煙粉虱及其優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌的種類及系統(tǒng)發(fā)育分析

薛延韜，張毅波，張 焱，張桂芬，劉 懷，萬(wàn)方浩*，葛金燕

(1.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆蟲(chóng)及害蟲(chóng)控制工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

煙粉虱及其優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌的種類及系統(tǒng)發(fā)育分析

薛延韜1,2，張毅波2，張 焱1,2，張桂芬2，劉 懷1，萬(wàn)方浩2*，葛金燕3

(1.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆蟲(chóng)及害蟲(chóng)控制工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

為了研究入侵我國(guó)的2個(gè)主要煙粉虱隱種BemisiatabaciMEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂(淺黃恩蚜小蜂Encarsiasophia、麗蚜小蜂E.formosa、海氏槳角蚜小蜂Eretmocerushayati)體內(nèi)感染內(nèi)共生菌的種類豐度，并進(jìn)一步探討其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本文利用分子生物學(xué)手段對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和分析，并采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)分別構(gòu)建優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，煙粉虱2個(gè)隱種內(nèi)共生菌的種類豐度大于其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂，3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂中麗蚜小蜂內(nèi)共生菌的種類豐度最高；同源性分析發(fā)現(xiàn)煙粉虱和寄生蜂所攜帶的Rickettsia基因同源性達(dá)到99%，屬于Rickettsiabellii種，進(jìn)一步的進(jìn)化樹(shù)分析也發(fā)現(xiàn)所研究物種的Rickettsia和Hamiltonella均可各自聚為同一進(jìn)化分支。煙粉虱及其優(yōu)勢(shì)寄生蜂體內(nèi)含有種類豐富的內(nèi)共生菌，其中優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌Rickettsia和Hamiltonella各自親緣關(guān)系很近，說(shuō)明內(nèi)共生菌在煙粉虱和寄生蜂間可能進(jìn)行水平傳播。

煙粉虱；寄生蜂；內(nèi)共生菌；16S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)屬于半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，是一種典型的高度多食性的刺吸式害蟲(chóng)，同時(shí)也是一種世界性的入侵害蟲(chóng)，其可通過(guò)直接取食植物韌皮部汁液、傳播110多種植物病毒以及分泌蜜露誘發(fā)霉污病等方式為害作物，每年可導(dǎo)致數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失(Brownetal., 1995; Oliveiraetal., 2001; Jonesetal., 2003; Wanetal., 2016)。煙粉虱是一個(gè)獨(dú)特的、復(fù)雜的復(fù)合種，由至少36個(gè)形態(tài)上難以區(qū)分的隱種組成(Boykinetal., 2007; De Barroetal., 2010; Dinsdaleetal., 2010; Liuetal., 2012; Firdausetal., 2013)。其中，“中東-小亞細(xì)亞1”隱種(Middle East-Asia Minor 1，簡(jiǎn)稱MEAM 1，以前稱之為“B型”)和“地中?！彪[種(Mediterranean，簡(jiǎn)稱MED，以前稱之為“Q型”)是世界范圍內(nèi)的2個(gè)主要入侵煙粉虱隱種(Tayetal., 2012)，在過(guò)去的30多年里，在全世界造成了巨大的農(nóng)業(yè)損失(Daltonetal., 2006; Zhangetal., 2015)。

在我國(guó)，煙粉虱MEAM1和MED隱種是分布最廣泛、為害最嚴(yán)重的2個(gè)入侵隱種(Panetal., 2011)。MEAM1隱種于20世紀(jì)90年代中后期傳入，并且很快地取代了本地種，而MED隱種于2003年第一次在我國(guó)云南昆明發(fā)現(xiàn)(Chuetal., 2006)。之后，MED隱種逐漸取代MEAM1隱種成為我國(guó)田間的主要發(fā)生種(Chuetal., 2010; Tengetal., 2010; Panetal., 2011)。MEAM1隱種具有較強(qiáng)的入侵能力和競(jìng)爭(zhēng)力，而MED隱種具有較強(qiáng)的抗藥性(Horowitzetal., 2003; Pascualetal., 2004; Dennehyetal., 2010)。隨著化學(xué)農(nóng)藥的大范圍使用，煙粉虱的抗藥性也逐漸增強(qiáng)。為了避免進(jìn)入農(nóng)藥使用量增加和抗藥性增強(qiáng)的惡性循壞，利用生防作用物開(kāi)展煙粉虱生物防治成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。生防作用物中，寄生性天敵又是最重要的組成部分。煙粉虱的寄生性天敵主要分布于恩蚜小蜂屬Encarsia和槳角蚜小蜂屬Eretmocerus，其中應(yīng)用較為廣泛的優(yōu)勢(shì)寄生蜂有麗蚜小蜂Encarsiaformosa，淺黃恩蚜小蜂Encarsiasophia以及海氏槳角蚜小蜂Eretmocerushayati3種。

