鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟抗氧化能力和白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6分布和表達(dá)的影響

程 群 姜淑貞 陳寧波 黃麗波 張桂國(guó) 楊維仁

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018)

鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟抗氧化能力和白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6分布和表達(dá)的影響

程 群 姜淑貞 陳寧波 黃麗波 張桂國(guó) 楊維仁*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018)

本試驗(yàn)旨在研究自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟抗氧化能力和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)分布和表達(dá)的影響。選擇35日齡平均體重為(8.45±0.94) kg的健康三元雜交(杜×長(zhǎng)×大)斷奶仔豬母豬40頭，隨機(jī)分為2組，每組20頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，鐮刀菌毒素組飼喂含鐮刀菌毒素[玉米赤霉烯酮(ZEN)0.90 mg/kg；嘔吐毒素(DON)1.43 mg/kg，煙曲霉毒素(FUM)5.85 mg/kg]的試驗(yàn)飼糧。預(yù)試期7 d，正試期35 d。結(jié)果表明：1)與對(duì)照組相比，鐮刀菌毒素顯著降低了斷奶仔豬血清和脾臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(P<0.05)，顯著升高了丙二醛(MDA)含量(P<0.05)。2)鐮刀菌毒素使斷奶仔豬脾臟白髓區(qū)明顯變小，紅髓區(qū)擴(kuò)張且出現(xiàn)近圓形小空洞，動(dòng)脈周圍淋巴鞘中淋巴細(xì)胞數(shù)量較少。3)鐮刀菌毒素導(dǎo)致斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于白髓邊緣，且靠近血竇的地方陽(yáng)性點(diǎn)更多。4)與對(duì)照組相比，鐮刀菌毒素顯著升高了斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。由此可見(jiàn)，飼糧中鐮刀菌毒素顯著影響斷奶仔豬血清和脾臟抗氧化能力，并通過(guò)改變脾臟IL-1β和IL-6的分布和表達(dá)，降低脾臟的免疫功能。

斷奶仔豬；鐮刀菌毒素；白細(xì)胞介素-1β；白細(xì)胞介素-6；脾臟

鐮刀菌屬是污染糧食和飼料的主要霉菌菌屬之一[1]，其中對(duì)動(dòng)物健康及生產(chǎn)危害最大的鐮刀菌毒素包括玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)和煙曲霉毒素(fumonisin，F(xiàn)UM)[2]。鐮刀菌毒素廣泛分布于自然界中，能污染人類食品和畜禽飼糧，引起人和動(dòng)物的急性或非急性中毒，甚至死亡[3]。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂多種鐮刀菌毒素[2或3 mg/kg DON，1.3 mg/kg雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)，1.5 mg/kg ZEN]污染的飼糧，仔豬的肝臟、小腸和淋巴器官出現(xiàn)一定程度的病理學(xué)損傷，淋巴結(jié)和脾臟出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[4]。研究表明，不產(chǎn)生細(xì)胞毒性劑量的單一鐮刀菌毒素[DON、NIV、ZEN和伏馬毒素B1(FB1)]混合染毒后，導(dǎo)致豬空腸上皮細(xì)胞活性顯著降低，其中4種毒素聯(lián)合的毒性最強(qiáng)[5]；且多種鐮刀菌毒素的聯(lián)合作用可破壞細(xì)胞因子間的平衡，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)]的產(chǎn)生，從而加重組織甚至整個(gè)機(jī)體的炎性反應(yīng)[6]。目前有關(guān)鐮刀菌毒素的研究主要集中在豬(肝臟、腸道)和小鼠上，且多為對(duì)單一毒素的研究。而結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，研究實(shí)際生產(chǎn)條件下鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟影響的報(bào)道甚少。本試驗(yàn)旨在研究鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟和血清抗氧化能力的影響，并從組織學(xué)和分子生物學(xué)水平系統(tǒng)探討其對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β、IL-6分布和表達(dá)的影響，為減輕鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟的免疫損傷和指導(dǎo)斷奶仔豬健康生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本課題組從山東省多個(gè)飼料廠和養(yǎng)殖場(chǎng)抽檢飼料原料樣品，檢測(cè)其霉菌毒素含量，調(diào)查霉菌毒素污染狀況。從中選擇毒素水平低于檢測(cè)限的原料配制基礎(chǔ)飼糧，選擇自然霉變玉米和自然霉變玉米蛋白粉配制鐮刀菌毒素飼糧。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇35日齡平均體重為(8.45±0.94) kg的健康三元雜交(杜×長(zhǎng)×大)斷奶仔豬母豬40頭，隨機(jī)分成2組，每組20頭，各組間初始體重差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)仔豬單欄飼養(yǎng)，自由采食和飲水。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，鐮刀菌毒素組用50%自然霉變玉米和50%自然霉變玉米蛋白粉替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉，鐮刀菌毒素組飼糧中含0.90 mg/kg ZEN、1.43 mg/kg DON、5.85 mg/kg FUM。預(yù)試期7 d，正試期35 d。所有試驗(yàn)飼糧在試驗(yàn)開(kāi)始前一次性配齊，于干燥陰涼處保存?；A(chǔ)飼糧參考NRC(2012)[7]標(biāo)準(zhǔn)配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目Items對(duì)照組Controlgroup鐮刀菌毒素組Fusariumtoxinsgroup黃曲霉毒素AFL——煙曲霉毒素FUM340.005846.50T-2毒素T-2toxin——

