賴氨酸對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)乳脂肪合成相關基因和蛋白表達的影響

陳 璐 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特010018)

賴氨酸對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)乳脂肪合成相關基因和蛋白表達的影響

陳 璐 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特010018)

本試驗旨在研究賴氨酸(Lys)對奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)內(nèi)乳脂肪合成相關基因和蛋白表達的影響，探討Lys影響乳脂肪合成的機理。將第3代BMECs隨機分為6組，每組6個重復,每個重復1個培養(yǎng)孔。各組培養(yǎng)基中Lys的濃度分別為0.5(基礎培養(yǎng)基，對照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后測定BMECs甘油三酯(TAG)含量、乳脂肪合成相關基因和蛋白的表達量。結果表明：BMECs內(nèi)TAG含量(P=0.013)以及脂肪酸結合蛋白3(FABP3，P=0.001)、脂蛋白脂酶(LPL，P=0.096)、脂肪酸合成酶(FASN，P=0.003)、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6(AGPAT6，P=0.038)和甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAM，P=0.022)基因表達量對Lys呈顯著或趨于顯著的濃度依賴效應。FABP3基因表達量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組和LPL基因表達量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)；FASN基因表達量以2.0 mmol/L組最高，顯著高于16.0 mmol/L組(P<0.05)；硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)基因表達量以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)；磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亞家族1成員1(BTN1A1)和黃嘌呤脫氫酶(XDH)基因表達量均以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因及蛋白表達量均以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L組(P<0.05)；固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1(SREBP1)基因表達量以1.0、2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)，蛋白表達量以1.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)。但高濃度Lys抑制AGPAT6和GPAM的基因表達，AGPAT6基因表達量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0 mmol/L組(P<0.05)，GPAM基因表達量以16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組(P<0.05)?？梢姡琇ys對BMECs的乳脂肪合成具有顯著的促進效果，但高濃度的Lys抑制了乳脂肪合成相關基因的表達。本試驗條件下，培養(yǎng)基中Lys適宜濃度為2.0～4.0 mmol/L。

奶牛；乳腺上皮細胞；賴氨酸；乳脂肪

乳脂肪是牛奶的主要成分，是評價牛奶質(zhì)量的重要指標之一。氨基酸(AA)是乳蛋白合成的重要前體物，但AA在影響乳蛋白合成的同時，也影響著乳脂肪合成與組成[1]。因此，深入研究AA對乳脂肪合成的影響及機理，對調(diào)控乳腺內(nèi)乳成分的合成和改善乳品質(zhì)具有重要意義。賴氨酸(Lys)是動物的必需氨基酸，Giallongo等[2]向奶牛灌注過瘤胃賴氨酸(RPLys)后發(fā)現(xiàn)，Lys在促進乳蛋白合成的同時，對乳脂肪的合成具有促進效果。Xu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，向泌乳母豬飼喂Lys和纈氨酸(Val)后，適宜的Lys和Val比例能夠使母豬背部脂肪損失降到最低，說明Lys和Val能夠影響乳脂肪的合成。韓慧娜[4]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈飼糧條件下奶牛陰外動脈灌注AA能促進乳腺內(nèi)短鏈脂肪酸的攝取。可見，Lys在一定程度上影響了乳脂肪的合成，然而國內(nèi)外的研究報道多集中在向奶牛瘤胃內(nèi)及陰外動脈灌注Lys影響乳蛋白和乳脂肪合成的方面，但以奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)為模型，研究不同濃度Lys對乳脂肪合成相關基因和蛋白表達的影響的國內(nèi)外報道較少，此方面機理有必要繼續(xù)進行研究和探索。鑒于此，本研究以BMECs為模型，研究不同濃度Lys對乳脂肪合成相關基因和蛋白表達的影響，為進一步探討Lys對BMECs內(nèi)乳脂肪合成的影響機理提供理論基礎，為調(diào)控奶牛Lys營養(yǎng)水平、提高生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

