紫外誘變馴化提高釀酒酵母木糖發(fā)酵的抑制物耐受性

張譯之 茍敏 湯岳琴

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065）

紫外誘變馴化提高釀酒酵母木糖發(fā)酵的抑制物耐受性

張譯之 茍敏 湯岳琴

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065）

利用馴化和紫外處理結(jié)合馴化的手段對(duì)一株木糖發(fā)酵工業(yè)菌株的抑制物耐受性進(jìn)行提升。在反復(fù)批次培養(yǎng)過(guò)程中不斷提高含9種抑制物的混合抑制物濃度，使細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵逐漸適應(yīng)高濃度抑制物環(huán)境，分離突變菌株并進(jìn)行評(píng)價(jià)。紫外處理結(jié)合馴化比直接馴化能更有效的提升細(xì)胞對(duì)高濃度抑制物的耐受能力；通過(guò)突變菌株分離和篩選，獲得3株抑制物耐受能力高于出發(fā)菌株的突變菌株，它們?cè)谝种莆餄舛?00%MI（甲酸 1 g/L，乙酸 3.5 g/L，乙酰丙酸 1.5 g/L，糠醛 1.5 g/L，5-羥甲基糠醛 1.5 g/L，丁香醛0.1 g/L，香草醛 0.1 g/L，松柏醛0.025 g/L，肉桂酸 0.025 g/L）條件下的木糖消耗率比出發(fā)菌株高出11.3%-23.2%。紫外誘變處理結(jié)合馴化過(guò)程可以有效提高釀酒酵母對(duì)混合抑制物的耐受性。

釀酒酵母；抑制物耐受；燃料乙醇；木糖利用

燃料乙醇是可替代化石能源的一種清潔可再生能源，其生產(chǎn)技術(shù)研發(fā)受到全球關(guān)注［1］。木質(zhì)纖維素原料如農(nóng)業(yè)秸稈等具有廉價(jià)、可再生、來(lái)源廣泛、不存在“與人爭(zhēng)糧”等優(yōu)點(diǎn)，是今后燃料乙醇生產(chǎn)的主要原料。木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過(guò)預(yù)處理和水解轉(zhuǎn)化為單糖，主要是葡萄糖和木糖，微生物發(fā)酵單糖可產(chǎn)生乙醇。釀酒酵母具有優(yōu)秀的產(chǎn)乙醇能力和環(huán)境耐受力等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于乙醇的生產(chǎn)，但釀酒酵母用于纖維素原料的燃料乙醇生產(chǎn)，面臨兩個(gè)重要問(wèn)題，一是木糖的發(fā)酵，二是對(duì)各種抑制物的耐受能力。傳統(tǒng)的釀酒酵母不能利用木糖產(chǎn)乙醇，需要外源導(dǎo)入木糖還原酶（Xylose reductase，XR）基因和木糖醇脫氫酶（Xylitol dehydrogenase，XDH）基因或木糖異構(gòu)酶（Xylose isomerase，XI）基因，使之具備利用木糖的能力［2］。到目前為止，已構(gòu)建出較多的優(yōu)秀木糖發(fā)酵菌株［3-5］。但是相比木糖的發(fā)酵，菌株是否具有優(yōu)秀的抑制物耐受能力直接決定了菌株能否應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程。木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理和水解過(guò)程中產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，主要包括弱酸類（甲酸、乙酸和乙酰丙酸）、呋喃類（糠醛、5-羥甲基糠醛）和酚類（丁香醛、香草醛和苯酚等）［6］，它們的存在會(huì)嚴(yán)重阻礙釀酒酵母菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵［7］，因此提高釀酒酵母的抑制物耐受性對(duì)燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)尤為重要。