煙粉虱體內(nèi)攜帶有種類豐富的內(nèi)共生菌，目前已報(bào)道有8種/屬(Shanetal., 2016)。不同煙粉虱隱種所攜帶的次生內(nèi)共生菌(Secondary endosymbiont)種類不同，包括“CandidatusHamiltonella defense”(Zchori-Feinetal., 2002)，“CandidatusWolbachia sp.”(Nirgianakietal., 2003)，Arsenophonussp.(Zchori-Feinetal., 2002)，“CandidatusFritschea bemisiae” (Everettetal., 2005)，“CandidatusCardinium hertigii”(Weeksetal., 2003)，Rickettsiasp.(Gottliebetal., 2006)和“CandidatusHemipteriphilus asiaticus”(Bingetal., 2013)。但是，它們都攜帶有相同的且能夠?yàn)槠涮峁┚S持生命活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的初生內(nèi)共生菌(Primary endosymbiont)“CandidatusPortiera aleyrodidarum”(Sloanetal., 2012)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，煙粉虱體內(nèi)內(nèi)共生菌在其種群擴(kuò)散和入侵方面發(fā)揮了重要作用。比如，有研究發(fā)現(xiàn)雙重感染Rickettsia-Arsenophonus或Wolbachia-Arsenophonus的煙粉虱MED隱種比只感染Arsenophonus的煙粉虱MED隱種對(duì)啶蟲(chóng)脒、噻蟲(chóng)嗪、吡蟲(chóng)啉和螺甲螨酯的敏感性較高(Ghanimetal., 2009)，表明內(nèi)共生菌可能與煙粉虱的抗藥性相關(guān)。Brumin等(2011)發(fā)現(xiàn)在以色列的煙粉虱MEAM1隱種種群中，熱激情況下分布于類菌體外部的Rickettsia會(huì)降低，而處于類菌體內(nèi)部的Portiera和Hamiltonella幾乎不受影響；而Shan等(2014)發(fā)現(xiàn)在中國(guó)的煙粉虱MEAM1隱種種群中，在高溫處理下處于類菌體內(nèi)部的Portiera和Hamiltonella均降低，而分散的Rickettsia幾乎不受影響，這表明內(nèi)共生菌可能與煙粉虱的耐熱性相關(guān)。因此，以次生內(nèi)共生菌作為對(duì)象來(lái)研究煙粉虱的生物學(xué)特性、入侵能力及對(duì)隱種間取代的影響成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)(Chuetal., 2011; Himleretal., 2011)。

除了煙粉虱外，許多研究也圍繞共生菌在煙粉虱的優(yōu)勢(shì)寄生蜂中的傳播和功能展開(kāi)。Chiel等(2009)研究表明Rickettsia在寄生蜂Eretmocerusemiratus和Eretmoceruseremicus體內(nèi)沒(méi)有進(jìn)入卵母細(xì)胞，僅局部存在于卵泡細(xì)胞，所以Rickettsia無(wú)法在這兩種寄生蜂體內(nèi)進(jìn)行垂直傳播，在寄生蜂Encarsiapergandiella體內(nèi)也只是短暫存在于消化道中，并在化蛹前排出體外；同時(shí)，水平傳播實(shí)驗(yàn)的結(jié)果則表示寄生蜂通過(guò)與感染Rickettsia的煙粉虱接觸后能夠普遍獲菌，但是一旦離開(kāi)含菌粉虱，寄生蜂的感菌率又會(huì)急劇下降(Maetal., 2004)。煙粉虱與寄生性天敵之間大多都是專性寄生，對(duì)于煙粉虱及其寄生蜂共同攜帶的內(nèi)共生菌種類和系統(tǒng)發(fā)育的研究，將有助于更加明確內(nèi)共生菌在煙粉虱和寄生蜂之間的傳播方式，以期為深入研究寄生蜂對(duì)煙粉虱的防控提供理論基礎(chǔ)。