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of diets：VA 3 300 IU，VD3330 IU，VE 24 IU，VK30.75 mg，VB11.50 mg，VB25.25 mg，VB62.25 mg，VB120.026 mg，泛酸 pantothenic acid 15.00 mg，尼克酸 niacin 22.5 mg，生物素 biotin 0.075 mg，葉酸 folic acid 0.45 mg，Mn 6.00 mg，F(xiàn)e 150 mg，Zn 150 mg，Cu 9.00 mg，I 0.21 mg，Se 0.45 mg。

2)粗蛋白質(zhì)為實(shí)測(cè)值，其他為計(jì)算值。CP was a measured value, while the others were calculated values.

3)實(shí)測(cè)值 Measured values。

1.3樣本采集

在試驗(yàn)第35天晨飼前每組隨機(jī)選擇10頭仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血。用真空促凝采血管采血約10 mL，3 000 r/min離心10 min制備血清，分裝于1.5 mL離心管中，用于血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。采血后仔豬電擊致死，剖開(kāi)腹腔，在脾臟中段剪取10 cm左右的樣品，用生理鹽水洗凈血液并將樣品均勻裁切成兩段，一段置于Bouin’s液中固定，用于免疫組化切片的制作；另一段放入5 mL無(wú)菌凍存管中，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱用于mRNA表達(dá)量的測(cè)定；其余脾臟組織-20 ℃凍存，用于脾臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。

1.4指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 飼糧毒素含量

在試驗(yàn)開(kāi)始前和結(jié)束后分別取飼糧樣品，用以分析飼糧毒素含量和粗蛋白質(zhì)水平[8]。ZEN、黃曲霉毒素(AFL)、T-2毒素和FUM含量的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和熒光測(cè)定法，DON含量的測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC)法。ZEN、DON、AFL、FUM和T-2毒素含量的最低檢測(cè)限分別為0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、1.0 μg/kg、0.25 mg/kg和1.0 μg/kg。飼糧毒素含量見(jiàn)表1，AFL和T-2毒素未檢出或含量低于檢測(cè)限水平。

1.4.2 血清抗氧化指標(biāo)

血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定，血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性采用化學(xué)比色法測(cè)定，血清丙二醛(MDA)含量采用比色法測(cè)定。T-SOD活性測(cè)試試劑盒(A001-1)、GSH-Px活性測(cè)試試劑盒(A005)和MDA含量測(cè)試試劑盒(A003)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體測(cè)定方法均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 脾臟抗氧化指標(biāo)

取出脾臟組織，在冰面上解凍后，按重量體積比加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿(10 000～15 000 r/min)，冷凍離心機(jī)離心(4 ℃，3 000 r/min)15 min，吸取上清液分裝備用。GSH-Px、T-SOD活性和MDA含量的測(cè)定方法同1.4.2。

1.4.4 蘇木精-伊紅(HE)染色

取Bouin’s液中固定好的脾臟組織進(jìn)行流水沖洗，經(jīng)乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制成石蠟組織塊，用切片機(jī)(LEICA RM2135，德國(guó))進(jìn)行切片，片厚5 μm。將制備好的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精至蒸餾水。蘇木素染色10 min；鹽酸酒精分化5 s，自來(lái)水中藍(lán)化15 min；伊紅染色10 s，經(jīng)95%乙醇、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，明視野顯微鏡下觀察。

1.4.5 免疫組化[鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法]

