畢赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病機(jī)理初探

羅琳 周泠璇 劉婭

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

畢赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病機(jī)理初探

羅琳 周泠璇 劉婭

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

針對(duì)新疆紅提葡萄中分離的生防菌株——畢赤酵母G5，以葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）為靶標(biāo)菌，研究了G5對(duì)葡萄灰霉菌孢子及對(duì)葡萄果實(shí)內(nèi)5種關(guān)鍵酶活性的影響，初步探討了G5拮抗葡萄采后灰霉病的機(jī)理。采用離體（in vitro）實(shí)驗(yàn)與活體（in vivo）實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)畢赤酵母菌G5拮抗葡萄灰霉病的機(jī)理進(jìn)行探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母菌株G5對(duì)葡萄灰霉菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，對(duì)灰霉菌絲的抑制率最高為80.20%，對(duì)灰霉孢子抑制率達(dá)86.89%；兩者間存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，有重寄生現(xiàn)象產(chǎn)生，拮抗菌自身并不分泌抗菌物質(zhì)。此外，該菌株能誘導(dǎo)果實(shí)體內(nèi)過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶的酶活性，使其酶活性有顯著提高，說(shuō)明畢赤酵母G5可以有效的誘導(dǎo)果實(shí)內(nèi)抗病相關(guān)酶的活性，增強(qiáng)對(duì)灰霉病的抑制效果。畢赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病的機(jī)理主要包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)抗病性，是否有重寄生作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

葡萄灰霉?。簧锓乐危划叧嘟湍窯5；拮抗機(jī)理

葡萄皮薄肉軟、水分含量多，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)［1］。但貯運(yùn)過(guò)程中易受到損傷，引起病原菌入侵導(dǎo)致腐爛，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［2，3］。據(jù)報(bào)道，每年我國(guó)由于采收、包裝、貯藏等技術(shù)原因，葡萄爛果損失率高達(dá)總產(chǎn)量的20%［4］。葡萄灰霉病是葡萄果實(shí)采后最大的病害之一［5］，目前采用的防治方法多為化學(xué)類抗菌劑，但隨著灰霉菌抗藥性的增強(qiáng)，防效有所下降，加之化學(xué)防治對(duì)環(huán)境和人體健康存在潛在危害，尋找安全、高效的防治方法已勢(shì)在必行。

生物防治因其低污染、低殘留、環(huán)境友好、安全性高等明顯優(yōu)于化學(xué)防治的優(yōu)勢(shì)，已成為果蔬采后病害防治的研究熱點(diǎn)，其中拮抗酵母菌具有適應(yīng)果蔬采后貯藏條件、不產(chǎn)生抗菌素等優(yōu)勢(shì)，近20年來(lái)生防酵母菌的研究日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［6］。Wisniewski等［7］認(rèn)為理想的拮抗酵母菌應(yīng)滿足以下需求：能穩(wěn)定遺傳，對(duì)病原菌有廣譜抑菌作用，在逆境下能良好生存，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求簡(jiǎn)單，易于配制，對(duì)寄主及人體健康無(wú)危害等。至今已有多種拮抗酵母菌應(yīng)用于桃、番茄、葡萄等果蔬病害的防治。如季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）可防治葡萄灰霉病［8］、番茄根腐病［9］；季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondi）可防治油桃灰霉病、桃灰霉病［10］；羅倫隱球酵母（Ctyptoccus laurentii）可防治灰霉病、褐腐病、桃根腐病、櫻桃褐腐?。?1-12］。研究表明，目前，拮抗酵母的主要抗菌機(jī)理包括分泌抗菌素［13］、營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)［14-16］、重寄生作用［17，18］及誘導(dǎo)作用［19］。

本實(shí)驗(yàn)菌株為從新疆紅提葡萄中篩選出一株內(nèi)生生防菌株——畢赤酵母G5，前期拮抗實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)葡萄灰霉病有抑制作用。為明晰其拮抗葡萄灰霉病的機(jī)理，從拮抗菌對(duì)病原菌孢子萌發(fā)，拮抗菌與病原菌的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，重寄生作用及誘導(dǎo)酶活性等方面進(jìn)行研究，旨為生防制劑的開發(fā)、研制、使用及提高生物防效等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料與試劑 紅提葡萄：新疆石河子143團(tuán)采摘的紅提葡萄（Red Grape），大小成熟度一致、顆粒飽滿、無(wú)病蟲害。供試生防菌株：畢赤酵母G5（Pichia），分離自新疆紅提葡萄。供試病原菌株：葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea），由北京市農(nóng)林科學(xué)院提供?；瘜W(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；MJX-1500型智能霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；THZ-98型恒溫振蕩器（太倉(cāng)市華美生化儀器廠）；G560E型通用漩渦混勻器（北京科技有限公司）；OLRMPUS CX41型顯微鏡（北京悅馳恒業(yè)儀器科技有限公司）；SW-CG-1C V型微生物潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 15 g，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，pH 7.2，蒸餾水 1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 拮抗酵母菌發(fā)酵液的制備 將拮抗酵母菌活化后挑取一環(huán)，接種于無(wú)菌的NB培養(yǎng)液中，28℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，所得菌液即為發(fā)酵液。