Ⅱ型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)購自Gibco公司；Lys(L8662)、氫化可的松、表皮生長因子、催乳素、油紅O、瓊脂糖和兔抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體購自Sigma公司(AV32880)；兩性霉素購自Amresco公司；細胞培養(yǎng)用雙抗購自Corning公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)購自HyClone公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTMⅡ購自TaKaRa公司；放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白質(zhì)濃度試劑盒、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、ECL化學超敏顯色液購自北京碧云天公司；鼠抗固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1(SREBP1)抗體購自Abcam公司(ab3259)；兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自Proteintech公司(10494-1-AP)；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗購自KPL公司(04-15-06)；HRP標記山羊抗鼠二抗購自天津三箭生物技術有限公司(LK2003)。

主要儀器包括：二氧化碳恒溫培養(yǎng)(Forma-311，Thermo公司)；生物安全柜(MSC-ADVANTAGE，Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympuse公司)；全自動酶標儀(Synergy H4 BioTek，BioTek公司)；細胞計數(shù)儀(Cytorecon，GE公司)；熒光定量PCR儀(ABI-7500，ABI公司)；蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀、蛋白質(zhì)成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2原代BMECs體外培養(yǎng)

BMECs用膠原酶消化法獲得。在內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真屠宰場選取3～5歲經(jīng)產(chǎn)的健康泌乳中期的高產(chǎn)荷斯坦奶牛乳腺組織。去除組織表層，于深層取約1 cm3的組織塊放入4 ℃預冷的3×雙抗PBS中。隨后在超凈臺內(nèi)分別用3×PBS、75%酒精和1×PBS清洗。再去除組織塊的表層，選腺泡豐富的組織剪成糊狀。加入等體積0.5%的Ⅱ型膠原酶溶液，37 ℃和5% CO2條件下消化1 h。之后用80目濾網(wǎng)過濾，收集細胞濾液，179×g離心5 min，棄上清；PBS沖洗細胞，179×g離心3 min，重復沖洗2次。加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。當原代細胞貼壁率達到80%～90%后用0.25%胰蛋白酶/EDTA對細胞進行純化和傳代[5]。

1.3試驗設計

試驗用第3代的BMECs，按照試驗要求的細胞密度接種于不同的細胞培養(yǎng)板上，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。采用單因子隨機試驗設計，試驗中使用的DMEM/F12培養(yǎng)基中Lys的濃度為0.5 mmol/L，參考李喜艷[6]和高海娜[7]的研究結果并通過噻唑藍(MTT)法測定細胞的增殖率確定Lys的濃度，各組Lys的濃度分別為0.5(基礎培養(yǎng)基，對照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每組6個重復,每個重復1個培養(yǎng)孔。細胞貼壁率達到80%～90%時，換為饑餓培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后按照試驗設計要求換成不同濃度Lys的培養(yǎng)基，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.4測試指標與方法

1.4.1 細胞活力與TAG的含量

細胞活力采用MTT法檢測，以490 nm吸光度值(OD490 nm)計算細胞相對增殖率(RGR)，公式如下：

RGR(%)=(試驗組OD490 nm/對照組OD490 nm)×100。

TAG含量參考Ramírez-Zacarías等[8]的方法測定，將細胞以5×104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板上，按試驗設計培養(yǎng)結束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定細胞1 h，PBS清洗2遍，用0.5 mL油紅O工作液避光浸染2 h。用PBS清洗3遍，晾干培養(yǎng)板后，加入0.3 mL異丙醇萃取30 min，用全自動酶標儀測定波長為510 nm吸光度值(OD510 nm)，用以表示TAG含量。

1.4.2 BMECs內(nèi)乳脂肪合成相關基因的表達

將細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，按試驗設計培養(yǎng)結束后，細胞總RNA按照Trizol法提取，用酶標儀檢測總RNA的純度與濃度，260和280 nm吸光度值比值(OD260 nm/OD280 nm)在1.8～2.2表示總RNA純度較好。完整性用2%瓊脂糖凝膠電泳來檢測。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒的方法，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL?；虮磉_量采用SYBY Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的方法進行測定，反應體系為20 μL。以GAPDH為管家基因，對乳脂肪合成相關基因[脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)、PPARγ、SREBP1、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)、脂肪酸結合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6(AGPAT6)、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAM)、磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亞家族1成員1(BTN1A1)、黃嘌呤脫氫酶(XDH)]進行相對定量，引物序列見表1。實時熒光定量PCR的反應程序為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，進行40個循環(huán)反應；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，51個循環(huán)，繪制熔解曲線?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct表示。

