飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)的影響

梁鴻雁 趙春霞 韓 華

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319)

飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)的影響

梁鴻雁 趙春霞 韓 華

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢發(fā)育及卵巢促卵泡素受體(FSHR)和促黃體素受體(LH/CGR) mRNA表達(dá)的影響。選擇27頭體重(61.0±3.1) kg的長(zhǎng)×大二元母豬，隨機(jī)分成3組(每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭豬)，分別飼喂低、中、高3個(gè)能量水平[分別為NRC(1998)推薦消化能需要的90%、100%和110%]的飼糧。試驗(yàn)期內(nèi)各組平均日采食量相同，但攝入的消化能水平不同。試驗(yàn)?zāi)肛i在第2個(gè)發(fā)情期的第19天屠宰。結(jié)果表明：高能組卵巢重及大卵泡數(shù)顯著高于低能組(P<0.05)；各組間小卵泡數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。高能組卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量最高，顯著高于低能組(P<0.05)。由此得出，高能量水平飼糧可促進(jìn)后備母豬卵巢發(fā)育，有利于促進(jìn)卵巢FSHR和LH/CGRmRNA的表達(dá)。

能量水平；后備母豬；卵巢發(fā)育；基因表達(dá)

作為哺乳動(dòng)物的性腺，卵巢與母豬繁殖性能密切相關(guān)。后備母豬的卵巢發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和質(zhì)量直接影響母豬排卵率及性腺激素的分泌，從而影響胚胎數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)[1]。關(guān)于飼糧能量對(duì)母豬繁殖性能影響的研究有諸多報(bào)道，但結(jié)論不盡一致，多數(shù)研究者認(rèn)為，通過對(duì)不同生長(zhǎng)或繁殖周期母豬采用一定方式的限飼與補(bǔ)飼，可影響卵泡發(fā)育(總卵泡數(shù)、大卵泡數(shù)等)、排卵率、胚胎發(fā)育等[1-6]。但也有不同的報(bào)道，Almeida等[7]研究發(fā)現(xiàn)，母豬發(fā)情周期采取第1～7天限飼、第8～15天限飼及第1～15天飽飼3種飼喂方式，排卵率并沒有顯著差異。而營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)卵巢促性腺激素受體表達(dá)影響的報(bào)道較少，因此，關(guān)于后備母豬營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步完善。鑒于此，本試驗(yàn)以后備母豬為研究對(duì)象，研究不同飼糧能量水平對(duì)卵巢發(fā)育及卵巢促卵泡素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)和促黃體素受體(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor，LH/CGR)mRNA表達(dá)的影響，旨在為完善飼糧能量對(duì)動(dòng)物繁殖性能作用的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用健康、體況良好的(150±3)日齡、體重為(61.0±3.1) kg的“長(zhǎng)×大”二元后備母豬27頭，隨機(jī)分成3個(gè)組(每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭)，分別為：14.28 MJ/kg消化能組(中能組)，按NRC(1998)設(shè)計(jì)的飼糧(能量攝入為豬營(yíng)養(yǎng)消化能需要量的100%)飼喂；12.86 MJ/kg消化能組(低能組)，按標(biāo)準(zhǔn)飼糧能量降低10%的飼糧(能量攝入為豬營(yíng)養(yǎng)消化能需要量的90%)飼喂；15.71 MJ/kg消化能組(高能組)，飼喂按標(biāo)準(zhǔn)飼糧能量增加10%(能量攝入為豬營(yíng)養(yǎng)消化能需要量的110%)的飼糧。各組飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)前將豬舍徹底清洗并消毒。參照NRC(1998)后備母豬營(yíng)養(yǎng)需要推薦量，在試驗(yàn)期內(nèi)，試驗(yàn)豬體重在75 kg以內(nèi)時(shí)，每頭豬飼喂量為2.1 kg/d；體重達(dá)到75 kg后，每頭豬飼喂量為2.4 kg/d。除能量以外的其他營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)z入量相同。每天08:00、15:00飼喂2次，2次飼喂量相同。試驗(yàn)?zāi)肛i單圈飼養(yǎng)，自由飲水。在試驗(yàn)豬體重達(dá)到80 kg后，約26周齡開始，每天檢測(cè)發(fā)情2次，以出現(xiàn)靜立反射記為發(fā)情第1天。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kilogram of premix contained the following：VA 175 000 IU，VD320 000 IU，VE 1 100 IU，VK 50 mg，VB2300 mg，VB1100 mg，VB6150 mg，VB121 500 μg，生物素 biotin 5 mg，氯化膽堿 choline chloride 40 000 mg，葉酸 folic acid 30 mg，煙酸 nicotinic acid 1 250 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 900 mg，Cu (as copper sulfate) 500 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 8 000 mg，Mn (as manganese sulfate) 300 mg，I (as potassium iodide) 14 mg，Zn (as zinc sulfate) 8 000 mg，Se (as sodium selenite) 25 mg。

2)粗蛋白質(zhì)為實(shí)測(cè)值，其余為計(jì)算值。CP was a measured value, while the others were calculated values.