目前有關(guān)釀酒酵母抑制物耐受性的研究主要集中在兩個(gè)方面，一是通過(guò)調(diào)控某些基因的表達(dá)提高菌株的抑制物耐受性；二是通過(guò)進(jìn)化工程提高菌株的抑制物耐受性［8］?；虮磉_(dá)調(diào)控的前提是對(duì)某種或某類抑制物的抑制機(jī)制清楚，涉及的目標(biāo)基因明確且數(shù)量較少，目前在此研究方向有一些研究報(bào)道，但多是針對(duì)單一抑制物［9，10］，因此基因工程手段對(duì)于提升菌株同時(shí)對(duì)多種抑制物的耐受比較困難。由于目前對(duì)釀酒酵母的抑制物耐受機(jī)制了解甚少，相比基因工程手段，利用進(jìn)化工程提升菌株的抑制物耐受性具有一定的優(yōu)勢(shì)［11］。已有的一些研究報(bào)道，包括針對(duì)單一抑制物、混合抑制物、及利用實(shí)際糖化液進(jìn)行馴化，結(jié)果都表明進(jìn)化工程是一個(gè)能有效提升抑制物耐受性的手段［12］。但目前相關(guān)研究存在以下問(wèn)題：（1）針對(duì)葡萄糖發(fā)酵研究較多，針對(duì)木糖發(fā)酵的相關(guān)研究較少，而木糖發(fā)酵受抑制物抑制的程度顯著高于葡萄糖發(fā)酵［12，13］；（2）研究多針對(duì)單一抑制物，即使是混合抑制物，種類也多局限于兩種［14-16］；（3）利用實(shí)際糖化液進(jìn)行馴化，對(duì)于獲得能耐受某種特定糖化液是有效的，但獲得的耐受菌株不一定就能適應(yīng)其它糖化液的發(fā)酵，因?yàn)樵?、預(yù)處理及水解過(guò)程會(huì)顯著影響抑制物組成和分布［17］；（4）絕大部分研究使用的是實(shí)驗(yàn)室菌株，其與工業(yè)菌株間遺傳背景的顯著差異使研究成果難以適用于工業(yè)菌株。因此，要構(gòu)建能適用于纖維素燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的菌株，需要針對(duì)工業(yè)菌株的木糖發(fā)酵過(guò)程提升其對(duì)各種抑制物的耐受性，使菌株具有一定的普適性。

本課題組以工業(yè)釀酒酵母菌株KF-7為出發(fā)菌株，通過(guò)基因工程手段構(gòu)建了性能優(yōu)良的木糖發(fā)酵工業(yè)菌株［18-20］，具備優(yōu)良木糖發(fā)酵性能且對(duì)多種抑制物具有較好的耐受能力［18］。但這些菌株利用實(shí)際糖化液發(fā)酵時(shí)木糖的利用被顯著抑制，表明需要提升菌株對(duì)于多種抑制物共存時(shí)的耐受力。本研究以木糖發(fā)酵工業(yè)菌株KF7-M16為出發(fā)菌株［19］，通過(guò)紫外誘變和馴化工程組合手段，提升其在木糖發(fā)酵條件下對(duì)3類共9種典型抑制物［21-23］共存時(shí)的耐受能力，以期獲得具有工業(yè)應(yīng)用潛力的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究使用菌株為具有絮凝性的工業(yè)釀酒酵母KF7-M16［19］，異源表達(dá)了畢赤酵母的木糖還原酶（XR）基因XYL1和木糖醇脫氫酶（XDH）基因XYL2以及釀酒酵母的木酮糖激酶（XK）基因XKS1，能利用木糖產(chǎn)生乙醇。

1.1.2 培養(yǎng)基和抑制物 表1和表2為混合抑制物（Mixed inhibitors，MI）和培養(yǎng)基組成。所有培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至5，在1×105Pa、121℃滅菌15 min備用。抑制物過(guò)濾滅菌后添加至滅菌后的培養(yǎng)基。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%的瓊脂粉。

表1 混合抑制物（MI）組成

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變和馴化 將出發(fā)菌株KF7-M16在2%YPD平板上于30℃下活化24 h，用接種環(huán)取一環(huán)菌體，接種在5%YPD培養(yǎng)基內(nèi)于30℃下160 r/min預(yù)培養(yǎng)16 h。將培養(yǎng)液稀釋，取1 mL加入含有5 mL 0.05 mol/L EDTA 液體的培養(yǎng)皿內(nèi)（為了保證后續(xù)馴化初始活菌體數(shù)量，紫外誘變時(shí)準(zhǔn)備多個(gè)平行樣）。在不斷攪拌液體的狀態(tài)下，紫外燈照射培養(yǎng)皿150 s（細(xì)胞存活率約10%），收集液體離心去上清液，將處理后細(xì)胞用于馴化過(guò)程接種（SUV）。馴化使用的培養(yǎng)基為2.5%YPDX，馴化過(guò)程中混合抑制物濃度從40%MI開(kāi)始逐步提升至100%MI。使用含100 mL培養(yǎng)液的300 mL三角瓶，在溫度為30℃，培養(yǎng)液攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，微好氧條件下進(jìn)行馴化培養(yǎng)。每批傳代培養(yǎng)初始接種濃度為OD6600.5。在每一批的培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)取樣分析細(xì)胞濃度（OD660）、葡萄糖、木糖和乙醇濃度。當(dāng)木糖被大量消耗時(shí)進(jìn)行下一次傳代，一直至抑制物濃度達(dá)到100%MI。100%MI條件下第3次轉(zhuǎn)接馴化后，一部分細(xì)胞用于轉(zhuǎn)接繼續(xù)馴化，另一部分細(xì)胞進(jìn)行了第2次紫外誘變（DUV），誘變處理后的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行了100%MI條件下的馴化。作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行了無(wú)紫外處理的馴化（N），馴化過(guò)程中的抑制物濃度從40%MI提升至100%MI。

