靜息細胞生物轉化甘油生產(chǎn)甘油酸

周配+張磊+方亞坤+高巖+劉宇鵬

摘要：在單因素試驗基礎上，利用響應面設計法對日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonica）HD1025靜息細胞轉化甘油合成甘油酸的條件進行優(yōu)化，并建立了各因素與甘油酸產(chǎn)量之間的數(shù)學模型。結果表明，采用靜息細胞轉化法生產(chǎn)甘油酸取得了較好的效果，且靜息細胞濃度、甘油濃度、反應時間以及溫度等對甘油酸產(chǎn)量均有不同程度的影響。響應面預測產(chǎn)甘油酸的最佳工藝為靜息細胞濃度0.67%、甘油濃度160.74 g/L、溫度30.10 ℃、pH值7.0、反應時間 3 d，此時甘油酸產(chǎn)量為33.83 g/L，與響應面極值吻合，表明優(yōu)化方案達到了預期效果。

關鍵詞：響應面設計；靜息細胞；甘油酸；甘油

中圖分類號： S188文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0216-04

隨著化石能源的大量使用，石油等能源儲量的減少，人們越來越關注可再生資源的開發(fā)，并且開始投入大量的精力來研發(fā)各種可以代替石油等化石燃料的可再生資源，其中生物能源的開發(fā)就是一條途徑。然而在生物燃料的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大約10%的副產(chǎn)物——甘油[1-2]。因此，在過去的10年間，越來越多的研究者開始探索能夠將甘油轉化成更有價值的化學物質的方法，其中利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘油酸就是一條重要的途徑，微生物法生產(chǎn)甘油酸具有對環(huán)境溫和、產(chǎn)量高、方法簡便而且產(chǎn)物具有立體選擇性等優(yōu)點，因此越來越受到關注。

甘油酸作為一種有機酸普遍存在于自然界各種各樣的植物中，其衍生物（3-磷酸甘油酸）作為一種代謝產(chǎn)物存在于人體內。甘油酸及其衍生物具有很多的生物學功能，例如在人體內D-甘油酸能促進乙醇分解代謝，有文獻報道稱在狗體內的甘油酸具有膽固醇活性和肝興奮劑的功能[3]。甘油酸衍生出的酯類低聚物能表現(xiàn)出抗胰蛋白酶活性[4]。在食品方面，甘油酸可以作為一種食品添加劑。所以氧化甘油生產(chǎn)甘油酸，既可充分利用生物燃料行業(yè)的廢棄物，又具有很大的市場潛力。

國外有關微生物法生產(chǎn)甘油酸的報道較少，其中報道較多的4株菌株為熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）NBRC16470[2]、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter sp.） NCBR3259[3]、氧化葡萄糖酸桿菌（G. oxydans） NBRC3292[1]、費拉托葡萄糖酸桿菌（G. frateurii） NBRC3262[1]，它們生產(chǎn)甘油酸的產(chǎn)量分別為22.7、33.7、32.6、57.2 g/L。國外有關微生物法生產(chǎn)甘油酸的報道主要是以微生物生長細胞直接轉化法來生產(chǎn)甘油酸，該方法也存在一些問題，如培養(yǎng)基成分復雜導致反應體系雜質多，后期除雜困難，不利于產(chǎn)物的提取等。而靜息細胞轉化法是以微生物整體細胞作為反應催化劑，對外源底物進行結構修飾的微生物轉化，除具有反應條件溫和、選擇性強、無污染、成本低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，還可有效地提高下游產(chǎn)物的處理效率，降低提取成本。其原理是靜息狀態(tài)的微生物是限制性營養(yǎng)物質中靜息細胞在非生長條件下的代謝，在這種狀態(tài)下的微生物由于缺乏某些必需的營養(yǎng)成分使細胞不能繁殖，但因含有各種酶系統(tǒng)，細胞仍能轉化其他營養(yǎng)物質[5-8]。目前，國內外尚未發(fā)現(xiàn)用靜息細胞轉化法轉化甘油生產(chǎn)甘油酸的詳細報道。

在筆者所在課題組前期的研究中，已從腐爛的蔬菜中篩選獲得1株能夠生產(chǎn)甘油酸的菌株Gluconobacter japonicas HD1025，本試驗主要利用靜息細胞培養(yǎng)法轉化甘油生產(chǎn)甘油酸并利用SAS軟件進一步優(yōu)化轉化條件，探討各因素的交互效應，得到較優(yōu)的條件組合。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌種：日本葡萄糖酸桿菌HD1025，由筆者所在實驗室從腐爛的蔬菜中分離獲得。