表1 乳脂肪合成相關基因的引物序列

續(xù)表1基因GenesGenBank登錄號GenBankaccessionNo.引物序列Primersequences(5'—3')長度Length/bp參考文獻References嗜乳脂蛋白亞家族1成員1BTN1A1M35551F:AGGACGGACTGGGCAATTGR:GAACCCATTCTCGGGAGTCAT81Bionaz等[11]黃嘌呤脫氫酶XDHBC102076F:GATCATCCACTTTTCTGCCAATGR:CCTCGTCTTGGTGCTTCCAA100自行設計

F：上游引物;R：下游引物。

F: forward primer; R: reverse primer.

1.4.3 BMECs內(nèi)PPARγ和SREBP1的蛋白表達量

采用蛋白免疫印跡的方法測定，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。將細胞以1×106個/mL的密度接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，按試驗設計培養(yǎng)結束后，棄掉上清，用PBS清洗細胞2遍，每瓶加入250 μL含0.1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細胞裂解液，4 ℃裂解5 min后刮下細胞并收集細胞懸液，4 ℃ 15 455×g離心10 min，取上清用于檢測蛋白的表達量。取適量樣品用BCA法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，隨后分別向60 μg的每種樣品中添加5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，按照4∶1的比例混合，100 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)熱變性，然后進行電泳，濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠120 V電泳120 min。電泳結束后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(100 V，4 ℃，50 min)。轉(zhuǎn)膜后，吐溫-TBS(TBST)漂洗3次，每次5 min，室溫搖床上封閉1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。然后將其分別與250倍稀釋的兔抗PPARγ一抗稀釋液和50倍的鼠抗SREBP1一抗稀釋液結合，于4 ℃孵育過夜，取出PVDF膜后TBST漂洗3次，每次5 min。隨后分別與稀釋1 000倍的山羊抗兔二抗稀釋液和稀釋500倍的山羊抗鼠二抗稀釋液結合，室溫搖床孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。用ECL顯色法試劑盒進行顯色，在蛋白質(zhì)成像儀上照相分析。圖片用Quantity one軟件進行灰度值分析，PPARγ和SREBP1蛋白表達量采用各組灰度值與0.5 mmol/L組灰度值的比值表示。

1.5數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)通過Excel進行整理，采用SAS 9.0軟件的方差分析程序(ANOVA)進行顯著性檢驗，同時用回歸統(tǒng)計程序進行一次線性與二次曲線回歸分析，P<0.05表示組間的差異或回歸關系顯著，0.05≤P<0.10表示組間的差異或回歸關系趨于顯著，P>0.10表示組間的差異或回歸關系不顯著。

2 結 果

2.1Lys對BMECs細胞活力、TAG含量及乳脂肪合成相關基因表達的影響

由表2可知，隨著Lys濃度的增加，BMECs RGR呈顯著的一次線性下降(P<0.001)，TAG含量呈顯著的二次曲線升高(P=0.013)，F(xiàn)ABP3和LPL基因表達量分別呈顯著和趨于顯著的一次線性增加(P=0.001和P=0.096)，其中，4.0、8.0、16.0 mmol/L組的RGR顯著低于0.5、1.0、2.0 mmol/L組(P<0.05)，F(xiàn)ABP3基因表達量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著高于0.5、1.0 mmol/L組(P<0.05)，LPL基因表達量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)。隨著Lys濃度的增加，F(xiàn)ASN基因表達量呈顯著的二次曲線上升(P=0.003)，最高值出現(xiàn)在2.0 mmol/L組，顯著高于16.0 mmol/L組(P<0.05)。2.0、4.0 mmol/L組的SCD1基因表達量顯著高于其他組(P<0.05)。2.0、4.0 mmol/L組PPARγ基因表達量顯著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L組(P<0.05)。1.0、2.0、4.0 mmol/L組的SREBP1基因表達量顯著高于其他各組(P<0.05)。AGPAT6和GPAM基因表達量隨Lys的增加均呈顯著的一次線性降低(P=0.038和P=0.022)，AGPAT6基因表達量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0 mmol/L組(P<0.05)，GPAM基因表達量以16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組(P<0.05)。LPIN1基因表達量以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高，顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)。BTN1A1和XDH基因表達量也以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表2 Lys對BMECs細胞活力、TAG含量和乳脂肪合成相關基因表達量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。P<0.05表示回歸關系顯著；0.05≤P<0.10表示回歸關系趨于顯著；P>0.10表示回歸關系不顯著。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).P<0.05 means significant regression, 0.05≤P<0.10 means regression tend to be significant, andP>0.10 means no significant regression. The same as below.

