資源學院，遼寧 大連 116600)

家庭自制豆醬是東北三省非常普遍的佐菜食品，其制作的方法是利用空氣中的微生物自然發(fā)酵而成。氨基酸態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是判定發(fā)酵食品如醬油、料酒、大醬發(fā)酵品質(zhì)的重要指標。該研究從131份東北三省家庭自制豆醬中分離發(fā)酵功能菌株，利用脫脂牛奶平板初篩，麥麩固體培養(yǎng)基復(fù)篩，采用福林酚法測定蛋白酶活性大小，其中米曲霉YP4-1具有很強的蛋白酶活性。將YP4-1單菌接種于豆醬中發(fā)酵培養(yǎng)90天，采用甲醛值法每隔10天測定豆醬樣品中氨基酸態(tài)氮含量，結(jié)果顯示：發(fā)酵第50天時氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.46 g/mL。

豆醬；蛋白酶活性；米曲霉；氨基酸態(tài)氮

傳統(tǒng)家庭自制豆醬是一種普遍的發(fā)酵食品，距今已有3000多年的歷史，是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡淖舨耸称罚湮兜栗r美、營養(yǎng)豐富、口味獨特、易于消化和吸收[1]。由于家庭自制豆醬開放的制作環(huán)境，導致豆醬表面附著大量真菌，真菌通過代謝可以產(chǎn)生蛋白酶等次生代謝產(chǎn)物[2]。蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一種很重要的酶，被廣泛運用于生產(chǎn)生活的各個方面[3]。蛋白酶可分為外膚酶和內(nèi)膚酶兩大類，外膚酶只對底物的C 端或N 端的膚鍵有作用，內(nèi)膚酶只能水解大分子蛋白內(nèi)部的膚鍵，是真正的蛋白酶[4]。目前，蛋白酶常被應(yīng)用于面包生產(chǎn)、肉類嫩化和皮革工業(yè)的脫毛和軟化等方面[5]。本研究從我國東三省采集到131份豆醬樣品，獲得純培養(yǎng)真菌菌株301份，對這些菌株進行蛋白酶活性的篩選，獲得高產(chǎn)蛋白酶的菌株YP4-1。利用甲醛值法[6]對該菌株發(fā)酵的豆醬進行氨基酸態(tài)氮含量的測定[7]。本研究為篩選優(yōu)良的發(fā)酵功能菌株、提高發(fā)酵豆醬的品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵豆醬：取自東三省地區(qū)的農(nóng)戶家里；氫氧化鈉(分析純)、福林酚試劑：上海索萊寶生物科技有限公司；酪氨酸：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其余試劑均為分析純：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

奧林帕斯CX21顯微鏡 日本奧林帕斯公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；XFH-75C電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 深圳市鼎鑫宜實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；磁力攪拌器 上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；酸度計 上海洪紀儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

通過對131份采自東北三省各地的家庭自制豆醬進行分離，對獲得的純培養(yǎng)真菌菌株經(jīng)脫脂牛奶平板初篩，如表現(xiàn)出蛋白酶活性，則會在培養(yǎng)基的背面形成透明的水解圈。

1.3.2 發(fā)酵復(fù)篩

采用具有天然成分的麥麩固體培養(yǎng)基，以麥麩∶豆餅粉∶水為4∶1∶3的比例配制，滅菌后將初篩具有活性的菌株接入，25 ℃黑暗培養(yǎng)5天。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50 mL無菌的去離子水，分散均勻，30 ℃震蕩培養(yǎng)4 h，靜置。濾液在4200 r/min下離心20 min，取上清液作為粗酶液測定。

1.3.3 酶活測定

采用福林酚法測定蛋白酶的活性[8]。

1.3.4 豆醬的制作及單菌發(fā)酵

挑選飽滿的大豆浸泡，變軟后煮透，搗碎。分裝到罐頭瓶中，每瓶裝120 g。用封口膜封嚴，121 ℃滅菌60 min。將菌株YP4-1接種到PDA培養(yǎng)基上活化，挑取新鮮菌落用無菌水制成濃度為1×106cfu/mL的菌懸液。超凈臺內(nèi)將菌懸液取1 mL單菌接種于滅菌的大豆中，25 ℃培養(yǎng)。待菌落長滿大豆表面時加入12%(W/W)的鹽水，常溫發(fā)酵90天。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮含量測定

在發(fā)酵期間，每隔10天測定豆醬發(fā)酵過程中的氨基酸態(tài)氮含量，采用甲醛值法(GB/T 5009.39-2003)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

