疏肝法對肝郁型MCI患者認(rèn)知功能、尿8-OHdG及血漿SOD和LPO的影響?

侯俊林，詹向紅，孫前明，關(guān)徐濤，劉 永，梁 鶴，閆國立，李 偉(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

【臨床基礎(chǔ)】

疏肝法對肝郁型MCI患者認(rèn)知功能、尿8-OHdG及血漿SOD和LPO的影響?

侯俊林，詹向紅△，孫前明，關(guān)徐濤，劉 永，梁 鶴，閆國立，李 偉
(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

目的：探討疏肝法對肝郁型MCI患者肝郁程度、認(rèn)知功能、尿8-OHdG及血漿SOD和LPO的影響。方法：用國際MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)和肝氣郁結(jié)證癥狀篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選40～65歲的肝郁型MCI患者，用肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分表對患者的肝氣郁結(jié)程度進(jìn)行評測，用MoCA量表和WAIS-RC量表簡式對患者的認(rèn)知功能進(jìn)行評測，用ELISA法對患者用藥前后的尿8-OHdG、血漿SOD和LPO進(jìn)行檢測。結(jié)果：與用藥前比較，患者用藥后肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分降低；MoCA量表的視空間與執(zhí)行、注意、語言、抽象、延遲回憶、定向及總分均升高，命名得分無明顯改變；WAIS-RC量表四合一簡式的相似性、數(shù)字廣度、填圖、木塊圖和總分升高；8-OHdG含量降低，SOD及LPO值無明顯變化。結(jié)論：疏肝法能降低肝郁型MCI患者的肝氣郁結(jié)癥狀，改善患者的認(rèn)知功能，降低DNA的氧化損傷是認(rèn)知功能改善的可能原因。

疏肝法；肝氣郁結(jié)；認(rèn)知功能；氧化水平

輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)是正常衰老與癡呆之間的過渡狀態(tài)[1]。MCI患病率在6.1%～16.1%之間[2-3]，隨年齡的增長，約50%的MCI可進(jìn)展為癡呆[4]。因此，積極研究MCI對防治癡呆有重要意義。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，長期情緒調(diào)節(jié)不良的個體易較早出現(xiàn)認(rèn)知功能下降。肝郁是情緒調(diào)節(jié)不良的常見證候，但疏肝法能否改善肝郁型MCI患者的認(rèn)知功能尚未見報道。《金匱要略》云：“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾?！惫时狙芯坎捎镁哂惺韪谓庥艚∑⒆饔玫腻羞b丸作為疏肝方藥，觀察疏肝法對肝郁型MCI患者肝郁程度和認(rèn)知功能的影響，并從衰老生物學(xué)角度探討患者認(rèn)知功能改變的可能原因。

根據(jù)現(xiàn)有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，尚無藥物可推薦用于MCI患者[5]，故本研究主要探討疏肝法對患者的影響。逍遙丸是疏肝法的代表方之一，其疏肝解郁效果已得到臨床驗(yàn)證，所以課題未設(shè)陽性對照藥。同時，因MCI患者是癡呆的高危人群，確診后應(yīng)用安慰劑或不給予藥物治療倫理審查不予批準(zhǔn)，故未設(shè)立安慰劑組或空白對照組，基于以上原因，本研究選擇作用藥前后的對照。且用藥前知情同意中，已明確告知患者逍遙丸是用來改善肝郁而非認(rèn)知功能，把安慰劑效應(yīng)降到最低，因此未設(shè)對照組對本研究結(jié)果和結(jié)論的影響有限。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)量表

一般情況及病史調(diào)查表；簡易精神狀態(tài)檢查量表(Mini-Mental State Examination， MMSE)；蒙特利爾認(rèn)知評估量表(Montreal Cognitive Assessment， MoCA)；全面衰退量表(Global Deterioration Scale，GDS)；日常生活活動量表(Activity of Daily Living Scale，ADL)；肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分表；中國修訂版韋氏成人智力量表(Wechsler Adut Intelligence Scale-Chinese Revised，WAIS-RC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