2.2Lys對BMECsPPARγ和SREBP1蛋白表達的影響

由表3和圖1可知，PPARγ蛋白表達量以1.0、2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)，SREBP1蛋白表達量以1.0 mmol/L組顯著高于其他各組(P<0.05)。

表3 Lys對BMECs PPARγ和SREBP1蛋白表達的影響

3 討 論

乳脂肪是衡量乳品質(zhì)的重要指標之一[13]，大約98%為TAG，其中，中短鏈脂肪酸(SMCFA)的含量占乳脂肪的2/3以上[14]，奶牛乳汁中有50%的C16∶0脂肪酸以及幾乎全部的C4∶0～C14∶0是由乳脂肪合成前體物(乙酸、β-羥丁酸)在乳腺從頭合成的[15]。TAG在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的表面合成，合成后以脂滴的形式積累，積累的脂滴通過質(zhì)膜的包裹再由細胞分泌出去[16]。因此，BMECs內(nèi)TAG含量和脂滴的累積能直接反映BMECs內(nèi)乳脂肪的合成。研究表明，AA不僅能影響乳蛋白的合成，也能影響乳脂肪的合成[1]。李珊珊[17]研究表明，在BMECs中添加必需氨基酸顯著促進乳蛋白的合成的同時，可能通過SREBP1和PPARγ調(diào)節(jié)乳脂肪的合成。然而，Lys對BMECs內(nèi)的TAG合成的影響及其機理研究尚未見報道。本試驗結果得出，隨著Lys濃度增加，BMECs內(nèi)TAG含量呈顯著的二次曲線升高，說明Lys對TAG含量的影響呈濃度依賴關系，關于其影響機理尚不清楚，需要進一步研究。

圖1 Lys對BMECs PPARγ和SREBP1蛋白表達的影響

與細胞內(nèi)的從頭合成、長鏈脂肪酸(LCFA)的攝取與轉(zhuǎn)運、脂滴的形成等過程有關的基因均會影響TAG的合成。哺乳動物組織中攝取和LCFA的主要基因是LPL和FABP3[18]。LPL能催化TAG分解為脂肪酸和甘油，為組織供能及貯存能量[19]。FABP3與細胞內(nèi)LCFA的轉(zhuǎn)運有關，可將LCFA從細胞膜上運送到TAG和磷脂的合成位點[20]。趙艷麗等[21]研究表明，添加適宜濃度的蛋氨酸對BMECs內(nèi)FABP3和LPL基因表達具有顯著的促進作用，說明蛋氨酸可以促進BMECs內(nèi)LCFA的攝取與轉(zhuǎn)運。本研究結果得出，2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組FABP3基因表達量、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組LPL基因表達均顯著高于0.5 mmol/L組，且二者均隨著Lys濃度的增加呈顯著和趨于顯著的一次線性增加，說明Lys對BMECs內(nèi)LCFA的攝取與轉(zhuǎn)運可能具有一定的促進效果，提示Lys對乳脂肪合成的促進效果呈濃度依賴關系。