表2 培養(yǎng)基組成

1.2.2 突變菌株分離 取100%MI條件下馴化獲得的培養(yǎng)液，稀釋后涂布于2.5%YPDX+80%MI平板上，于30℃下培養(yǎng)，挑取單菌落，并轉(zhuǎn)移到新的2.5%YPDX+80%MI平板上進(jìn)行菌落純化。從無(wú)紫外處理馴化體系（N）、一次紫外處理馴化體系（SUV）和二次紫外處理馴化體系（DUV）分別挑取50株突變菌株，分別命名為N01-50，SUV01-50和DUV01-50，用于后續(xù)菌株篩選。

1.2.3 突變菌株生長(zhǎng)篩選 在30℃條件下，將各菌株于2%YPD平板上活化24 h，用牙簽挑取少量細(xì)胞，接種于含3 mL 2.5%YPDX+80%MI培養(yǎng)基的15 mL試管中，于100 r/min，30℃下培養(yǎng)17 h，測(cè)定培養(yǎng)液的細(xì)胞濃度（OD660），比較各菌株的生長(zhǎng)情況，對(duì)菌株進(jìn)行初次生長(zhǎng)篩選。將初次生長(zhǎng)篩選中優(yōu)秀的菌株進(jìn)行二次生長(zhǎng)篩選，方法同上，但培養(yǎng)基中的抑制物濃度為100%MI。

1.2.4 突變菌株木糖利用評(píng)價(jià) 將菌株在2%YPD平板中活化24 h后，用接種環(huán)取一環(huán)菌體接種于含100 mL 5%YPD液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、160 r/min搖床預(yù)培養(yǎng)16 h。取10 mL預(yù)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，接種到裝有100 mL 2.5%YPDX+100%MI培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，置于30℃恒溫水浴鍋，200 r/min條件下限氧發(fā)酵144 h。取樣分析細(xì)胞濃度（OD660）、葡萄糖和木糖濃度。

1.2.5 分析方法 取5 mL培養(yǎng)液于4℃、12 000×g離心2 min，分別收集菌體和上清液。于所得菌體中加入50 mmol/L EDTA溶液分散細(xì)胞，稀釋后用UV-VIS分光光度計(jì)（JASCO，日本）測(cè)定光密度值（OD660）。上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用于測(cè)定葡萄糖、木糖和乙醇濃度。利用高效液相色譜儀（LC-10AD VP，島津，日本）分析葡萄糖和木糖濃度，檢測(cè)器為RF-10AXL，爐溫為150℃，柱溫為65℃［24］；利用氣相色譜（GC353B，GL Sciences，日本）測(cè)定乙醇濃度，異丙醇為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)器為FID，爐溫為50℃，注射器和檢測(cè)器溫度均為180℃［24］。

2 結(jié)果

2.1 反復(fù)批次馴化培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)、糖消耗及乙醇生成

對(duì)紫外處理細(xì)胞（SUV，DUV）和無(wú)紫外處理細(xì)胞（N）共進(jìn)行了16次批次馴化培養(yǎng)，其中40%MI條件下1批次，60%MI條件下4批次，80%MI條件下5批次，100%MI條件下6批次。第1和第2批次每批培養(yǎng)周期為4 d，第3到第16批次每批培養(yǎng)周期為5 d，每批次培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞濃度、葡萄糖濃度、木糖濃度和乙醇濃度的變化如圖1所示。

