清熱活血方對(duì)II 型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響研究?

王海霞，曹 煒，張 聰，智 愷，武子英，劉立玲，果 彤，燕美彤(. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 0005； . 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 00700； . 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 0009)

【實(shí)驗(yàn)研究】

清熱活血方對(duì)II 型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響研究?

王海霞1，曹 煒2△，張 聰2，智 愷2，武子英1，劉立玲1，果 彤3，燕美彤3
(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053； 2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700； 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的： 觀察清熱活血方對(duì)II 型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的影響，探討清熱活血方對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生的抑制機(jī)理。方法： 應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CD31在CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)CIA大鼠血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素的表達(dá)，并觀察清熱活血方對(duì)其的影響。結(jié)果： 用免疫組化法檢測(cè)微血管數(shù)量發(fā)現(xiàn)，清熱活血方中、小劑量組與模型組比較微血管數(shù)量明顯減少，清熱活血方大劑量組與模型組比較微血管數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIA大鼠血清vegf、IL-6檢測(cè)中，與模型組比較清熱活血方中、小劑量組vegf表達(dá)降低，清熱活血方中劑量組IL-6表達(dá)降低明顯。結(jié)論: 中小劑量的清熱活血方通過(guò)下調(diào)VEGF和IL-6的表達(dá)，可減少炎癥細(xì)胞對(duì)滑膜的浸潤(rùn)，抑制血管新生，進(jìn)而達(dá)到控制活動(dòng)性RA病情的目的。

清熱活血；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；白細(xì)胞介素-6

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病。本病表現(xiàn)為以雙手、腕、膝、踝、足關(guān)節(jié)等小關(guān)節(jié)受累為主的對(duì)稱(chēng)性、持續(xù)性多關(guān)節(jié)炎。本實(shí)驗(yàn)采用II型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型觀察清熱活血方對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)病理、免疫組化及血清指標(biāo)的影響，以揭示清熱活血方對(duì)滑膜血管新生的作用機(jī)制。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK(京) 2012-0001)。SD大鼠在實(shí)驗(yàn)期間喂養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境，自由飲水，飼料固定。

1．2 試劑及儀器

免疫源性牛II 型膠原(貨號(hào)20021)、完全弗氏佐劑(貨號(hào)7001)均購(gòu)自 Chondrex公司，清熱活血方由我院科研藥房提供，vegf ELISA試劑盒購(gòu)自abcam公司(貨號(hào)ab100786)，IL-6 ELISA 試劑盒購(gòu)自新博盛生物科技有限公司(貨號(hào)ERC003)，抗CD31抗體購(gòu)自R&D公司(貨號(hào)AF3628)。

組織包埋機(jī)(型號(hào)HISTOSTAR)、石蠟切片機(jī)(型號(hào)RM2245)、切片染色機(jī)(型號(hào)ST5020)、手提式均質(zhì)儀(型號(hào)IKA-T10 Basic Ultra-turrax)、熒光顯微鏡(型號(hào)BX50)、酶標(biāo)儀(型號(hào)WellscanMK2)。

2 方法

2.1 清熱活血方的制備

清熱活血方組成：土茯苓30 g,金銀花30 g，炒蒼術(shù)15 g，黃柏9 g，赤芍15 g，萆薢15 g，丹參15 g，莪術(shù)9 g，青風(fēng)藤15 g，生薏苡仁30 g，蜈蚣2條，蜂房5 g。按處方比例稱(chēng)取飲片加水中火煮沸后，文火煎煮30 min過(guò)濾取藥汁，再加水按上述方法操作，將2次藥汁混合濃縮至濃度2 g(生藥)/mL。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將雌性SD大鼠70只按隨機(jī)序列法分為正常對(duì)照組、CIA模型組、清熱活血方低、中、高組(15、20、25 g生藥/kg)、抑制劑ZD6474組(50 mg/kg)、MTX組(10 mg/kg)7組。自免疫第1天開(kāi)始即給藥，中藥組按15、20、25 g生藥/kg、抑制劑ZD6474組(50 mg/kg)進(jìn)行灌胃，正常對(duì)照組與模型組灌服2ml生理鹽水，每天1次，連續(xù)21 d。MTX組(10 mg/kg)灌胃每周2次，連續(xù)21 d。

2.3 CIA大鼠模型的建立

除正常對(duì)照組外，其余6組制備CIA模型。于大鼠尾根部皮下注射0.15ml膠原乳化劑，第7天加強(qiáng)免疫方法同前。正常組以等量生理鹽水對(duì)照處理。

2.4 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定

采用排水法測(cè)量大鼠足體積，每周測(cè) 2 次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.5 細(xì)胞因子檢測(cè)