FASN是一種多功能的酶系統(tǒng)，參與脂肪酸合成的整個過程，F(xiàn)ASN是奶牛乳脂肪酸從頭合成過程中的關鍵基因[11]，泌乳期奶牛乳腺內(nèi)SMCFA(C4～C16)的合成受FASN編碼的蛋白調(diào)控[22]。并且，F(xiàn)ASN催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成LCFA。硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)是Δ9去飽和酶中一種主要的酶，是細胞中單不飽和脂肪酸合成的限速酶[20]。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，添加不同比例的含Lys的必需氨基酸可上調(diào)BMECs內(nèi)LPIN1、FASN和SCD的基因表達量。本試驗結果表明，Lys對FASN基因表達的促進效果呈顯著的濃度依賴效應，尤以2.0 mmol/L組最高，顯著高于16.0 mmol/L組；Lys也促進SCD1基因表達，以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組。這些研究結果部分地解釋了Lys對乳脂肪合成具有促進效果的原因。

此外，GPAM、AGPAT6和LPIN1參與催化TAG的合成[24]，是參與乳脂肪合成的關鍵酶。GPAM催化脂酰輔酶A與甘油-3-磷酸的sn-1位點結合形成溶血磷脂酸；AGPAT6催化第2個脂酰輔酶A與甘油-3-磷酸的sn-2位點結合形成磷脂酸(PA)；LPIN能轉(zhuǎn)移磷酸基團，將PA轉(zhuǎn)變成二酰甘油。研究發(fā)現(xiàn)敲除了泌乳小鼠的AGPAT6基因后不能合成乳脂肪[25]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，Lys對GPAM和AGPAT6基因表達量的作用效果呈顯著的濃度依賴效應，隨著Lys濃度的增加抑制了它們的表達，AGPAT6以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0 mmol/L組，GPAM以16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組；同時，Lys顯著地促進了LPIN1基因表達，以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高。這些研究結果說明，高濃度的Lys抑制了乳脂肪合成相關基因的表達，進一步解釋了Lys對乳脂肪合成的促進效果呈濃度依賴效應的原因。

BTN1A1和XDH是調(diào)控脂滴形成的主要蛋白[26]。固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白(SREBP)是核轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)屬于核激素受體家族中的配體激活受體，PPARγ可調(diào)控SREBP1基因的表達，同時LPL和ACACA等是PPARγ的標靶基因[27]。Kadegowda等[28]用PPARγ激活劑處理BMECs后發(fā)現(xiàn)，上調(diào)了ACACA、FASN、SREBF1、SCD和LPIN1基因的表達。本研究結果顯示，BTN1A1和XDH基因表達量均以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高；PPARγ基因及蛋白表達量均以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L組；SREBP1基因表達量以1.0、2.0、4.0 mmol/L組較高，蛋白表達量以1.0、2.0 mmol/L組較高，進一步從轉(zhuǎn)錄因子和脂滴形成的角度解釋了Lys對乳脂肪合成具有促進效果的原因。FABP3、LPL、FASN、GPAM、AGPAT6等是PPARγ和SREBP1的靶基因，在本研究只對PPARγ和SREBP1的蛋白表達量進行了探討研究，而對FABP3、LPL、FASN、GPAM、AGPAT6等蛋白表達量尚未開展研究，有必要今后繼續(xù)研究探討，以更好地闡明Lys對乳脂肪合成的影響機理。

生冉[29]研究指出，雷帕霉素抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路后，SREBP1、PPARγ、ACACA和SCD1的基因表達量顯著下降；Soliman等[30]的試驗研究也得出了相似的結果，雷帕霉素抑制了人乳腺外植體中SREBP1及其靶基因ACACA、FASN和SCD1的基因表達，說明mTOR信號通路通過轉(zhuǎn)錄因子SREBP1和PPARγ調(diào)控乳脂肪的合成。Lys是否通過mTOR信號通路間接地調(diào)控乳脂肪的合成尚未見資料報道，本試驗并未對mTOR信號通路相關基因進行檢測，需要進一步深入研究。