1.2.2 病原菌孢子懸浮液的制備 用接種環(huán)在培養(yǎng)好的葡萄灰霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到0.85%的無(wú)菌生理鹽水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整至所需濃度，備用。

1.2.3 營(yíng)養(yǎng)與空間競(jìng)爭(zhēng) 葡萄灰霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定：采用生長(zhǎng)速率法［20］檢測(cè)畢赤酵母菌G5對(duì)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響。取畢赤酵母菌G5的發(fā)酵液、和空白NB培養(yǎng)液，用無(wú)菌水分別稀釋至5倍、50倍、500倍系列梯度濃度。然后每個(gè)梯度各取1 mL于平皿內(nèi)，倒入9 mL融化好的無(wú)菌PDA培養(yǎng)基，待凝固后在平板中央接種葡萄灰霉病菌菌餅（6 mm），將加入等量無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，每處理重復(fù)3次。25℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算不同濃度的G5發(fā)酵液對(duì)葡萄灰霉菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率。

葡萄灰霉菌孢子萌發(fā)抑制率的測(cè)定：取酵母菌G5的發(fā)酵液，用無(wú)菌水分別稀釋至 5 倍、50 倍、500 倍系列梯度濃度。再取葡萄灰霉病菌孢子懸浮液（孢子濃度1×106CFU/mL）及上述不同濃度供試發(fā)酵液各10 μL，滴于凹玻片中，以5%葡萄糖溶液作為對(duì)照，混勻后25℃培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，8 h后于光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)及萌發(fā)后芽管生長(zhǎng)情況。

平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)：采用平板對(duì)峙法［21］，同時(shí)以單獨(dú)接種灰霉菌菌餅的平板為對(duì)照，25℃培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌落直徑［22］。每組3個(gè)，重復(fù)3次。

PDA混菌培養(yǎng)：將畢赤酵母菌G5和葡萄灰霉菌孢子分別制成濃度為104CFU/mL的菌懸液。分別吸取1 mL混合涂布于PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d后觀察平板內(nèi)菌落生長(zhǎng)情況。

抑菌圈實(shí)驗(yàn)［23］：用無(wú)菌打孔器在PDA培養(yǎng)基中心打一個(gè)孔，接入畢赤酵母菌，以中心線為軸，畢赤酵母菌兩邊分別打一個(gè)孔接入葡萄灰霉菌。25℃下培養(yǎng)5 d后觀察，以不接種畢赤酵母菌的平板為對(duì)照，每組3個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.4 重寄生作用 將直徑6 mm的灰霉菌菌餅放于 PDA 平板中央，然后等距離3 cm處接畢赤酵母菌，25℃培養(yǎng)7 d，挑取病菌菌落邊緣的菌絲置于事先滴有無(wú)菌水的載玻片上，壓片后在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。以只接灰霉病菌的作對(duì)照，每組3個(gè)，重復(fù)3次。1.2.5 拮抗酵母菌處理對(duì)葡萄果實(shí)中酶活性的影響1.2.5.1 紅提葡萄果實(shí)的處理與取樣 將畢赤酵母菌G5和葡萄灰霉菌分別制成108CFU/mL和106CFU/mL的菌懸液。選擇新鮮飽滿無(wú)病害的紅提葡萄果粒作為試驗(yàn)材料，洗凈并吸干多余水分后放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，用無(wú)菌水清洗2遍，常溫晾干，備用。每組40粒。用滅過(guò)菌的打孔器在葡萄果實(shí)中間部位打一寬3 mm、深4 mm的孔，形成一個(gè)傷口，常溫下放置2 h自然晾干。將拮抗菌菌懸液分別接入不同組葡萄的傷口中，每孔注入20 μL，以接入20 μL無(wú)菌水作為對(duì)照組，放置2 h自然晾干后再各接入20 μL病原菌孢子懸浮液，放置2 h自然晾干后置于25℃條件下貯藏。

處理后分別在第1、2、3、4、5天取果實(shí)果肉進(jìn)行相關(guān)酶活性的檢測(cè)。取果肉樣品時(shí)，應(yīng)先輕輕刮去果實(shí)傷口，取病斑與完好組織交接部位的果肉。1.2.5.2 拮抗酵母菌處理對(duì)葡萄果實(shí)中酶活性的影響 參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)》中所述方法進(jìn)行酶液的制備［24］。取1 g果肉樣品，加入6 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8，含1%PVP），在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃，10 000 r/min離心20 min。收集上清液作為粗酶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