大鼠腹主動(dòng)脈取血，冰上靜置2 h，2500 rpm離心15 min取血清，ELISA備用。

2.6 微血管密度測(cè)量

將大鼠滑膜組織放入10% 福爾馬林固定2 h，將已固定的標(biāo)本取出，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后石蠟包埋?；の⒀苊芏?microvessel density，MVD)用1∶50稀釋的CD31抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。在200倍顯微鏡下觀察滑膜微血管密度(microvessel density，MVD)，每張片選取3個(gè)血管集中視野拍照，并計(jì)數(shù)取均值。

2.7 關(guān)節(jié)病理

取雙后肢踝關(guān)節(jié)去除附著皮毛組織，浸泡在 10%多聚甲醛(福爾馬林)溶液中，隔天換液，5% 硝酸浸泡脫鈣2周，每周換液 2次，至刀片能輕松切斷骨質(zhì)后重新浸泡至 10% 多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片，HE染色。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度

圖1表1顯示，從首次免疫第10天開(kāi)始，各組造模大鼠后肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度的紅腫，隨時(shí)間推移關(guān)節(jié)腫大程度進(jìn)一步加劇。與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯(P<0.01)；在第18天左右，ZD6474組、MTX組、中藥中、小劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫大趨勢(shì)得到抑制(P<0.01)。

圖1 各組CIA大鼠關(guān)節(jié)腫大程度注：a. 正常組;b. 模型組；c. ZD6474組；d. MTX組；e.中藥大劑量組；f.中藥中劑量組；g.中藥小劑量組

3.2 各組CIA大鼠關(guān)節(jié)病理

圖2顯示，白色箭頭所示為骨關(guān)節(jié)面。關(guān)節(jié)病理可見(jiàn)，正常組關(guān)節(jié)面連續(xù)，骨小梁完整，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與正常組比較，模型組骨關(guān)節(jié)面中斷、消失，骨小梁與近關(guān)節(jié)面骨端破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥大劑量組與小劑量組骨關(guān)節(jié)缺損較多，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。其余3組雖有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但骨關(guān)節(jié)面尚存，偶有不連續(xù)，近關(guān)節(jié)面骨端基本完整。

圖2 各組CIA大鼠關(guān)節(jié)的破壞程度(HE 12.5×)注：a.正常組;b.模型組；c. ZD6474組；d. MTX組；e.中藥大劑量組；f.中藥中劑量組；g.中藥小劑量組

3.3 各組CIA大鼠滑膜微血管密度和血清中VEGF、IL-6的表達(dá)水平

圖3表1顯示， CD31是分子量為 130KD的跨膜糖蛋白, 在血管內(nèi)皮細(xì)胞的連接處表達(dá)水平較高。本實(shí)驗(yàn)用其定位血管內(nèi)皮細(xì)胞，圖3中淺色標(biāo)記為陽(yáng)性血管。與正常組比較，模型組血管數(shù)量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，ZD6474組、MTX組、中藥中劑量組、中藥小劑量組微血管數(shù)量均顯著減少(P<0.01)，中藥大劑量組微血管數(shù)量也明顯減少(P<0.05)。

圖3 各組CIA大鼠滑膜微血管密度(MVD)(IHC-P 200×)注：a 正常組;b 模型組；c ZD6474組；d MTX組；e中藥大劑量組；f中藥中劑量組；g中藥小劑量組

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清VEGF與IL-6表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，MTX組、中藥中劑量組大鼠血清中IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，ZD6474組、MTX組、中藥中小劑量組大鼠血清中VEGF表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

4 討論

RA在中醫(yī)文獻(xiàn)中被稱(chēng)為歷節(jié)、鶴膝風(fēng)、頑痹、尪痹等，屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，其發(fā)病以正虛為本、外感為標(biāo)，并與患者體質(zhì)、飲食及生活習(xí)慣等息息相關(guān)。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，RA患者以濕熱證多見(jiàn)，或外感濕熱之邪，或風(fēng)寒濕郁久化熱， 或恣食肥甘厚味，濕熱內(nèi)生。濕熱內(nèi)蘊(yùn)，煉液為痰，壅滯血脈，氣血輸注不利，瘀血內(nèi)生，不能榮養(yǎng)四末筋骨，故見(jiàn)關(guān)節(jié)紅腫疼痛、屈伸不利甚至關(guān)節(jié)畸形[1]。在RA活動(dòng)期應(yīng)用清熱活血方，可起到清熱活血、調(diào)節(jié)免疫的作用。

表1 各組CIA大鼠相關(guān)指標(biāo)

注：與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

RA發(fā)病首先侵犯關(guān)節(jié)滑膜，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜血管增生。增生的滑膜需要更多的血供以滿(mǎn)足其對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，因而血管新生在血管翳形成和維持方面起關(guān)鍵性作用。