甘油酸（分析純，日本東京化成工業(yè)株式會社），甘油（分析純，購自鄭州派尼化學試劑廠），蛋白胨（生化純，購自北京奧博星生物技術有限責任公司），CaCO3（分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司），KH2PO4（分析純，購自天津市光復科技發(fā)展有限公司）等。

種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，5 g/L酵母粉，5 g/L蛋白胨，1 g/L MgSO4·7H2O，pH值為6.5，115 ℃滅菌20 min。

1.2試驗方法

1.2.1靜息細胞的制備按5%接種量將HD1025接入種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃恒溫培養(yǎng)10 h后，8 000 r/min離心 15 min，棄上清液，收集菌體用無菌水洗滌3遍，制得靜息細胞，4 ℃冷藏備用。

1.2.2靜息細胞初始培養(yǎng)條件靜息細胞濃度為0.5%；培養(yǎng)體系為100 g/L甘油，3 g/L KH2PO4，15 g/L CaCO3，pH值為7.0，在30 ℃恒溫振蕩搖床中220 r/min培養(yǎng)3 d。

1.2.3發(fā)酵液中菌體細胞濃度的測定通過測定細胞吸光度得到細胞濃度。將發(fā)酵液稀釋適當倍數(shù)，用分光光度計于600 nm處測吸光度，D600 nm =稀釋倍數(shù)×分光光度計讀數(shù)。量取一定量的不同吸光度菌體懸浮液，離心棄上清液后于105 ℃烘干至恒質量，此時的質量即為細胞干質量，計算D600 nm與細胞干質量的關系。

1.2.4甘油和甘油酸的檢測甘油和甘油酸的檢測方法參考文獻[9-10]。

1.2.5靜息細胞濃度對轉化甘油酸的影響將靜息細胞濃度設定為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其他條件不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉化，利用高效液相色譜（HPLC）測定甘油酸的含量，考察靜息細胞濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.6pH值對轉化甘油酸的影響在最適的靜息細胞濃度的基礎上，將pH值分別設定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉化，然后檢測甘油酸含量，考察pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響。endprint

1.2.7溫度對轉化甘油酸的影響在最適靜息細胞濃度和最適pH值的基礎上，將溫度設定為15、20、25、30、35、40 ℃，其他條件固定不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉化，然后檢測甘油酸的含量，考察溫度對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.8甘油濃度對轉化甘油酸的影響在最適靜息細胞濃度、最適pH值和適宜的溫度的基礎上，將甘油濃度設定為60、80、100、120、140、160、180、200 g/L，其他條件固定不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉化，然后檢測甘油酸含量，考察甘油濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.9反應時間對轉化甘油酸的影響選擇最適靜息細胞濃度和最適pH值，添加合適的甘油濃度和適宜的溫度培養(yǎng) 5 d，每天取樣檢測甘油酸含量，考察反應時間對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.10響應面設計優(yōu)化甘油酸轉化工藝在單因素試驗的基礎上，將甘油酸轉化工藝的主要影響因素綜合在一起，以溫度、甘油濃度和靜息細胞濃度3個因素為自變量，以甘油酸產(chǎn)量為響應值，設計3因素3水平的試驗，其他因素不變。試驗設計如表1所示。

2結果與分析

2.1靜息細胞濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響

由圖1可知，靜息細胞濃度對甘油酸產(chǎn)量有較大影響，當靜息細胞濃度為0.6%時，甘油酸產(chǎn)量達最大值，為 21.32 g/L，此后甘油酸的產(chǎn)量隨著靜息細胞濃度的增大而減少。當靜息細胞濃度低于0.6%時，甘油酸產(chǎn)量隨菌體濃度的增加而增加，因為隨著細胞濃度增大，參加轉化甘油酸反應的酶量也相應增大，從而加快轉化甘油酸的速率；但是，過高的細胞濃度并不能提高酶的催化效率。在轉化過程中，氧氣也是必需的底物之一，單純地提高菌體量并不能提高轉化效率，相反，由于過多的菌體會影響溶液的傳質效率，不利于轉化的進行。隨著細胞濃度的進一步增加，甘油酸產(chǎn)量降低，是由于細胞濃度過高造成細胞膜的破裂影響酶活，從而降低甘油酸產(chǎn)量。因此，靜息細胞濃度選擇0.6%。

2.2初始pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響

由于甘油酸屬于有機酸，在發(fā)酵過程中pH值低于3時會嚴重影響菌體的生長和甘油酸的產(chǎn)量，因此，本試驗在發(fā)酵過程中添加CaCO3來調節(jié)發(fā)酵液的pH值。初始pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響如圖2所示，可見不同初始pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響較小。