取Bouin’s液中固定好的脾臟組織，修塊后用乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，采用BMJ23型包埋機(jī)包埋。具體步驟為：1)切片機(jī)(LEICA RM2135，德國(guó))進(jìn)行切片(5 μm)，常規(guī)脫蠟至水。2)檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol/L，pH 7.2)洗3次，5 min/次(下同)。3)3%過(guò)氧化氫(H2O2)室溫避光孵育30 min，用以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗3次。4)10%胎牛血清37 ℃封閉孵育1 h。5)分別加一抗兔抗IL-6(1∶150)多克隆抗體(bs-4587R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和兔抗IL-1β(1∶150)多克隆抗體(bs-0812R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次。6)加生物素化羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(1∶200)二抗(SPN-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37 ℃恒溫箱中孵育1 h，PBS洗3次。7)加辣根過(guò)氧化物酶 鏈霉素親和素(1∶200)，37 ℃孵育45 min，PBS洗3次。8)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)[ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，濃縮液：緩沖液(V/V)=1∶20]顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，控制顯色時(shí)間。9)蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，在明視野顯微鏡下觀察免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布規(guī)律(陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色)。

1.4.6 脾臟IL-6和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量

根據(jù)GenBank已報(bào)道的豬的IL-1β、IL-6和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因(內(nèi)參基因)序列，用Primer 6.0設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，引物由上海生物工程公司合成(表2)。

表2 IL-1β、IL-6和GAPDH基因的引物序列

取-80 ℃保存的脾臟樣品50～100 mg，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)(Invitrogen公司，美國(guó))提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，結(jié)果顯示260和280 nm光密度(OD)比值均在1.8～2.0。檢測(cè)后的總RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScript@RTMaster Mix Perfect Real Time試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作(TaKaRa Coad：DDR036A，Lot：BK1302，反應(yīng)體積為20 μL)。按照TaKaRa公司的熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑(TaKaRa公司，大連)，反應(yīng)體系為20 μL，組成為10 μL SYBR Primerx Ex Taq，0.4 μL上游引物(10 μmol/L)，0.4 μL下游引物(10 μmol/L)，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cDNA和6.8 μL dH2O。其擴(kuò)增條件均為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃檢測(cè)熒光信號(hào)。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果用2-△△Ct[9]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析基因IL-1β、IL-6 mRNA在脾臟中的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和脾臟相對(duì)重量的影響

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能影響的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鐮刀菌毒素顯著降低了斷奶仔豬的平均日增重(ADG)(P<0.05)[10]。

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟相對(duì)重量影響的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟相對(duì)重量無(wú)顯著影響(P>0.05)?？梢?jiàn)，脾臟組織無(wú)肉眼可見(jiàn)的病理變化。

2.2鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬血清和脾臟抗氧化指標(biāo)的影響

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬血清和脾臟抗氧化指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。由表可知，鐮刀菌毒素顯著降低了斷奶仔豬血清和脾臟GSH-Px和T-SOD活性(P<0.05)，顯著升高了MDA含量(P<0.05)。證明鐮刀菌毒素組斷奶仔豬的脾臟有一定程度的氧化損傷。

表3 鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬血清和脾臟抗氧化指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.3鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟組織病理學(xué)變化的影響

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟組織病理學(xué)變化的影響見(jiàn)圖1。由圖可知，對(duì)照組斷奶仔豬脾臟未見(jiàn)明顯病變，白髓區(qū)細(xì)胞排列均一，胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色(A處黃箭頭)。而鐮刀菌毒素組斷奶仔豬脾臟的組織學(xué)形態(tài)發(fā)生了明顯變化，白髓區(qū)明顯變小，紅髓區(qū)擴(kuò)張且出現(xiàn)近圓形小空洞(B處紅箭頭)，動(dòng)脈周圍淋巴鞘中淋巴細(xì)胞數(shù)量較少。脾臟組織切片從形態(tài)學(xué)證明了鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬的脾臟造成了組織病理?yè)p傷。

A和B均表示白髓區(qū)，黃箭頭表示正常白髓區(qū)，紅箭頭表示病變的白髓區(qū)。

A and B were white pulp area, yellow arrows indicated normal white pulp area and red arrows indicated lesion white pulp area.

圖1鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟組織病理學(xué)變化的影響

Fig.1 Effects ofFusariumtoxins on splenic histopathological changes of weaned piglets

2.4鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6分布的影響

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6分布的影響見(jiàn)圖2。由圖可知，對(duì)照組斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6的陽(yáng)性細(xì)胞主要分散存在于白髓區(qū)，且染色較淺數(shù)量較少(紅箭頭)；

鐮刀菌毒素組斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6的陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于白髓邊緣，且靠近血竇的地方陽(yáng)性點(diǎn)更多(黃圈)。圖中清晰可見(jiàn)的陽(yáng)性點(diǎn)進(jìn)一步證明了鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬的脾臟造成了明顯損傷。

紅色箭頭表示IL-1β和IL-6的免疫陽(yáng)性細(xì)胞，黃色圓圈表示陽(yáng)性細(xì)胞集中區(qū)。

Red arrows indicated immune positive cells of IL-1β and IL-6, and yellow circle indicated the concentrated area of positive cells.