人血漿超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)酶免試劑盒(美國R&D公司，批號14-11)；人血漿過氧化脂質(zhì)(lipid Peroxide，LPO)酶免試劑盒(美國R&D公司，批號14-11)；人尿8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)酶免試劑盒(美國R&D公司，批號14-11)。

1.3 主要儀器

SK30臺式多功能高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)，全波長自動酶標(biāo)儀(美國熱電)，HPS-250生化培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

2 對象與方法

2.1 研究對象

來自2013年7月至2015年1月河南中醫(yī)學(xué)院一附院、三附院體檢科參加體檢人員及鄭州市莆田、賈崗、磨李等大型社區(qū)的志愿者，其中符合要求的患者共47例，2人因身體原因退出，實(shí)際參與本項(xiàng)研究者45人。本研究以自愿為前提，履行知情同意手續(xù)，并報河南中醫(yī)藥大學(xué)一附院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合國際MCI工作組標(biāo)準(zhǔn)[6]；②神經(jīng)心理學(xué)量表：MMSE得分：文盲>17分，小學(xué)>20 分，中學(xué)或以上>24分；MoCA得分<26分，若受教育年限≤12年則MoCA得分加1分以校正；GDS為2～3級；ADL得分<26分；③符合肝氣郁結(jié)證癥狀篩選標(biāo)準(zhǔn)[7]：A.胸脅乳房少腹脹痛；B.抑郁太息；C.咽有梗阻感；D.痛經(jīng)、閉經(jīng)或月經(jīng)先后不定期；E.脈弦。5項(xiàng)中A、B必備，具有3項(xiàng)或兼有如下1項(xiàng)脾虛癥狀(神疲體倦、納差、腹脹、便溏)，記分在6分以上者。計分標(biāo)準(zhǔn)按癥狀分，胸脅乳房少腹脹痛、抑郁太息、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、神疲體倦、納差、腹脹7項(xiàng)均有5個等級：無(0分)、輕(1分)、中(2分)、重(3分)、嚴(yán)重(4分)；咽有梗阻感、便溏脈弦2項(xiàng)均有2個等級：無或消失(0分)、有(1分)；④年齡在40～65歲之間；⑤每例患者的MCI最終臨床診斷和肝氣郁結(jié)證診斷均由兩位相應(yīng)專業(yè)高級職稱臨床醫(yī)師分別獨(dú)立進(jìn)行，均符合者方可納入。

2.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合國際MCI工作組標(biāo)準(zhǔn)或肝氣郁結(jié)證癥狀篩選標(biāo)準(zhǔn)者；不能配合調(diào)查及檢測者；頭部腫瘤；存在神經(jīng)系統(tǒng)疾??；重要臟器病變可能影響腦功能或影響對認(rèn)知功能的評價；精神疾病病史；活動性癲癇者；癡呆患者；服用影響認(rèn)知功能藥物者。

2.4 血尿樣品的采集與制備

患者用藥前后分別由河南中醫(yī)藥大學(xué)一附院體檢中心采血、留尿樣，以乙二胺四乙酸作為抗凝劑，血液混合抗凝劑后離心20 min(2000-3000 r/min)，收集上清液。尿樣以同樣方法離心處理。

2.5 8-OHdG、SOD和LPO的檢測方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)對尿8-OHdG、血漿SOD和LPO進(jìn)行檢測。按試劑盒說明逐級加入稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，加入樣本50 μL，封板后置37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育反應(yīng)30 min，洗滌5次；每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL(空白孔除外)溫育、洗滌；每孔加顯色劑A、B液各50 μL，37 ℃避光溫育15 min，每孔加50 μL終止液。輕輕混勻30 s，15 min內(nèi)450 nm波長依序測量各孔吸光度并計算樣品濃度。

2.6 藥物干預(yù)

逍遙丸組成(河南省宛西制藥股份有限公司，批號140409)：柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)(炒)、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜，每次8粒，每日3次，持續(xù)用藥3個月。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分結(jié)果

表1顯示，與用藥前比較，患者用藥后肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 肝郁型MCI患者用藥前后肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分比較分)