2.3溫度對甘油酸產(chǎn)量的影響

由圖3可知，溫度對靜息細胞產(chǎn)甘油酸有很大的影響，當溫度在30～35 ℃之間時，甘油酸產(chǎn)量達22.77 g/L，隨著溫度進一步升高，甘油酸產(chǎn)量明顯下降，這可能是由于反應溫度過高降低了酶活，導致甘油酸產(chǎn)量有所下降。較高的溫度需要消耗更多的能量，出于節(jié)能方面的考慮，本試驗選擇最適溫度為30 ℃。

2.4甘油濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響

氧化葡萄酸桿菌轉化制備甘油酸的底物是甘油，適當提高底物濃度，有利于提高甘油酸的產(chǎn)量，但若底物濃度過高，可能會對轉化制備甘油酸產(chǎn)生抑制作用，從而降低甘油的實際轉化率。如圖4所示，隨著甘油濃度的增加，甘油酸產(chǎn)量逐漸增加。當甘油濃度為160 g/L時，甘油酸產(chǎn)量為 30.47 g/L，此后繼續(xù)增加甘油濃度時，甘油酸產(chǎn)量卻有所下降，這可能是因為高濃度甘油對靜息細胞的酶活力有抑制作用，從而導致甘油酸產(chǎn)量、轉化率降低。因此，甘油濃度選擇 160 g/L。

2.5反應時間對甘油酸產(chǎn)量的影響

由圖5可知，當反應時間為3 d時，甘油酸產(chǎn)量達 29.53 g/L，之后隨著反應時間的延長，甘油酸產(chǎn)量達到平衡狀態(tài)，幾乎不再增加，從經(jīng)濟角度考慮，反應時間選擇為3 d。

2.6響應面設計結果分析

單因素試驗研究了培養(yǎng)基中各組分及培養(yǎng)條件對甘油酸產(chǎn)量的影響，由單因素試驗結果可確定溫度、甘油濃度和靜息細胞濃度是影響甘油酸產(chǎn)量的主要因素。為研究這些單因素之間的相互影響，根據(jù)單因素試驗所確定的這3個顯著因素的變化范圍，設計響應面分析試驗考察溫度、甘油濃度和靜息細胞濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響，明確這3個主要因素的最佳條件。

以甘油酸得率為響應值，根據(jù)甘油酸產(chǎn)量響應面設計試驗結果（表2），用SAS統(tǒng)計分析軟件進行多元回歸分析，所得

響應面分析結果如圖6所示，在一定范圍內，隨著甘油濃度、靜息細胞濃度、溫度的變化，甘油酸的產(chǎn)量呈先增后減的趨勢，這說明3種顯著因素相互作用后甘油酸的產(chǎn)量存在最大值，同時利用SAS軟件進行分析尋找到甘油酸產(chǎn)量達到最大值時，相對應的3種顯著因素的最適濃度。從表3中可以看出，用回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其因變量和自變量之間的線性關系顯著，決定系數(shù)為98.47%，說明回歸方程的擬合程度較好。

2.7驗證試驗

為了進一步研究最佳響應值的范圍，預測3個因素的最佳理論濃度，進行脊嶺分析[11]，得出回歸模型存在最大值，甘油酸含量的最大估計值為34.04 g/L，此時靜息細胞濃度、溫度、甘油濃度的取值分別為0.67%、30.10 ℃、160.74 g/L。為了驗證優(yōu)化后轉化條件的可靠性，分別進行3次驗證試驗，所得甘油酸產(chǎn)量的平均值為33.83 g/L，與預測產(chǎn)量相近。

3結論

目前微生物游離細胞轉化工藝通常采用2種方法：一種是生長細胞轉化法，另一種是靜息細胞轉化法。生長細胞轉化法中微生物生長代謝產(chǎn)生一定量的代謝產(chǎn)物，給后期產(chǎn)品的分離提純帶來一定的困難。而靜息細胞轉化法是將微生物細胞發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，離心或過濾收集菌體靜息細胞，然后將靜息細胞懸浮于含有底物的水或緩沖液中進行生物轉化。此法的優(yōu)點是可以避免生長細胞對產(chǎn)物的降解作用，且產(chǎn)物后處理簡單，沒有培養(yǎng)基成分的污染，生產(chǎn)周期短，因而是微生物轉化的一種主要方式。

本試驗優(yōu)化產(chǎn)甘油酸的最佳工藝條件：靜息細胞濃度、溫度、甘油濃度的取值分別為0.67%、30.10 ℃、160.74 g/L，pH值7.0，反應3 d，此時甘油酸的產(chǎn)量為33.83 g/L，比優(yōu)化前的 20.16 g/L 提高了67.8%。endprint

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