1.2樣品采集

在第2次發(fā)情的第19天，屠宰取卵巢，用吸水紙吸去卵巢表面水分后稱重，并統(tǒng)計(jì)大卵泡數(shù)(直徑>3 mm)和小卵泡數(shù)(直徑<3 mm)，然后將卵巢置于液氮中速凍后-80 ℃保存，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3試驗(yàn)材料

焦磷酸二乙酯(DEPC)(美國(guó)Sigma公司)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)(美國(guó)Promega公司)、dNTP(中國(guó)TaKaRa公司)、RNase抑制劑(中國(guó)TaKaRa公司)、Oligo(dT)18(中國(guó)TaKaRa公司)。

ABI System-7000型PCR儀(美國(guó)ABI公司)、GeneQuant-100核酸濃度測(cè)定儀(英國(guó)Pharmacia Biotech公司)、Sigma-3k15高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.4卵巢FHSR和LH/CGRmRNA表達(dá)的檢測(cè)

1.4.1 樣品總RNA提取

取樣品50～100 mg，采用Trizol一步法提取總RNA。經(jīng)電泳檢測(cè)總RNA的完整性。用GeneQuant-100核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度和純度。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成

引物使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，如表2所示。

表2 試驗(yàn)所用目的基因引物和探針

1.4.3 目的片段的擴(kuò)增

采用常規(guī)PCR法擴(kuò)增目的片段和內(nèi)參，用FSHR、LH/CGR引物，以高能組、中能組和低能組卵巢的cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段，目的片段長(zhǎng)度分別為103和145 bp。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。

1.4.4 純化PCR產(chǎn)物的回收、連接、轉(zhuǎn)化及序列測(cè)定

采用V-gene Biotechnology Limited的DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因產(chǎn)物，與pMD 18-T載體連接后，利用藍(lán)/白菌落篩選法進(jìn)行陽(yáng)性克隆的初步篩選，運(yùn)用日常型質(zhì)粒DNA快速制備試劑盒提取質(zhì)粒。將PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送到TaKaRa公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與互聯(lián)網(wǎng)上已知的核酸序列進(jìn)行比較，用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比較。

1.4.5 卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量的測(cè)定

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用TaqMan探針法對(duì)FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。以連續(xù)稀釋的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中：cDNA 1.00 μL，10×Ex Taq Buffer 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.00 μL，10 pmol/L上下游引物各0.50 μL，10 pmol/L FAM-TAMRA探針0.25 μL，Ex Taq HS 0.15 μL，ddH2O 18.10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，48個(gè)循環(huán)。每份樣品所含的拷貝數(shù)通過Ct值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而得到。

1.5數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢發(fā)育的影響

由表3可知，飼糧能量水平顯著影響后備母豬大卵泡數(shù)及卵巢重(P<0.05)，對(duì)小卵泡數(shù)無顯著影響(P>0.05)。隨著飼糧能量水平的提高，大卵泡數(shù)增多，卵巢重增加。其中高能組大卵泡數(shù)、卵泡重均顯著高于低能組(P<0.05)，與中能組均差異不顯著(P>0.05)；低能組與中能組間大卵泡數(shù)量、卵泡重均無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢發(fā)育的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)的影響

2.2.1 卵巢組織總RNA的鑒定

提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖1，有明顯的完整3條帶，分別為28S、18S和5S，RNA沒有降解，完全符合反轉(zhuǎn)錄要求。吸光度(OD)260/OD280值均達(dá)到1.8～2.0，達(dá)到試驗(yàn)純度要求。

圖1 卵巢組織總RNA電泳圖

2.2.2 目的基因PCR產(chǎn)物的鑒定

以重組質(zhì)粒為模板，采用FSHR、LH/CGR引物進(jìn)行常規(guī)PCR鑒定，見圖2，電泳可見103和145 bp處有特異的條帶，與預(yù)計(jì)的片段大小相符。基因序列分析結(jié)果表明，測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的FSHR和LH/CGR基因序列的同源性均為100%。

2.2.3 飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量的影響

由表4可知，飼糧能量水平顯著影響卵巢FSHR和LH/CGRmRNA的表達(dá)量(P<0.05)。隨著飼糧能量水平的提高，卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。高能組卵巢FSHRmRNA表達(dá)量均顯著高于低能組和中能組(P<0.05)；而中能組和低能組間FSHRmRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。高能組卵巢LH/CGRmRNA表達(dá)量顯著高于低能組(P<0.05)，但與中能組差異不顯著(P>0.05)；中能組和低能組間LH/CGRmRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

1：促黃體素受體LH/CGR；2：DL-2000 DNA Marker；3：促卵泡素受體FSHR。

圖2FSHR和LH/CGR重組質(zhì)粒片段的PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification ofFSHRandLH/CGRrecombinant plasmid by PCR