3.2 MoCA和WAIS-RC簡式結(jié)果

表2顯示，與用藥前比較，患者用藥后MoCA量表的視空間與執(zhí)行、注意、語言、抽象、延遲回憶、定向及總分均有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；命名得分與用藥前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3顯示，與用藥前比較患者用藥后WAIS-RC量表四合一簡式的相似性、數(shù)字廣度、填圖、木塊圖及總分均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 肝郁型 MCI患者用藥前后MoCA結(jié)果分)

表3 肝郁型MCI患者用藥前后WAIS-RC簡式粗分比較(，分)

3.3 尿8-OHdG、血漿SOD和LPO檢測結(jié)果

表4顯示，與用藥前比較 患者用藥后的尿8-OHdG含量降低(P<0.05)，血漿SOD和LPO值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 肝郁型MCI患者用藥前后尿8-OHdG、血漿SOD、血漿LPO結(jié)果

4 討論

目前肝氣郁結(jié)證癥狀計分尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用應(yīng)用較廣的肝氣郁結(jié)證癥狀程度計分表對患者進(jìn)行評測。結(jié)果顯示，患者用藥后的分值低于用藥前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明疏肝法可以降低患者的肝氣郁結(jié)程度。

MoCA是一個對認(rèn)知功能異常進(jìn)行快速篩查的評定工具。韋氏成人智力量表(Wechsler Adut Intelligence Scale，WAIS)是當(dāng)今國際心理學(xué)界公認(rèn)的較好的智力測驗(yàn)之一，但該量表內(nèi)容較多，耗時較長，被試難以堅(jiān)持，故有學(xué)者建議用WAIS簡式量表[10]。本研究采用MoCA量表和WAIS-RC四合一簡式對患者的認(rèn)知功能進(jìn)行評測。結(jié)果顯示，患者用藥后MoCA量表除命名外其余領(lǐng)域得分及總分均升高，WAIS-RC四合一簡式的4項(xiàng)分測驗(yàn)粗分及合計粗分均提高，說明疏肝法可以改善患者的認(rèn)知功能。

8-OHdG是公認(rèn)的DNA氧化損傷標(biāo)志物[11]。受內(nèi)外源刺激后，8-OHdG 則作為代謝廢物隨尿液排出體外[12]。研究表明，8-OHdG在中晚期阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)和MCI患者的大腦中含量增高[13]；尿液中8-OHdG的水平與認(rèn)知功能高低呈負(fù)相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，與用藥前比較，患者用藥后尿8-OHdG含量降低，提示疏肝法可減輕肝郁MCI患者DNA的氧化損傷。本研究結(jié)果與張俊芳等報道的正常參考值有較大差異，所用檢測儀器不同及被試日照時間等因素可能是造成上述差異的原因[8]，該差異不會對本文結(jié)論造成影響。

張銘湘等研究認(rèn)為，神經(jīng)性退行病變與自由基代謝失衡有關(guān)[15]。SOD作為一種抗氧化酶，其活性高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。SOD活性降低，氧自由基濃度就會升高，可引起神經(jīng)細(xì)胞代謝紊亂、變性、壞死，進(jìn)而導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損害[16]。多項(xiàng)研究顯示，MCI患者的SOD活性低于正常對照[17-18]；MCI患者認(rèn)知功能改善后，血清SOD活性隨之升高[19]。但本研究中患者用藥前后SOD水平未出現(xiàn)顯著差異，可能的原因如下：一是運(yùn)用疏肝法不能提高肝郁型MCI患者血漿SOD活性；二是因用藥前后2次檢測已相隔3個月，患者又處于自然衰老過程中，所以上述結(jié)果提示疏肝法的應(yīng)用尚不能逆轉(zhuǎn)自然衰老所致的SOD水平下降。

LPO是不飽和脂肪酸經(jīng)自由基作用形成的過氧化物。隨著年齡增長，人體清除自由基的能力下降，LPO生成增多導(dǎo)致生物體趨向衰老[20]。Lee LK等發(fā)現(xiàn)，與正常組比較MCI組的LPO水平顯著升高[21]?；ㄈ值冗\(yùn)用增智靈口服液對癡呆患者和記憶障礙小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)用藥后患者的社會功能以及小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均得到一定提升，而兩者的LPO含量則顯著降低[22]。但本研究中患者用藥前后LPO無明顯改變，原因可能是隨著年齡增長，中老年人生成LPO增多，超過了疏肝法降低LPO的能力，也可能是疏肝法不具有直接清除LPO的作用。