圖2鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6分布的影響

Fig.2 Effects ofFusariumtoxins on the distributions of IL-1β and IL-6 in spleen of weaned piglets (400×)

2.5鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響見(jiàn)圖3。由圖可知，與對(duì)照組相比，鐮刀菌毒素顯著升高了斷奶仔豬脾臟IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。通過(guò)對(duì)脾臟IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，可以更加肯定鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬造成了脾臟損傷。

3 討 論

本試驗(yàn)采用已知鐮刀菌毒素含量的自然霉變玉米和自然霉變玉米蛋白粉配制鐮刀菌毒素污染飼糧。由于鐮刀菌毒素污染的普遍性，本試驗(yàn)在保證試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性的基礎(chǔ)上對(duì)飼料原料進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選，然而遺憾的是對(duì)照組飼糧中仍然檢測(cè)到少量的鐮刀菌毒素，但各毒素含量均遠(yuǎn)低于我國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[11-12](ZEN含量<0.5 mg/kg，GB13078.2—2006；DON含量<1 mg/kg，GB13078.3—2007；我國(guó)對(duì)于飼料中FUM含量還沒(méi)有制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn))和歐盟關(guān)于仔豬飼糧中ZEN、DON和FUM含量分別<0.1、0.9和5 mg/kg的最高限量規(guī)定[13]，且鐮刀菌毒素組鐮刀菌毒素含量遠(yuǎn)超過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)，因此可以認(rèn)為對(duì)照組鐮刀菌毒素含量不影響試驗(yàn)組結(jié)果的判斷。

3.1鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬血清和脾臟抗氧化能力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷是鐮刀菌毒素危害動(dòng)物健康的毒性機(jī)理之一[14-16]，GSH-Px、T-SOD和MDA是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[17-19]。據(jù)報(bào)道，ZEN和DON會(huì)阻斷鞘磷脂代謝，使細(xì)胞產(chǎn)生大量MDA，引起脂質(zhì)過(guò)氧化[20]。細(xì)胞聯(lián)合毒性試驗(yàn)結(jié)果也表明，鐮刀菌毒素(DON和ZEN)能通過(guò)損害細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)[20-21]和加速自由基的產(chǎn)生來(lái)加速細(xì)胞的過(guò)氧化反應(yīng)[22]，造成某些臟器的氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，肉雞采食自然霉變飼糧(102.08 μg/kg AFL，281.92 μg/kg ZEN，5 874.38 μg/kg FUM，2 038.96 μg/kg DON)后，血清T-SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鐮刀菌毒素組斷奶仔豬血清和脾臟T-SOD和GSH-Px活性均顯著低于對(duì)照組，MDA含量顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了鐮刀菌毒素可能引起脾臟氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脾臟損傷。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖3鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β和

IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

Fig.3 Effects ofFusariumtoxins on the relative expression ofIL-1β andIL-6 mRNA in spleen of weaned piglets

3.2鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟組織病理?yè)p傷的影響

脾臟是由紅髓和白髓組成的最大外周免疫器官，在維持機(jī)體免疫應(yīng)答中有重要作用。紅髓參與破壞損傷和衰老的紅細(xì)胞、濾過(guò)和吞噬抗原物質(zhì)；白髓包括動(dòng)脈周圍淋巴細(xì)胞鞘、濾泡和邊緣區(qū)，是體液免疫的主要場(chǎng)所。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠飼糧中每千克體重添加40 mg/kg ZEA(相當(dāng)于1 mg ZEA/d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾臟組織病理學(xué)發(fā)生了改變，脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少，脾細(xì)胞、紅髓腫脹和白髓萎縮，誘導(dǎo)了免疫系統(tǒng)受損[24]。也有研究表明，給斷奶雌鼠飼喂添加10 mg/kg ZEA(相當(dāng)于1.5 mg/kg/d)飼糧8周后，沒(méi)有觀察到脾臟組織的病理學(xué)變化[25]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌毒素組斷奶仔豬脾臟組織白髓區(qū)明顯變小，紅髓區(qū)擴(kuò)張，且出現(xiàn)許多空泡樣變性，動(dòng)脈周圍淋巴鞘中淋巴細(xì)胞數(shù)量也較少，表明脾臟受到了損傷，與Dong等[26]試驗(yàn)結(jié)果相似。脾臟的損傷可能是3種鐮刀菌毒素聯(lián)合作用的結(jié)果，其作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3鐮刀菌毒素對(duì)斷奶仔豬脾臟IL-1β、IL-6分布和mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

