快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的分子標(biāo)記技術(shù)

馬光昌，王曉妮，牛黎明，龔 治，溫海波，金啟安，彭正強(qiáng)

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101)

快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的分子標(biāo)記技術(shù)

馬光昌，王曉妮，牛黎明，龔 治，溫海波，金啟安，彭正強(qiáng)*

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101)

新菠蘿灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley)是一種嚴(yán)重為害劍麻、番荔枝等經(jīng)濟(jì)作物的入侵性害蟲(chóng)。由于粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)體型較小，且外部形態(tài)十分相似，難以達(dá)到快速準(zhǔn)確識(shí)別。本文利用分子標(biāo)記技術(shù)，研究了新菠蘿灰粉蚧的快速鑒定方法。通過(guò)對(duì)新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種粉蚧的序列進(jìn)行分析，針對(duì)新菠蘿灰粉蚧設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，其擴(kuò)增片段大小為552 bp(GenBank登錄號(hào)為MF 363108)，該引物對(duì)其它7種粉蚧沒(méi)有擴(kuò)增能力。該引物不僅對(duì)新菠蘿灰粉蚧成蟲(chóng)具有擴(kuò)增效能，對(duì)1齡若蟲(chóng)、2齡若蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)都具有同樣的擴(kuò)增能力，其最低檢出閾值為437.5 pg/μL。該技術(shù)的建立，實(shí)現(xiàn)了在劍麻等苗木調(diào)運(yùn)過(guò)程中對(duì)新菠蘿灰粉蚧的快速準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)對(duì)新菠蘿灰粉蚧的檢疫和監(jiān)測(cè)也具有重要的意義。

新菠蘿灰粉蚧；分子標(biāo)記；快速鑒定；特異性擴(kuò)增

新菠蘿灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley)屬半翅目Hemiptera，粉蚧科Pseudococcidae，潔粉蚧屬Dysmicoccus(Beardsley，1959)，被我國(guó)列為進(jìn)境植物檢疫性有害生物。該蟲(chóng)主要分布在美國(guó)夏威夷、墨西哥、巴哈馬群島、西印度群島、哥倫比亞以及巴西等地區(qū)，是當(dāng)?shù)匕l(fā)生最嚴(yán)重的一種有害生物。

新菠蘿灰粉蚧寄主廣泛，主要為害劍麻、菠蘿、柑橘、番茄、可可和香蕉等農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物(Jaymaetal.，1992；林曉佳等，2013)，尤其是劍麻為害最為嚴(yán)重。在1998年，該害蟲(chóng)首次在我國(guó)海南省昌江縣劍麻產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)，為新入侵海南害蟲(chóng)。該害蟲(chóng)為胎生，有群集的習(xí)性，主要在劍麻的根、莖、葉片部位聚集，且可隱藏在劍麻葉片的裂縫和翹皮下(張小冬等，2008)。該害蟲(chóng)主要刺吸劍麻的汁液，以嫩葉為主，影響劍麻的生長(zhǎng)發(fā)育，其分泌蜜露可引致煤煙病，直接影響劍麻的產(chǎn)量和質(zhì)量，危害嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致劍麻植株死亡。近年來(lái)，該蟲(chóng)在海南和廣東劍麻產(chǎn)區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，造成劍麻減產(chǎn)多達(dá)30%(陳澤坦等，2010)。

新菠蘿灰粉蚧雌成蟲(chóng)蟲(chóng)體呈橢圓形，體外被白色蠟質(zhì)分泌物覆蓋。體長(zhǎng)約2.5-4.5 mm，寬約1.5-2.0 mm。觸角細(xì)索狀，共8節(jié)，尾端有2根顯著伸長(zhǎng)的臀瓣刺。1齡若蟲(chóng)蟲(chóng)體呈長(zhǎng)橢圓形，體色為淡黃色，體長(zhǎng)約0.5 mm，單眼1對(duì)，紅色。后期背部有少量均勻的蠟質(zhì)分布。2齡若蟲(chóng)體色由黃褐色變淡灰色加深。達(dá)到3若蟲(chóng)時(shí)蟲(chóng)體被自身所分泌的蠟質(zhì)物均勻覆蓋(Beardsley，1965；湯祊德，1992；王子清，2001；張小冬等，2008)。由于蚧蟲(chóng)體極小，單憑傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)方法(個(gè)體大小、剛毛的長(zhǎng)短和透明孔的有無(wú)等特征)進(jìn)行鑒定耗時(shí)耗力。因此，本文針對(duì)新菠蘿灰粉蚧研究了其快速分子鑒定技術(shù)，同時(shí)以扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等粉蚧為靶標(biāo)進(jìn)行了特異性檢驗(yàn)。研究結(jié)果旨為有效地阻止新菠蘿灰粉蚧通過(guò)劍麻苗木調(diào)運(yùn)等方式從疫區(qū)向非疫區(qū)為害或向其他寄主蔓延，盡可能降低其所造成的經(jīng)濟(jì)損失和傳播擴(kuò)散的速度，保障國(guó)家的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全及其產(chǎn)品貿(mào)易安全。