通過脫脂牛奶平板初篩，菌株YP4-1在培養(yǎng)基背面形成透明圈，證明此菌具有蛋白酶活性。發(fā)酵復(fù)篩后的粗酶液經(jīng)福林酚法測定的蛋白酶活性大小見表1。

表1 YP4-1的透明圈大小及蛋白酶活力Table 1 The size of transparent zone and protease activity of YP4-1

2.2 氨基酸態(tài)氮含量測定結(jié)果

對發(fā)酵豆醬每隔10天測其氨基酸態(tài)氮含量，其含量隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律見圖1。

圖1 YP4-1發(fā)酵豆醬的氨基酸態(tài)氮含量Fig.1 The content of amino acid nitrogen of soybean paste fermented by YP4-1

由圖1可知，發(fā)酵初始氨基酸態(tài)氮的含量隨著發(fā)酵時間的延長逐步增加，在發(fā)酵50天時達到了最大值，之后氨基酸態(tài)氮的含量呈現(xiàn)小范圍的波動，至后期菌絲老化，菌體代謝減弱至停止，氨基酸態(tài)氮的含量逐漸下降。

3 討論

發(fā)酵是醬油、大醬生產(chǎn)的主要環(huán)節(jié)，也是蛋白質(zhì)分解的過程以及分解物再次發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)的過程[10]。這個過程產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮亦稱氨基氮，是由大豆和或脫脂大豆、小麥和或麩皮中的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的，是衡量發(fā)酵能力的重要指標。在YP4-1接種的發(fā)酵體系中，發(fā)酵初始氨基酸態(tài)氮的含量呈直線上升趨勢，這個階段生成的氨基酸及相應(yīng)的代謝產(chǎn)物參與了糖類和脂類的合成反應(yīng)，有一些氨基酸參與了丙酮酸、乙酰CoA、α-酮戊二酸、琥珀酰CoA、延胡索酸、草酰乙酸等物質(zhì)的合成，使氨基酸為其他物質(zhì)的代謝循環(huán)提供了碳骨架[11]。在發(fā)酵后期，菌體處于老化狀態(tài)，菌體代謝產(chǎn)生的蛋白酶系逐漸降低至停止，體系中氨基酸態(tài)氮的含量逐漸降低。由于YP4-1來源于空氣中，為野生型發(fā)酵功能菌株，其產(chǎn)蛋白酶的活力及發(fā)酵性能均有可優(yōu)化與提升的空間。米曲霉是公認的食品安全菌株，具有很強的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在較廣的pH范圍內(nèi)均具有活性，另外由于米曲霉含有豐富的糖苷水解酶，可以利用淀粉或纖維素等廉價原料高效生產(chǎn)蛋白酶，所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要來源菌株。本研究為篩選優(yōu)良的發(fā)酵功能菌株、提高發(fā)酵豆醬的品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]高秀芝，艾啟俊.傳統(tǒng)豆醬和商品豆醬發(fā)酵過程中營養(yǎng)及理化指標動態(tài)[J].中國食品報，2013，13(2)：205-210.

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Detection of Amino Acid Nitrogen Content of Soybean Paste Fermented byAspergillusoryzaeYP4-1

TANG Guo-jin, SUN Xiao-dong*, WANG Hui, WU Ya-nan, LIU Rui

(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

Homemade soybean paste is a very common food in three provinces of the northeast of China. It is fermented by microorganism in the air. Amino acid nitrogen refers to the nitrogen content that exists in the form of amino acid, and it is the important indicator to distinguish the fermentation quality of the fermented foods such as soy sauce, cooking wine and soybean paste. Isolate the strains with fermentation functions from 131 homemade soybean paste samples in the northeast three provinces. Use skim milk plate and wheat bran solid medium to select, and the Folin-phenol Reagent Method is used to detect the protease activity. The strain ofAspergillusoryzaeYP4-1 is found with high protease activity. Use YP4-1 to ferment soybean paste for 90 days,and the content of amino acid nitrogen is detected every 10 days. The result shows that amino acid nitrogen content is the highest in the 50th day,reaching to 0.46 g/mL.

soybean paste；protease activity；Aspergillusoryzae；amino acid nitrogen

2017-03-16 *通訊作者

國家自然基金青年基金項目(31200014)；中央高校自主基金項目(DC201501012)；大連民族大學大學生創(chuàng)新訓練項目(XA201612346)

孫曉東(1979-)，女，山東掖縣人，高級工程師，博士，研究方向：真菌分類與真菌毒素的檢測。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.027

1000-9973(2017)09-0113-03