過(guò)氧化物酶（POD）：采用愈創(chuàng)木酚法［25］。多酚氧化酶（PPO）：采用鄰苯二酚比色法［26］。苯丙氨酸解氨酶（PAL）：參考劉郵洲［27］和申宏波等［28］的方法對(duì)葡萄果實(shí)的PAL活性進(jìn)行測(cè)定。幾丁質(zhì)酶（CHI）：采用DNS法［28-30］。β-1，3-葡聚糖酶（GLU）：采用3，5-二硝基水楊酸法［31］。

2 結(jié)果

2.1 營(yíng)養(yǎng)與空間競(jìng)爭(zhēng)

通過(guò)對(duì)灰霉菌菌絲及其孢子萌發(fā)的研究，探討畢赤酵母菌G5對(duì)灰霉菌的抑制效果并判斷其拮抗機(jī)理是否包含分泌抑菌物質(zhì)。

通過(guò)表1、表2可看出，各梯度濃度的發(fā)酵液對(duì)葡萄灰霉菌的菌絲生長(zhǎng)以及分生孢子的萌發(fā)和芽管的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。對(duì)灰霉菌絲的抑制率最高至80.20%，對(duì)灰霉孢子抑制率達(dá)到86.89%。盡管隨著稀釋倍數(shù)的增大，抑制作用逐漸減弱，但是將發(fā)酵液原液濃度稀釋500倍時(shí)對(duì)灰霉菌菌絲仍有34.38%的抑制率，對(duì)分生孢子的抑制率達(dá)到46.67%。由此可見(jiàn)，拮抗酵母菌對(duì)葡萄灰霉孢子的萌發(fā)有著明顯的抑制作用。

表1 畢赤酵母菌G5對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表2 畢赤酵母菌G5對(duì)葡萄灰霉菌孢子萌發(fā)的影響

2.2 畢赤酵母菌對(duì)葡萄灰霉菌的抑制作用

畢赤酵母對(duì)葡萄灰霉菌抑制效果明顯（圖1），能有效的限制病原菌的生長(zhǎng)蔓延。但是在PDA混菌培養(yǎng)過(guò)程中兩種微生物皆可在培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，兩種菌落之間沒(méi)有明顯的交界?？赏茰y(cè)，畢赤酵母能通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)并消耗有限的營(yíng)養(yǎng)來(lái)抑制病原菌生長(zhǎng)，但是在營(yíng)養(yǎng)充分的條件下并不能有效發(fā)揮抑制作用。抑菌圈實(shí)驗(yàn)中無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，說(shuō)明產(chǎn)生抑菌物質(zhì)并不是畢赤酵母拮抗葡萄灰霉病菌的機(jī)理。

圖1 畢赤酵母菌G5對(duì)葡萄灰霉菌的抑制作用

2.3 畢赤酵母菌對(duì)葡萄灰霉菌的重寄生作用

圖2顯示，對(duì)照組葡萄灰霉菌菌落邊緣圓滑而整齊，菌落邊緣新生的菌絲比較稀疏，內(nèi)部的菌絲生長(zhǎng)較茂密。實(shí)驗(yàn)組葡萄灰霉菌菌落的邊緣同對(duì)照組一樣，圓滑而整齊，但菌絲的生長(zhǎng)速度明顯變緩，生長(zhǎng)量也明顯減少，而菌落較對(duì)照組厚且密。挑取兩組病原菌菌落邊緣的菌絲置于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的菌絲粗細(xì)均勻、舒展而飽滿，而實(shí)驗(yàn)組的菌絲則粗細(xì)不均勻，部分菌絲有膨大、變形甚至出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象，發(fā)生了畸變。推測(cè)拮抗酵母菌能夠向體外分泌胞外水解酶，發(fā)生了重寄生現(xiàn)象，導(dǎo)致菌絲變形。

2.4 畢赤酵母菌處理對(duì)紅提葡萄果實(shí)中酶活性的影響

圖3是經(jīng)畢赤酵母菌誘導(dǎo)處理后的紅提葡萄果實(shí)及對(duì)照組的各類活性變化趨勢(shì)?？梢钥闯?，葡萄灰霉菌單獨(dú)接種的果實(shí)與誘導(dǎo)處理后的果實(shí)均可使酶活性提升。對(duì)照組果實(shí)的酶活性在貯藏前期略微上升，上升后活性開始呈下降趨勢(shì)。而經(jīng)過(guò)處理后的果實(shí)酶活性變化趨勢(shì)大體上與對(duì)照組一致，但其酶活性明顯始終高于對(duì)照組。果實(shí)在內(nèi)生拮抗酵母菌G5的誘導(dǎo)下，POD、PPO、PAL、GLU活性在第2天時(shí)達(dá)到酶活高峰，分別高于對(duì)照組29.32%、27.50%、51.57%、61.72%；CHI活性在第3 天達(dá)到酶活高峰，高于對(duì)照組121%。說(shuō)明畢赤酵母菌G5可以誘導(dǎo)葡萄果實(shí)內(nèi)酶活性的提升。