如圖1-A所示，馴化啟動(dòng)時(shí)（第1批次）的抑制物濃度為40%MI，無(wú)論細(xì)胞是否進(jìn)行了紫外誘變，細(xì)胞生長(zhǎng)都相對(duì)比較緩慢，有紫外處理的體系4 d后的細(xì)胞濃度（OD6608.2）略高于無(wú)紫外處理的（OD6606.42）。從第2批次開(kāi)始，提高抑制物濃度至60%MI，隨轉(zhuǎn)接次數(shù)增加細(xì)胞生長(zhǎng)速率逐漸升高，第5批次時(shí)有和無(wú)紫外處理體系的細(xì)胞濃度分別為15.92和14.48，表明馴化過(guò)程有效地提升了細(xì)胞在抑制條件下的生長(zhǎng)能力。當(dāng)抑制物濃度提高到80%MI以后，5個(gè)批次的轉(zhuǎn)接過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)能力沒(méi)有下降，能維持和60%MI條件下相近的生長(zhǎng)能力，有和無(wú)紫外處理體系的細(xì)胞生長(zhǎng)情況相近，沒(méi)有明顯差異。當(dāng)抑制物濃度提高到100%MI時(shí)（第11批次），兩體系的細(xì)胞生長(zhǎng)顯著被抑制，培養(yǎng)5 d后細(xì)胞濃度只有5左右，但轉(zhuǎn)接后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速恢復(fù)，達(dá)到80%MI條件下相近水平。后續(xù)的幾批馴化中，第13和第15批次有紫外處理體系的細(xì)胞生長(zhǎng)要優(yōu)于無(wú)紫外處理體系，而第14和第16批次中則沒(méi)有明顯差異。通過(guò)以上結(jié)果可以看出，通過(guò)馴化過(guò)程，在40%-100%MI抑制物濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)可以保持相對(duì)穩(wěn)定，5 d后的細(xì)胞濃度可以達(dá)到OD66015-20。

圖1-B為各批次培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度的變化。可以看出，啟動(dòng)的第1批次，兩體系中葡萄糖需要2 d才被完全消耗，轉(zhuǎn)接后在60%MI條件下，兩體系的葡萄糖在1 d內(nèi)可被完全消耗。當(dāng)抑制物濃度提高至80%MI時(shí)，兩體系的葡萄糖利用速率均下降，需要2 d才能被消耗，但在該抑制物濃度下第4次轉(zhuǎn)接時(shí)（第10批次），紫外處理體系的葡萄糖則可在1 d內(nèi)被完全消耗。當(dāng)抑制物濃度提升至100%MI后，葡萄糖的消耗速率明顯下降，第11批次中，兩體系都需要4 d才能被完全消耗，主要可能是由于細(xì)胞生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制。后續(xù)的幾個(gè)批次中，盡管數(shù)據(jù)有波動(dòng)，但可以看出紫外處理體系的葡萄糖利用速率要明顯優(yōu)于無(wú)紫外處理體系，第15和16批次中，紫外處理體系中的葡萄糖消耗只需1 d而無(wú)紫外處理體系需要3 d。以上結(jié)果可以看出，通過(guò)馴化過(guò)程，在40%-100%MI抑制物濃度范圍內(nèi)，有紫外處理的體系中的葡萄糖可以在1 d內(nèi)被完全利用，但對(duì)于無(wú)紫外處理體系，隨抑制物濃度升高，葡萄糖的利用速率隨之下降，馴化的作用不顯著。

圖1-C為各批次培養(yǎng)過(guò)程中木糖濃度的變化?？梢钥闯?，馴化啟動(dòng)的第1批次，無(wú)紫外處理和有紫外處理體系4 d后的木糖消耗率分別只有30%和43.5%，但轉(zhuǎn)接后木糖消耗率逐步提升，60%MI條件下兩體系的木糖消耗率能達(dá)到80%以上（第4批次）。當(dāng)抑制物濃度提高至80%MI時(shí)，木糖利用略有下降，但通過(guò)馴化，兩體系的木糖消耗率能達(dá)到80%以上。當(dāng)抑制物濃度提高到100%MI時(shí)（第11批次），和葡萄糖的消耗一樣，木糖消耗顯著被抑制，5 d后的木糖消耗速率只有15%左右，但轉(zhuǎn)接后，木糖利用迅速恢復(fù)。盡管后續(xù)各批次間有波動(dòng)，但有紫外處理體系的木糖消耗率可以達(dá)到85%，而無(wú)紫外處理體系的木糖消耗率則明顯低于有紫外處理體系，這與兩體系葡萄糖消耗的差異一致。該結(jié)果表明，在100%MI抑制物濃度條件下，有紫外處理體系具有更好的糖利用能力，其抑制物耐受能力更強(qiáng)。