肝郁可影響全身氣機(jī)通調(diào)致臟腑受累，或氣血虧虛、腦失濡養(yǎng)，或痰瘀互結(jié)、清竅阻塞，終可使腦之生機(jī)下降，引起MCI發(fā)生。故課題組提出“肝郁腦衰”假說，即曠日持久的情志不暢、疏泄失職是加速衰老進(jìn)程中認(rèn)知功能衰退的重要原因之一，并用逍遙丸對肝郁型MCI患者進(jìn)行干預(yù)以反正該理論。逍遙丸方中柴胡、薄荷、生姜辛散以疏肝；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血以柔肝；炙甘草益氣補(bǔ)中、緩肝之急；白術(shù)、茯苓補(bǔ)土健脾防肝之克。如此配伍既補(bǔ)肝體又助肝用，還可防肝之傳變，能很好地發(fā)揮疏肝解郁之效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疏肝法能改善肝郁型MCI患者的認(rèn)知功能、降低DNA的氧化損傷是其可能的原因。上述研究結(jié)果從一定程度上反證了“肝郁腦衰”假說，為認(rèn)知功能衰退的中醫(yī)藥干預(yù)提供了新思路，為肝主疏泄和七情內(nèi)傷賦予了新認(rèn)識，為中醫(yī)衰老理論增添了新內(nèi)涵。

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Effects of Soothing Liver Therapy on Cognitive Function, 8-OHdG in Urinary and Plasma SOD and LPO in MCI Patients with Liver Qi Stagnation Type

HOU Jun-lin, ZHAN Xiang-hong△, SUN Qian-ming, GUAN Xu-tao, LIU Yong, LIANG He, YAN Gou-li, LI Wei
(HenanUniversityoftraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：To study the effect of Shugan method to liver depression degree，cognitive function，8-OHdG，SOD and LPO in MCI patients with liver qi stagnation. Methods： Use the International diagnostic criteria for MCI and symptoms of liver qi stagnation screening standard to screening 40 to 65 years old MCI patients with liver qi stagnation.Use degree of liver qi stagnation scores table to evaluate patients degree of liver qi stagnation.Use MoCA and WAIS-RC to evaluating patients cognitive function.Use ELISA to detect 8-OHdG，SOD and LPO in patients before and after treatment.Results： Compared with before treatment，after treatment in the patients, score of liver qi stagnation symptom reduced, score of visuospatial execution， attention， language， abstract，delayed recall，orientation and total score of MoCA Scale all increased.Score of name of MoCA Scale did not change significantly.Score of similarity，digit span，mapping，block diagram and total score of WAIS-RC all increased.The content of 8-OHdG decreased.The activity of SOD and the content of LPO had no significant change.Conclusion： Shugan method can reduce symptoms of liver qi stagnation in MCI patients with liver qi stagnation，improve patients cognitive function，reduce oxidative damage to DNA is the possible causes of the improve of patients cognitive function.

Shugan method; Liver qi stagnation; Cognitive function; Oxidation level

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173148)-基于肝疏泄理論探討情志對衰老進(jìn)程中認(rèn)知功能的影響及機(jī)制；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473556)-疏肝法對情緒調(diào)節(jié)不良MCI患者工作記憶影響的機(jī)制研究；河南中醫(yī)藥大學(xué)博士科研基金項(xiàng)目(BSJJ2011-08)-孔圣枕中丹對MCI患者認(rèn)知功能和ERP成分的影響

侯俊林(1981-)，男(蒙古族)，河南鎮(zhèn)平人，講師，醫(yī)學(xué)博士，從事情志與衰老相關(guān)疾病的理論及臨床研究。

△通訊作者：詹向紅(1963-)，女，河南許昌人，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事情志與衰老相關(guān)疾病的理論及應(yīng)用研究，Tel：0371-65962406，E-mail：zxh371@163.com。

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1006-3250(2017)08-1102-03

2016-07-26