IL-1β和IL-6含量的高低可作為反映機(jī)體損傷程度的重要生理指標(biāo)[27]。IL-1β是一種多肽調(diào)節(jié)因子，能在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)做出急性反應(yīng)，局部組織內(nèi)持續(xù)大量合成IL-1β，會(huì)加速局部炎癥反應(yīng)[28-29]，使機(jī)體釋放大量細(xì)胞因子，可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)[30]。IL-6是一種多效性炎性因子，具有抗炎癥細(xì)胞因子及促炎癥細(xì)胞因子的雙重作用，在炎癥反應(yīng)中起到很重要的調(diào)節(jié)作用[31-32]。在研究多種霉菌毒素單獨(dú)和聯(lián)合的免疫毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，霉菌毒素能夠提高小鼠、仔豬以及肉雞脾臟IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)量[33-35]。已有研究表明，動(dòng)物采食鐮刀菌毒素能通過(guò)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞調(diào)亡或改變免疫相關(guān)基因的表達(dá)引起免疫機(jī)能下降[36]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鐮刀菌毒素組炎性因子IL-1β和IL-6在斷奶仔豬脾臟組織中主要分布于白髓邊緣，尤其是橢圓體中，這可能是由于鐮刀菌毒素引起了脾臟的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，熒光定量PCR結(jié)果顯示，鐮刀菌毒素組仔豬脾臟炎性因子IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，從基因表達(dá)水平說(shuō)明脾臟發(fā)生了損傷。關(guān)于脾臟炎性因子在免疫中的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究和探索。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，鐮刀菌毒素污染飼糧(0.90 mg/kg ZEN，1.43 mg/kg DON，5.85 mg/kg FUM)影響了斷奶仔豬脾臟的抗氧化功能以及炎性因子IL-1β和IL-6的分布，增加了脾臟IL-6和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量，并造成了一定程度的病理學(xué)損傷，影響了脾臟功能的發(fā)揮。

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*Corresponding author, professor, E-mail: wryang@sdau.edu.cn

(責(zé)任編輯 李慧英)

Effects of Fusarium Toxins on Antioxidant Capacity and Distribution and Expression of Interleukin-1β and Interleukin-6 in Spleen of Weaned Piglets

CHENG Qun JIANG Shuzhen CHEN Ningbo HUANG Libo ZHANG Guiguo YANG Weiren*

(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

The aims of the present study were to investigate the effects ofFusariumtoxins in naturally contaminated diet on antioxidant capacity and distribution and expression of interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in spleen of weaned piglets. Forty healthy female weaned piglets (Duroc×Landrace×Yorkshire) aged at 35 days with an average body weight of (8.45±0.94) kg were randomly allocated into 2 groups with 20 piglets per group. Piglets in control group were fed a basal diet, and the others inFusariumtoxins group were fedFusariumtoxins [0.90 mg/kg zearalenone (ZEN); 1.43 mg/kg deoxynivalenol (DON); 5.85 mg/kg fumonisin (FUM)] contaminated experimental diet. The experiment lasted for 35 days after 7 days adaptation. The results showed as follows: 1) compared with the control group,Fusariumtoxins significantly decreased the activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) and total superoxide dismutase (T-SOD) in serum and spleen of weaned piglets (P<0.05), whereas significantly increased the content of malondialdehyde (MDA) in serum and spleen (P<0.05). 2)Fusariumtoxins significantly reduced the white pulp zone in spleen of weaned piglets, enlarged the red pulp zone and appeared round small cavity, while only a few lymphocytes were seen in the peripheral lymphatic sheath. 3) The positive cells of IL-1β and IL-6 in spleen of weaned piglets were mainly distributed in the edge of the white pulp, and concentrated area of positive cells were found near the blood sinus in spleen after exposure toFusariumtoxins. 4) Compared with the control group,Fusariumtoxins significantly increased the relative expression ofIL-1β andIL-6 mRNA in spleen of weaned piglets (P<0.05). It is suggested that dietaryFusariumtoxins has significant effects on antioxidant capacity in serum and spleen, and decreases the immune function in spleen by changing distribution and expression of IL-1β and IL-6 in spleen of weaned piglets.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3267-3276]

weaned piglets;Fusariumtoxins; interleukin-1β; interleukin-6; spleen

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.030

2017-03-05

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)資金(SDAIT-08-05)

程 群(1991—)，女，山東萊陽(yáng)人，碩士研究生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: 18854886553@163.com

*通信作者：楊維仁，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: wryang@sdau.edu.cn

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