1 材料與方法

1.1 供試材料

將野外采集到的粉蚧標(biāo)本浸泡于95%酒精放入-20℃冰箱中備用。經(jīng)傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)鑒定后，粉蚧種類(lèi)主要有新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種。

1.2 粉蚧DNA提取

采用酚氯仿抽提法提取DNA。將單頭粉蚧標(biāo)本置于含有200 μL提取液(10 mmol/L Tris-HCI，1 mmol/L EDTA，1% SDS，pH 8.0)中，用封口槍頭充分研磨；加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)于研磨后的勻漿液中，混勻后于56℃水浴2 h(每30 min混勻1次)；第一次抽提加1倍體積苯酚/氯仿(1 ∶1)于反應(yīng)混合液中，混勻，離心10 min(4℃，10000 r/min)。吸取上清后用等體積氯仿按上法再抽提一次。吸取上清，用2倍體積100%冰凍乙醇沉淀1 h，離心20 min(4℃，12000 r/min)，棄上清，晾干后用30 μL無(wú)菌水充分溶解DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序

采用核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS18S：(5′-TACACACCGCCCGTCGCTACTA-3)和ITS5.8S：(5′- ATGTGCGTTCRAAATGTCGATGTTCA-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，其中含有2 μL DNA溶液，2.5 μL10×Pfu buffer，0.6 μL Mg2+(100 mmol/L)，0.5 μL 10 mmol/L dNTP混合液，引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μL，北京全式金生物技術(shù)有限公司)0.5 μL，17.3 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94℃變性5 min；95℃ 20 s，53℃ 40 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃保溫8 min。取2.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果并拍照。

《二月》中第一封信和第四封信問(wèn)句較為集中,分別為13句、15句。由二句組合、三句組合、四句組合等。例如:

所得目的片段用PCR產(chǎn)物直接雙向測(cè)序，測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析與新菠蘿灰粉蚧特異性引物設(shè)計(jì)

對(duì)獲得的8種不同粉蚧的序列進(jìn)行比對(duì)分析，針對(duì)新菠蘿灰粉蚧，找到該蟲(chóng)與其它粉蚧的特異區(qū)域，利用Oligo 6.0軟件，在這個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)新菠蘿灰粉蚧的特異性引物D. ne-F：5′-ATTGAACGA CCGCAGTGA-3′和D.ne-R：5′-GTCTGTTTATACTT GGGG-3′(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，擴(kuò)增片段552 bp(GenBank登錄號(hào)為MF 363108)。PCR的反應(yīng)體系為15 μL，其中，10×PCR Buffer 1.5 μL，各2.5 mM的dNTP Mixture 1.2 μL，10 μM D.ne-F/D. ne-R引物各0.2 μL，25 mM Mg2+1.2 μL，BSA 0.3 μL，TaKaRa Taq 0.2 μL，10 ng模板DNA 0.6 μL，ddH2O 9.6 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取2.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果并拍照。

1.5 新菠蘿灰粉蚧引物的種特異性及靈敏性檢驗(yàn)

分別以新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧的DNA為模板，檢驗(yàn)新菠蘿灰粉蚧特異性片段擴(kuò)增引物D.ne-F/D.ne-R的種特異性。與此同時(shí)，提取不同蟲(chóng)態(tài)(1齡若蟲(chóng)、2齡若蟲(chóng)、3齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng))的新菠蘿灰粉蚧的DNA為模板，對(duì)目的片段擴(kuò)增效果進(jìn)行檢驗(yàn)。取單頭成蟲(chóng)原模板DNA溶液(140 ng/μL)稀釋10倍后以2倍進(jìn)行遞減稀釋至437.5 pg/μL，然后以稀釋后的濃度為模板(14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL)進(jìn)行最低檢出閾值的測(cè)定。每一種類(lèi)和不同蟲(chóng)態(tài)的樣本分別檢測(cè)3頭。