IL-6是由2條糖蛋白鏈組成的多肽，是參與機(jī)體免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子。RA患者的T細(xì)胞、B細(xì)胞等都可產(chǎn)生IL-6，IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成多種急性時(shí)相蛋白，這些蛋白促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生類(lèi)風(fēng)濕因子及多種免疫球蛋白使RA炎癥加劇[2]。RA患者滑膜中IL-6、血清中slL-6R與慢性滑膜炎及關(guān)節(jié)損害程度呈正相關(guān)。將RA患者滑液中分離的成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，IL-6及其sIL-6R共同作用可以提高VEGF水平，抗IL-6受體抗體可以降低VEGF水平[3]。另外，在RA患者中，血清IL-6的水平與C反應(yīng)蛋白水平相關(guān)。IL-6的過(guò)表達(dá)可以使骨質(zhì)吸收加速，形成減少[4]。VEGF是一種細(xì)胞來(lái)源廣泛的多功能性糖蛋白，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，在RA血管新生方面有重要作用[5-6]。VEGF 在RA中是聯(lián)系各種炎性因子的樞紐，可直接促進(jìn)滑膜血管新生并增加血管通透性。

本實(shí)驗(yàn)選取IL-6、VEGF和CD31作為觀測(cè)RA炎癥與血管新生的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清熱活血方可以明顯減輕大鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度。關(guān)節(jié)病理顯示，清熱活血方可抑制滑膜細(xì)胞的增殖，延緩或抑制骨破壞。ZD6474已證明，在抑制血管新生方面效果顯著[7-9]，屬于陽(yáng)性藥。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，MTX在抑制血管新生方面亦具有明顯效果[10]。大鼠MVD測(cè)定中，模型組血管數(shù)量明顯增多,清熱活血方中劑量組、小劑量組對(duì)血管新生的抑制作用較為顯著，清熱活血方大劑量組對(duì)血管新生的抑制作用也較為明顯。在細(xì)胞因子檢測(cè)中，模型組大鼠血清中VEGF、IL-6表達(dá)量顯著高于正常組,清熱活血方中劑量組、MTX組大鼠血清中二者的表達(dá)量明顯低于模型組，與模型組比較大鼠血清VEGF的表達(dá)水平也明顯降低。而清熱活血方大劑量組對(duì)血清VEGF、IL-6的作用不明顯。綜合來(lái)看，清熱活血方中劑量組無(wú)論是在抑制炎癥還是在抑制血管新生方面均較明顯，小劑量組次之。

綜上，中小劑量的清熱活血方能夠下調(diào)VEGF和IL-6的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜的浸潤(rùn)，抑制血管新生，從而達(dá)到控制活動(dòng)期RA病情的目的。

[1] 劉小平, 侯秀娟, 朱躍蘭, 等. 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病因病機(jī)探討[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)臨床, 2014, 21(1): 19-20.

[2] 鄭毅, 董馨, 陸江陽(yáng), 等. 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中高遷移率族蛋白 1 的表達(dá)[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2005, 9(11): 684-686.

[3] NAKAHARA H, SONG J, SUGIMOTO M, et al. Anti-interleukin-6 receptor antibody therapy reduces vascular endothelial growth factor production in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis & Rheumatism, 2003, 48(6): 1521-1529.

[4] 王卓, 王瞳暉, 王澤. 白介素-6 及其受體在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2011, 13(2): 111-113.

[5] WARD M C, CUNNINGHAM A M. Developmental expression of vascular endothelial growth factor receptor 3 and vascular endothelial growth factor C in forebrain[J]. Neuroscience, 2015, 303: 544-557.

[6] 鄭林, 肖漣波. HIF-1α和VEGF在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2016, 36(2): 162-165.

[7] 馬虹, 丁乾. VEGF及EGFR抑制藥聯(lián)合放療抑制腫瘤血管生成及DSB修復(fù)[J]. 臨床藥物治療雜志, 2012, 10(2): 14-22.

[8] KIM Y, LI F, O’NEILL B E, et al. Specific binding of modified ZD6474 (Vandetanib) monomer and its dimer with VEGF receptor-2[J]. Bioconjugate chemistry, 2013, 24(11): 1937-1944.

[9] SARKAR S, RAJPUT S, TRIPATHI A K, et al. Targeted therapy against EGFR and VEGFR using ZD6474 enhances the therapeutic potential of UV-B phototherapy in breast cancer cells[J]. Molecular cancer, 2013, 12(1): 1.

[10] CHANG Y, PARK J W, SUNG S, et al. Volume-normalized transfer constant as an imaging biomarker for chronic inflammatory arthritis: A dynamic contrast enhanced MRI study[J]. Magnetic resonance in medicine, 2016, 76(3): 926-934.

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373592)-基于血管新生miR-125b-PIGF/Flt1信號(hào)傳導(dǎo)通路探討清熱活血法治療活動(dòng)期類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子免疫機(jī)制

王海霞(1988-)，女，河南人，醫(yī)學(xué)碩士，從事類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者：曹 煒，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)與臨床研究，Tel:13601331063,E-mail:caowei6636@126.com。

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1006-3250(2017)08-1071-03

2017-02-12