圖1-D為各批次培養(yǎng)過(guò)程中乙醇濃度的變化。從基于總糖（包括葡萄糖和木糖）消耗計(jì)算的乙醇收率可以看出，在40%到80%MI抑制物條件下，兩體系的乙醇收率相近，約為0.24-0.26，但當(dāng)抑制物濃度提高至100%MI后，無(wú)紫外處理體系的乙醇收率下降至0.22左右，表明對(duì)于無(wú)紫外處理體系，高的抑制物濃度不僅抑制了糖的消耗同時(shí)也影響乙醇收率，馴化的效果明顯不如有紫外處理體系。

100%MI抑制物條件下二次紫外處理再馴化未能有效提升細(xì)胞生長(zhǎng)和糖消耗，第16批次時(shí)的糖消耗情況和一次紫外處理體系接近（圖1）。

以上結(jié)果表明，在抑制物條件下進(jìn)行馴化可以有效的提升細(xì)胞的抑制物耐受，提高細(xì)胞在高抑制強(qiáng)度下的生長(zhǎng)和糖的利用，而馴化前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行紫外處理可以使細(xì)胞獲得更好的抑制物耐受能力，顯著提高細(xì)胞在高抑制條件下的糖利用能力。

圖1 馴化過(guò)程中細(xì)胞濃度（A、B），糖濃度（C）和乙醇濃度（D）的變化

2.2 突變菌株分離和高抑制條件下的生長(zhǎng)篩選

從第16批次3個(gè)馴化體系分離單菌株，從各體系隨機(jī)挑選了50株菌株進(jìn)行試管培養(yǎng)，在80%MI抑制條件下比較了它們的生長(zhǎng)情況。無(wú)紫外處理（N）和有紫外處理體系（SUV，DUV）的各50株單菌的生長(zhǎng)均好于出發(fā)菌株KF7-M16。無(wú)紫外處理體系的50株單菌的OD660在0.257-1.041之間（圖2-A），而有紫外處理體系的50株單菌的OD660在0.562-1.654之間（圖2-B），有紫外處理體系單菌株的生長(zhǎng)情況總體上優(yōu)于無(wú)紫外處理體系的單菌株。對(duì)于二次紫外處理體系的單菌株，OD660在0.076-1.175之間（圖2-C），和無(wú)紫外處理和一次紫外處理體系的單菌株相比，菌株間的差異比較大，少量菌株的生長(zhǎng)明顯比出發(fā)菌株弱，而少量菌株的生長(zhǎng)明顯強(qiáng)于一次紫外處理體系的單菌株，表明二次紫外處理對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了比較明顯的影響。

選擇上述三體系中生長(zhǎng)較好的菌株（無(wú)紫外體系OD660>0.6時(shí)的17株，一次紫外處理體系OD660>0.8時(shí)的33株，二次紫外處理體系OD660>0.6時(shí)的16株）共66株，在100%MI抑制條件下，進(jìn)行了二次生長(zhǎng)篩選，結(jié)果如圖3-D所示。66株單菌株的OD660在0.125-0.547之間，顯著低于80%MI條件下的生長(zhǎng)情況。與出發(fā)菌株生長(zhǎng)相近的菌株，大部分是二次紫外處理體系的單菌株，而生長(zhǎng)比較好的菌株中大部分是一次紫外處理體系的菌株。該結(jié)果表明，二次紫外處理可能對(duì)細(xì)胞造成了比較大的影響，導(dǎo)致部分分離菌株的生長(zhǎng)能力下降。