2 結(jié)果與分析

2.1 新菠蘿灰粉蚧引物的種特異性檢測(cè)

以所設(shè)計(jì)的D.ne-F/D.ne-R新菠蘿灰粉蚧種特異性引物分別對(duì)新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種粉蚧的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果如下(圖1)：該引物只能針對(duì)新菠蘿灰粉蚧擴(kuò)增出552 bp大小的片段，而對(duì)其它粉蚧不具有擴(kuò)增能力，表明所設(shè)計(jì)的D.ne-F/D.ne-R為新菠蘿灰粉蚧種特異性引物。

圖1 用D.ne-F/D.ne-R特異性引物對(duì)新菠蘿灰粉蚧及近緣種擴(kuò)增的結(jié)果Fig.1 The amplification result of Dysmicoccus neobrevipes and its related species using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子標(biāo)記，1，2，3為新菠蘿灰粉蚧；4，5，6為扶桑綿粉蚧；7，8，9為雙條拂粉蚧；10，11，12為杰克貝爾氏粉蚧；13，14，15為大洋臀紋粉蚧；16，17，18為木槿曼粉蚧；19，20，21為甘蔗粉蚧；22，23，24為木瓜粉蚧。Note: M: DNA Maker, 1, 2, 3: Dysmicoccus neobrevipes; 4, 5, 6: Phenacoccus solenopsis Tinsley; 7, 8, 9: Ferrisia virgata Cockerell; 10, 11, 12: Pseudococcus jackbeardsleyi; 13, 14, 15: Planococcus minor Maskell; 16, 17, 18: Maconellicoccus hirsutus; 19, 20, 21: Saccharicoccus sacchari Cockerell; 22, 23, 24: Paracoccus marginatus.

2.2 新菠蘿灰粉蚧種特異性引物對(duì)不同蟲(chóng)態(tài)和不同稀釋倍數(shù)模板DNA檢測(cè)

以新菠蘿灰粉蚧不同蟲(chóng)態(tài)的DNA為模板，以D.ne-F/D.ne-R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該引物對(duì)不同蟲(chóng)態(tài)的新菠蘿灰粉蚧都能穩(wěn)定的擴(kuò)增出552 bp大小的片段(圖2)；此外，當(dāng)將單頭成蟲(chóng)模板DNA稀釋為14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL等不同濃度時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，當(dāng)稀釋為437.5 pg/μL時(shí)，仍然可以有效、特異性地?cái)U(kuò)增出552 bp大小的片段(圖3)，表明該引物具有較高的靈敏性。

圖2 用D.ne-F/D.ne-R特異性引物對(duì)新菠蘿灰粉蚧不同蟲(chóng)態(tài)擴(kuò)增的結(jié)果Fig.2 The amplification result of different developmental stages of Dysmicoccus neobrevipes using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子標(biāo)記，1，2，3為1齡若蟲(chóng)；4，5，6為2齡若蟲(chóng)；7，8，9為3齡若蟲(chóng)；10，11，12為成蟲(chóng)。Note: M: DNA Maker, 1, 2, 3: 1st instar; 4, 5, 6: 2nd instar; 7, 8, 9: 3rd instar; 10, 11, 12: adult.

圖3 用D.ne-F/D.ne-R特異性引物對(duì)新菠蘿灰粉蚧的最低檢出閾值Fig.3 The minimum threshold for Dysmicoccus neobrevipes using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子標(biāo)記，1-6分別為14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL。Note: M: DNA Maker, 1-6 represent14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL.

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)對(duì)新菠蘿灰粉蚧、扶桑綿粉蚧、雙條拂粉蚧、杰克貝爾氏粉蚧、大洋臀紋粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8種粉蚧的ITS序列進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)序列分析比對(duì)，針對(duì)新菠蘿灰粉蚧設(shè)計(jì)出了一對(duì)種特異性引物，該引物可以特異性的擴(kuò)增出552 bp大小的片段，而對(duì)其它7種粉蚧沒(méi)有擴(kuò)增能力，能有效快速地鑒定出新菠蘿灰粉蚧；該引物不僅對(duì)新菠蘿灰粉蚧的成蟲(chóng)具有良好的擴(kuò)增能力，而且對(duì)單頭1齡若蟲(chóng)、2齡若蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)也都有同樣的擴(kuò)增效果；此外，該引物還可以檢測(cè)出最低濃度為437.5 pg/μL，具有較強(qiáng)的敏感性。然而由于粉蚧種類(lèi)較多，有許多種類(lèi)在本文中未曾涉及，因此，對(duì)所設(shè)計(jì)的新菠蘿灰粉蚧特異性引物尚需要做進(jìn)一步的檢測(cè)。