3 討論

圖2 畢赤酵母菌G5對(duì)葡萄灰霉菌的重寄生作用

通過(guò)研究畢赤酵母對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響、孢子萌發(fā)的影響、抑制作用、重寄生作用以及誘導(dǎo)果實(shí)酶活性5個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)，初步探討了酵母菌的拮抗機(jī)理。其中，畢赤酵母菌G5對(duì)葡萄灰霉菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子的萌發(fā)以及芽管的伸長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，使其發(fā)生形態(tài)上的畸變，證明畢赤酵母能有效抑制葡萄灰霉菌的生長(zhǎng)。抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)拮抗葡萄灰霉菌，但在營(yíng)養(yǎng)充分的條件下其畢赤酵母不能很好的抑制葡萄灰霉菌的生長(zhǎng)。且畢赤酵母不通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)對(duì)葡萄灰霉菌進(jìn)行拮抗，抑菌圈實(shí)驗(yàn)中并無(wú)抑菌圈生成。

圖3 貯藏期間紅提葡萄果實(shí)各種酶活性的變化

過(guò)氧化物酶是植物細(xì)胞內(nèi)的重要組成部分，對(duì)真菌病原菌孢子的萌發(fā)有直接抑制作用，并能誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生一系列的防衛(wèi)反應(yīng)。多酚氧化酶可以催化宿主植物細(xì)胞中木質(zhì)素及醌類物質(zhì)的形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽使植物細(xì)胞免受病原菌的侵害，從而提高宿主植物的抗性。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，參與植物細(xì)胞中木質(zhì)素與植保素的合成，這二者均可對(duì)植物病原菌的入侵形成屏障，增加植物的抗病性。幾丁質(zhì)酶可以催化植物病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，使其水解生成N-乙酰葡萄糖胺，從而抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)，提高宿主植物抗病的能力。β-1，3-葡聚糖酶是植物過(guò)敏反應(yīng)中合成的重要酶類，可以催化分解植物病原真菌菌絲尖端裸露的β-1，3-葡聚糖，使菌絲壁降解，從而使植物免受病原真菌的侵害。Droby等［32］研究發(fā)現(xiàn)假絲酵母在拮抗葡萄采后青霉菌過(guò)程中，可以使幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖的活性提升，進(jìn)而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗性。Ippllito等［33］發(fā)現(xiàn)拮抗酵母菌可以誘導(dǎo)蘋果中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和過(guò)氧化物酶活性的增加。已有研究表明拮抗酵母菌可以提高酶的活性，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗性［34］。本研究中關(guān)于酶的結(jié)論與前人研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

分離自紅提葡萄表面的內(nèi)生拮抗畢赤酵母菌G5拮抗葡萄灰霉病的主要機(jī)理包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)抗性，是否發(fā)生重寄生作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去證明。該菌株在拮抗過(guò)程中可以有效抑制葡萄灰霉孢子、菌絲的萌發(fā)和生長(zhǎng)，提高葡萄果實(shí)內(nèi)酶的活性。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Preliminary Probe on Antagonistic Mechanisms of the Pichia pastoris G5 Against Botrytis cinerea

LUO Lin ZHOU Ling-xuan LIU Ya
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000）

Considering the Pichia pastoris G5，a biocontrol strain isolated from red grape in Xinjiang and using Botrytis cinerea as target strain，we studied the effects of G5 on the spore of B. cinerea and the activities of five enzymes in the red grape fruit，and primarily explored the antagonistic mechanisms of G5 against B. cinerea by in vitro and in vivo experiment. Results showed that the G5 obviously inhibited the germination of B. cinerea spores and the growth of mycelium，and the rate of inhibiting mycelium maximally reached 80.20% and the rate of inhibiting spore germination was 86.89%. Nutritional competition existed between the G5 and B. cinerea. In the course of antagonism，the heavy parasitism phenomenon occurred. Experiment sindicated that G5 itself did not secrete antimicrobial substances. In addition，the strain induced and significantly increased the enzymes’ activities in fruit，such as peroxidase，polyphenol oxidase，phenylalanine ammonia lyase，chitinase，and β-1，3-glucanase. The inhibition mechanisms of G5 to B. cinerea include nutrition competition and inducible resistance；whether or not there is heavy parasitism needs to be further validated.

Botrytis cinerea；biological control；Pichia pastoris G5；antagonistic mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0238

2017-03-28

兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)（2014BB006）

羅琳，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏；E-mail：568674373@qq.com

劉婭，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)；E-mail：441487042@qq.com