2.3 高抑制條件下突變菌株對(duì)木糖的利用

對(duì)2.2中100%MI條件下前17 h生長(zhǎng)最優(yōu)秀的10株分離菌株（無(wú)紫外處理體系2株，一次紫外處理體系6株，二次紫外處理體系2株）進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以出發(fā)菌株KF7-M16為對(duì)照，評(píng)價(jià)它們?cè)?00%MI抑制條件下對(duì)木糖的利用情況。發(fā)酵144 h后細(xì)胞濃度以及木糖利用率，如表3所示?？梢钥闯觯挥蟹蛛x自一次紫外處理體系的3株菌株SUV33，SUV40和SUV43的木糖利用率大于出發(fā)菌株，分別為81.4%、95.4%和89.5%，同時(shí)這3株菌株的細(xì)胞濃度也高于出發(fā)菌株。3株突變菌株的基于消耗糖的乙醇收率（0.23-0.24）和出發(fā)菌株（0.22）相比略有提升。從表3還可以看出，高的細(xì)胞濃度并不一定就有高的木糖利用率，但低細(xì)胞濃度會(huì)導(dǎo)致低的木糖消耗。有4株菌株的細(xì)胞濃度明顯低于出發(fā)菌株，表明2.2中使用短時(shí)間培養(yǎng)（17 h）進(jìn)行菌株篩選可能會(huì)造成一些后期生長(zhǎng)有優(yōu)勢(shì)的菌株丟失。

圖2 抑制條件下各馴化體系分離菌株的生長(zhǎng)評(píng)價(jià)

表3 100%MI抑制物條件下突變菌株的發(fā)酵結(jié)果

3 討論

抑制物耐受性能優(yōu)良的木糖發(fā)酵菌株是纖維素燃料乙醇生產(chǎn)所必需的。纖維素原料水解液中同時(shí)含多種抑制物，而這些抑制物如何影響釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的機(jī)制尚不清楚，因此相比基因工程手段，馴化工程手段更適合用于抑制物耐受菌株的育種。本研究比較了直接馴化和紫外處理后，馴化對(duì)提升工業(yè)釀酒酵母菌株木糖發(fā)酵時(shí)的抑制物耐受能力的效果，結(jié)果表明紫外處理后馴化具有更好的效果，其中一個(gè)原因可能是紫外處理過(guò)程導(dǎo)致的突變使得細(xì)胞具有遺傳多樣性，在后續(xù)的馴化過(guò)程中獲得目標(biāo)突變菌株的幾率得到提高。有研究也報(bào)道了在馴化前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行突變處理可以有效的提升馴化效果［25］。本研究使用的出發(fā)菌株本身就具有較好的抑制物耐受性，要在此基礎(chǔ)上再進(jìn)一步提高其抑制物耐受性相對(duì)比較困難；同時(shí)本研究考慮的抑制物種類多，它們同時(shí)存在時(shí)抑制效應(yīng)嚴(yán)重。也導(dǎo)致提升抑制物耐受很困難，這些也是在本研究中紫外處理對(duì)提升抑制物耐受性具有明顯貢獻(xiàn)的原因。但從二次紫外處理馴化體系的結(jié)果可以看出，一次以上的紫外處理對(duì)抑制物耐受提升沒(méi)有貢獻(xiàn)，反而會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)和發(fā)酵能力下降，抑制物耐受能力降低。顯然，重復(fù)的紫外處理導(dǎo)致基因組突變范圍擴(kuò)大，細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝受到影響，從而難以獲得保持良好生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的抑制物耐受菌株。

本研究使用了含9種抑制物的抑制物混合物進(jìn)行菌株的馴化，這9種抑制物包含了纖維素糖化液中典型的抑制物（弱酸類、呋喃醛），以及文獻(xiàn)中報(bào)道的在糖化液中檢測(cè)到的4種酚類等化合物，目的是希望獲得的突變菌株能夠具有更好的普適性。這9種抑制物的存在顯著抑制了出發(fā)菌株的木糖消耗，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，木糖消耗緩慢。通過(guò)馴化，細(xì)胞生長(zhǎng)和木糖利用能力得到了比較明顯的提升。目前尚沒(méi)有可在同時(shí)含這9種抑制物的條件下（如100%MI）能夠進(jìn)行木糖發(fā)酵的同類菌株的報(bào)道。目前有關(guān)提升木糖發(fā)酵菌株的抑制物耐受性的研究中所涉及的抑制物種類都比較單一，如乙酸［14］、甲酸［26］、呋喃醛［10］、丁香醛［27，28］、香草醛［29］及松柏醛［30］。這些研究也表明，要使木糖發(fā)酵菌株具有能同時(shí)耐受多種抑制物的能力，難度非常大。優(yōu)良的出發(fā)菌株、合理的研究設(shè)計(jì)和有效的技術(shù)手段是可能獲得目標(biāo)菌株的關(guān)鍵。