綜合脂肪酸攝取與轉(zhuǎn)運、從頭合成、TAG的合成及脂滴形成的相關基因表達結果可以看出，Lys對BMECs內(nèi)的乳脂肪合成具有一定的促進效果，呈濃度依賴效應，以2.0～4.0 mmol/L的Lys添加濃度為宜，且Lys對BMECs細胞活力的影響也呈顯著濃度依賴效應。然而目前關于添加Lys對奶牛乳脂肪合成及其調(diào)控機理的研究甚少，并且本試驗得出的結果還沒有在體內(nèi)進一步驗證，因此，需要進一步深入研究。

4 結 論

① Lys對BMECs的乳脂肪合成具有顯著的促進效果，但高濃度的Lys抑制了乳脂肪合成相關基因的表達。

② 本試驗條件下，培養(yǎng)基中Lys適宜濃度為2.0～4.0 mmol/L。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(責任編輯 王智航)

Effects of Lysine on Expressions of Genes and Proteins Involved in Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

CHEN Lu ZHAO Yanli GUO Xiaoyu SHI Binlin YAN Sumei*

(Collage of Animal Science, Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot 010018, China)

This study was to detect the effects of lysine (Lys) on expressions of genes and proteins involved in milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs) and discuss the mechanism of Lys regulating milk fat synthesis. The 3rd passage BMECs were divided into six groups with six replicates per group and one pore per replicate. Cells were cultured in medium containing 0.5 (basal medium, control), 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L Lys, respectively. The triglyceride (TAG) content, expressions of genes and proteins involved in milk fat synthesis were detected after 48 h cultivation at 37 ℃ and 5% CO2. The results showed as follows: TAG content (P=0.013) and gene expressions of fatty acid-binding protein 3 (FABP3,P=0.001), lipoprotein lipase (LPL,P=0.096), fatty acid synthase (FASN,P=0.003), 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6 (AGPAT6,P=0.038) and glycerol-3-phosphate acyltrandferase (GPAM,P=0.022) acted dose-dependent on Lys at significant level or significant tendency. Compared with 0.5 mmol/L group, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L groups significantly increased gene expression ofFABP3 (P<0.05), and 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L groups significantly increased gene expression ofLPL(P<0.05). Gene expression ofFASNin 2.0 mmol/L group was the highest, which was significantly higher than that in 16.0 mmol/L group (P<0.05). Gene expression of stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) in 2.0 to 4.0 mmol/L groups was significantly higher than that in other groups (P<0.05). Gene expressions of phosphatidic acid phosphatase 1 (LPIN1), butyrophilin subfamily 1 member A1 (BTN1A1) and xanthine dehydrogenase (XDH) in 1.0, 2.0, 4.0 and 8.0 mmol/L groups were significantly higher than those in 0.5 mmol/L group. Compared with the 0.5, 8.0 and 16.0 mmol/L groups, 2.0 and 4.0 mmol/L groups significantly increased gene and protein expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) (P<0.05). Gene expression of sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in 1.0, 2.0 and 4.0 mmol/L groups was significantly higher than that in the other groups (P<0.05), and protein expression ofSREBP1 in 1.0 mmol/L group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05). High dose of Lys decreased gene expressions ofAGPAT6 andGPAM. Compared with 0.5 and 1.0 mmol/L groups, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L groups significantly decreased gene expression ofAGPAT6 (P<0.05). Compared with 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0 mmol/L groups, 16.0 mmol/L groups significantly decreased gene expression ofGPAM(P<0.05). In conclusion, Lys significantly promote milk fat synthesis in BMECs, but high dose of Lys inhibits gene expressions related in milk fat synthesis. Under the conditions in the present study, 2.0 to 4.0 mmol/L of Lys is an optimal level in culture medium.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3366-3374]

dairy cow; bovine mammary epithelial cells; lysine; milk fat

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.042

2017-02-24

國家奶業(yè)“973計劃”項目(2011CB1008003)

陳 璐(1990—)，女，山西襄汾人，碩士研究生，從事奶牛營養(yǎng)研究。E-mail：1510560671@qq.com

*通信作者：閆素梅，教授，博士生導師，E-mail： yansmimau@163.com

S823

：A

：1006-267X(2017)09-3366-09