到目前為止，對(duì)粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)的鑒別主要是依據(jù)其成蟲(chóng)外部形態(tài)特征，但粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)是外部形態(tài)十分相似的一類(lèi)害蟲(chóng)，有些種類(lèi)鮮見(jiàn)雄蟲(chóng)，可供比較的形態(tài)學(xué)特征是有限的，而且有些形態(tài)分類(lèi)特征并不穩(wěn)定，如有些粉蚧的個(gè)體大小、剛毛的長(zhǎng)短和透明孔的有無(wú)都可能受外部環(huán)境的影響，低齡若蟲(chóng)形態(tài)分類(lèi)特征更加不穩(wěn)定(Cox，1983)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，粉蚧類(lèi)昆蟲(chóng)的鑒定取得了重大進(jìn)展。Beuning等(1999)通過(guò)獲得Pseudococcusviburni(Signoret)、P.longispinus(Targiono-Tozzetti)、P.calceolariae(Maskell)和P.similans(Lidgett)的ITS序列，并設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)對(duì)這4種粉蚧進(jìn)行了分子鑒定，而此特異性引物還可用于成蟲(chóng)、卵和若蟲(chóng)等材料的鑒定；徐浪等(2016)利用mtDNA COI基因設(shè)計(jì)了兩組特異性引物和MGB探針，應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)新菠蘿灰粉蚧和菠蘿灰粉蚧進(jìn)行了快速準(zhǔn)確鑒定；徐浪等(2013)測(cè)定了7種粉蚧的COI序列，并與BOLD和Genbank中的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，實(shí)現(xiàn)了相關(guān)蚧蟲(chóng)的快速準(zhǔn)確鑒定。本文所設(shè)計(jì)的新菠蘿灰粉蚧種特異性引物能夠不受其發(fā)育階段和環(huán)境因素制約，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速的鑒定出新菠蘿灰粉蚧，該技術(shù)的建立，將為檢驗(yàn)檢疫部門(mén)提供有效的檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)防治外來(lái)粉蚧也具有重要意義。

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MolecularmarkertechniqueforrapididentificationofDysmicoccusneobrevipes(Beardsley)

MA Guang-Chang, WANG Xiao-Ni, NIU Li-Ming, GONG Zhi, WEN Hai-Bo, JIN Qi-An, PENG Zheng-Qiang*

(Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Haikou 571101, China)

Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley) is an invasive pest, which tremendously harms economic crops includingAgavesisalanaandAnnonasquamosa. It is very hard to rapidly and accurately distinguishing mealybugs because of their small size and similarity in external morphology. In this study, we had developed a method for the rapid differentiation ofD.neobrevipesby molecular marker technique. Sequences ofD.neobrevipes、PhenacoccussolenopsisTinsley、FerrisiavirgataCockerell、Pseudococcusjackbeardsleyi、PlanococcusminorMaskell、Maconellicoccushirsutus、SaccharicoccussacchariCockerell andParacoccusmarginatuswere analysed. A pair of specific primers which is specific toD.neobrevipeswas designed. A single 552 bp (GenBank accession number: MF 363108) fragment was amplified using the specific primers only inD.neobrevipes. No fragments were amplified using the specific primers in other mealybugs. The amplification ability of specific primer was proved to be capable for not only adults but also 1st, 2ndand 3rdinstar ofD.neobrevipes. Moreover, the assays was capable of detecting 437.5 pg/μL. This technique should be useful tool for pest rapid diagnosis, quarantine and monitoring during transportation of seedlings likeA.sisalana.Keywords:Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley); molecular marker; rapid identification; specific amplification

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)“南繁區(qū)生物安全監(jiān)測(cè)預(yù)警及控制關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(201403075)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1201200)

馬光昌，男，1981年生，山西人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槿肭趾οx(chóng)生物防治，E-mail：mgc53@126.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: lypzhq@163.com

Received：2017-06-01; 接受日期Accepted: 2017-06-21

Q963；S412

：A

1674-0858(2017)04-0893-05

馬光昌，王曉妮，牛黎明,等.快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的分子標(biāo)記技術(shù)[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017,39(4):893-897.