3 討 論

3.1飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢發(fā)育的影響

卵泡的成熟是后備母豬初情期啟動(dòng)的標(biāo)志之一。卵泡發(fā)育經(jīng)歷征集、選擇、優(yōu)勢(shì)化和排卵等過程，期間受內(nèi)分泌、旁分泌及自分泌等因素的影響。多個(gè)研究證實(shí)，能量可影響不同繁殖時(shí)期母豬的卵泡發(fā)育。本研究中，飼糧能量水平影響后備母豬大卵泡數(shù)及卵巢重，高能量水平顯著增加大卵泡數(shù)及卵巢重，這與王延忠[8]、周東勝[9]在對(duì)59 kg體重后備母豬飼喂混合油脂(油脂占消化能29%，豬油∶菜籽油=1∶1)的研究結(jié)果相一致。初情期前母豬在75 kg之后限飼至85 kg，Booth等[1]發(fā)現(xiàn)卵泡數(shù)量顯著低于自由采食母豬。Zak等[5]、Van Den Brand等[6]和Hazeleger等[10]在初產(chǎn)泌乳母豬中均得到了相近的結(jié)論。卵巢重量與母豬繁殖性能密切相關(guān)，卵巢重增加，可促進(jìn)性腺激素的分泌，也利于更多的小卵泡繼續(xù)發(fā)育。而排卵前大卵泡數(shù)的多少代表著可能的排卵率[8]。高能飼

糧母豬卵巢重及大卵泡數(shù)的增加，可能引起排卵率、配種后胚胎數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)的相應(yīng)提高。另外，本研究中，不同能量水平對(duì)小卵泡數(shù)無顯著影響，這與王延忠[8]、周東勝[9]的結(jié)論有所不同，可能是由于飼糧中添加油脂的種類差異所致。

表4 飼糧能量水平對(duì)后背母豬卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表達(dá)量的影響

3.2飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)的影響

關(guān)于飼糧能量水平對(duì)后備母豬卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)影響的研究較少，本研究中，飼糧能量水平引起卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量的顯著變化，高能可促進(jìn)卵巢FSHR和LH/CGRmRNA的表達(dá)，且高能組FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量最高，均顯著高于低能組，這與王延忠[8]的結(jié)論一致。這種顯著性差異同樣表現(xiàn)在50日齡初情期前小母豬的卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量上[11]。由此表明，飼糧能量水平對(duì)卵巢FSHR和LH/CGRmRNA表達(dá)量的差異影響具有長(zhǎng)期效應(yīng)，可能貫穿初情期前母豬的整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)。

眾所周知，促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)是調(diào)控母畜繁殖系統(tǒng)的重要激素，F(xiàn)SH可啟動(dòng)卵泡征集，促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟至排卵前階段；LH與FSH協(xié)同促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)成熟，并可誘發(fā)排卵。FSH、LH的生理作用是通過分別與FSHR和LH/CGR特異性結(jié)合所介導(dǎo)。能量因素影響卵巢上FSHR和LH/CGR表達(dá)的分子機(jī)制，目前還不是十分明了，可能通過調(diào)節(jié)卵巢FSHR和LH/CGR的表達(dá)而改變卵泡對(duì)FSH、LH的敏感性，從而達(dá)到刺激卵泡發(fā)育、提高排卵率和產(chǎn)仔數(shù)的目的[11]，具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究揭示。

4 結(jié) 論

① 提高飼糧能量水平可增加后備母豬卵巢重量，增加大卵泡數(shù)。

② 提高飼糧能量水平有利于促進(jìn)后備母豬卵巢FSHR和LH/CGRmRNA的表達(dá)。

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Author, LIANG Hongyan, associate professor, E-mail: 237298089@qq.com

(責(zé)任編輯 田艷明)

Effects of Dietary Energy Level on Ovary Development and Related Gene Expression of Prepubertal Gilts

LIANG Hongyan ZHAO Chunxia HAN Hua

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Da’qing 163319, China)

This study aimed to study the effects of dietary energy level on ovary development and mRNA expression of follicle stimulating hormone receptor (FSHR) and luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor (LH/CGR) of prepubertal gilts. Twenty-seven crossbred (Landrace×Yorkshire) gilts with the body weight of (61.0±3.1) kg were selected and randomly allocated to 3 groups with 3 replicates each and 3 pigs in each replicate, and were fed diets with different energy levels which were 90%, 100% and 110% digestible energy (DE) recommended by NRC (1998), respectively. Gilts in all groups were taken the same average daily feed intake in experimental period, but got different DE. Gilts were slaughtered on the 19thday of the 2ndestrus cycle. The results showed that ovary weight and the number of large follicles were significantly higher in the high energy group than those in the low energy group (P<0.05). Whereas the number of small follicles had no significant difference among the three energy level groups (P>0.05). The high energy group had the highestFSHRandLH/CGRmRNA expression levels, which were significantly higher than those in the low energy group (P<0.05). In conclusion, higher dietary energy level has significant positive effects on ovary development, and promotes the expression ofFSHRandLH/CGRin ovary of prepubertal gilts.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3287-3292]

energy level; prepubertal gilts; ovary development; gene expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.032

2017-02-22

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校級(jí)博士啟動(dòng)基金(校啟B2009-20)

梁鴻雁(1969—)，女，黑龍江鶴崗人，副教授，博士，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境調(diào)控研究。E-mail： 237298089@qq.com

S828

：A

：1006-267X(2017)09-3287-06