本研究最后分離篩選獲得三株抑制物耐受高于出發(fā)菌株的突變菌株，但這些菌株的發(fā)酵性能和原馴化體系的發(fā)酵性能（圖1）相比并沒(méi)有提高，且各突變菌株細(xì)胞濃度顯著低于馴化體系。之所以在馴化后進(jìn)行突變菌株的分離和篩選是基于以下考慮：原馴化體系中存在各種隨機(jī)突變細(xì)胞，細(xì)胞間在抑制物耐受以及生長(zhǎng)和發(fā)酵性能上會(huì)有很大差異，馴化體系的發(fā)酵結(jié)果是這些細(xì)胞群體表現(xiàn)，從中可以獲得比群體表現(xiàn)更優(yōu)秀的突變菌株。但突變菌株的分離和篩選并沒(méi)有獲得預(yù)期結(jié)果，可能有以下兩個(gè)方面的原因：（1）馴化體系中細(xì)胞可能具備不同的抗抑制機(jī)制，它們同時(shí)存在，在功能上相互補(bǔ)充，使細(xì)胞群體比單一突變菌株表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能；（2）突變菌株的篩選是基于培養(yǎng)初期的細(xì)胞生長(zhǎng)，而初期生長(zhǎng)最有優(yōu)勢(shì)的菌株反而發(fā)酵能力弱。因此，基于培養(yǎng)初期細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行突變菌株的篩選會(huì)丟失一些后期生長(zhǎng)有優(yōu)勢(shì)，且發(fā)酵能力強(qiáng)的突變菌株?；谝陨峡紤]，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大突變菌株的篩選范圍以期獲得更多性能優(yōu)良的突變菌株，然后利用細(xì)胞融合、基因組改組（Genome shuffling）等手段將各突變菌株的優(yōu)良特性進(jìn)行整合，構(gòu)建出更優(yōu)秀的抑制物耐受菌株，為纖維素燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株來(lái)源。

4 結(jié)論

本研究比較了9種抑制物同時(shí)共存脅迫條件下，直接馴化和紫外處理結(jié)合馴化的手段對(duì)提升木糖發(fā)酵工業(yè)菌株KF7-M16的抑制物耐受性的效果，結(jié)果表明紫外處理結(jié)合馴化比直接馴化能更有效的提升細(xì)胞對(duì)高濃度混合抑制物的耐受能力。通過(guò)突變菌株分離和篩選，獲得3株抑制物耐受能力高于出發(fā)菌株的突變菌株，它們?cè)谝种莆餄舛?00%MI條件下的木糖利用率比出發(fā)菌株高11.3%-23.2%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Improvement of Inhibitor Tolerance of a Xylose-Fermenting Industrial Saccharomyces cerevisiae Strain Through UV Mutation and Acclimation

ZHANG Yi-zhi GOU Min TANG Yue-qin
（College of Architecture and Environment，Sichuan University，Chengdu 610065）

The inhibitor tolerance of a xylose-fermenting industrial Saccharomyces cerevisiae strain was improved through direct acclimation or ultraviolet mutation combined with acclimation. During the repeated batch incubations，the concentration of the mixed inhibitors，containing nine kinds of typical inhibitors，was gradually increased to make cells adapt to the high inhibitor concentration. UV mutation combined with acclimation improved the tolerance of cells to inhibitors with high concentrations more effectively than direct acclimation. By the isolation and screening of mutation strains，three mutation strains with better inhibitor tolerance than the original strain were obtained. They showed 11.3%-23.2% higher xylose consumption ratios than the original strain when fermenting xylose under the inhibitory condition of 100% MI（formic acid 1 g/L，acetic acid 3.5 g/L，levulic acid 1.5 g/L，furfural 1.5 g/L，5-hydroxymethylfurfural（5-HMF）1.5 g/L，syringaldehyde 0.1 g/L，vanillin 0.1 g/L，coniferaldehyde 0.025 g/L，cinnamic acid 0.025 g/L）. UV mutation combined with acclimation improved the tolerance of S. cerevisiae strain to mixed inhibitors.

Saccharomyces cerevisiae；inhibitor tolerance；fuel ethanol；xylose utilization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0285

2017-04-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170093）

張譯之，女，碩士研究生，研究方向：釀酒酵母抑制物耐受；E-mail：757802937@qq.com

湯岳琴，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：有機(jī)廢棄物資源化；E-mail：tangyq@scu.edu.cn