為了明確入侵我國(guó)的2個(gè)主要煙粉虱隱種BemisiatabaciMEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂(淺黃恩蚜小蜂En.Sophia、麗蚜小蜂En.formosa、海氏槳角蚜小蜂Er.hayati)體內(nèi)感染內(nèi)共生菌的種類和豐度，并探討其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本文采用分子生物學(xué)手段，通過(guò)克隆擴(kuò)增出昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌的16S rRNA基因序列，連接轉(zhuǎn)化后，經(jīng)基因測(cè)序明確內(nèi)共生菌的種類和豐度，并利用生物信息學(xué)的相關(guān)方法進(jìn)行基因同源性分析，進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育分析。研究結(jié)果能夠明確煙粉虱和寄生蜂體內(nèi)感染內(nèi)共生菌的種類和豐度，以及內(nèi)共生菌在“煙粉虱-寄生蜂”種群間可能的傳播途徑，為今后煙粉虱及其優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌的深入研究提供參考，也有助于研究人員進(jìn)一步理解內(nèi)共生菌在“粉虱-寄生性天敵”互作中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試?yán)ハx(chóng)

煙粉虱MEAM1和MED隱種種群采自河北省廊坊市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊中試基地，不同隱種通過(guò)線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ基因(mtDNA-COⅠ)進(jìn)行檢測(cè)鑒定后，分別用籠罩單獨(dú)飼養(yǎng)，并定期通過(guò)RAPD-PCR進(jìn)行檢測(cè)；3種寄生蜂分別為海氏槳角蚜小蜂、淺黃恩蚜小蜂和麗蚜小蜂，其中海氏槳角蚜小蜂和淺黃恩蚜小蜂種群于2008年從美國(guó)德克薩斯農(nóng)工大學(xué)引入，麗蚜小蜂種群采集地與煙粉虱相同，三者均以煙粉虱為寄主用籠罩單獨(dú)飼養(yǎng)。上述種群自采集或引入后，長(zhǎng)期飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物入侵研究室的溫室中，氣候條件為溫度26℃-28℃、相對(duì)濕度65%±5%、光周期14 L ∶10 D。

1.1.2供試植物

煙粉虱使用棉花Gossypium進(jìn)行飼養(yǎng)，品種為“中棉6號(hào)”，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊農(nóng)藥廠提供。棉花種子種植于含營(yíng)養(yǎng)土(組成：草木灰/蛭石為1 ∶1)的塑料花盆(規(guī)格：上口徑10 cm×10 cm，高約9 cm)中，每盆2-3粒種子，放置在120目紗網(wǎng)的大型養(yǎng)蟲(chóng)籠(規(guī)格：60 cm×40 cm×60 cm)于溫室中，待株高大于20 cm且至少有2片真葉時(shí)即可使用。培養(yǎng)條件與供試?yán)ハx(chóng)相同，供試植物不接觸任何農(nóng)藥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1煙粉虱DNA的提取

用組織基因組DNA提取試劑盒提取煙粉虱的DNA。所用試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)由天根生化有限公司生產(chǎn)。取20頭煙粉虱于滅菌的1.5 mL離心管中，放入-20℃冰箱冷凍5-8 min，加液氮研磨后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最后將得到的煙粉虱DNA提取液置于1.5 mL離心管中，短暫低速離心，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2寄生蜂DNA的提取

用裂解液法提取3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂的DNA。研磨方法與煙粉虱DNA提取相同，之后加入50 μL的裂解液(10 mM Tris-HCL，pH 8.4；50 mM KCl；0.45% Tween 20；0.45% NP40；0.2% Gelatin；60 μg/mL Proteinase K)；將帶有勻漿液的離心管置于65℃金屬浴30 min、96℃金屬浴10 min；短暫低速離心，即得到寄生蜂DNA提取液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)菌16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增

分別以所獲得的煙粉虱和寄生蜂的總DNA為模板，利用細(xì)菌16s rRNA基因通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)(Weisburgetal., 1991)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)包括：總DNA模板2.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 2.5 μL、雙向引物各1.0 μL、Taq聚合酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7 min，4℃保存。對(duì)于每種DNA樣品，均設(shè)置3個(gè)重復(fù)的PCR反應(yīng)；對(duì)于每次PCR反應(yīng)，均設(shè)置含目的片段的煙粉虱或寄生蜂DNA和ddH2O分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI-9700 PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增完成后將3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物合并一起，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，以GelDoc Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，擴(kuò)增片段大小約為1500 bp。

1.2.4PCR產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序

使用DNA凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物。所用試劑盒(AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒)由康寧生命科學(xué)有限公司提供。所有操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。純化所得PCR產(chǎn)物連接到PEASY-T3載體中，將其轉(zhuǎn)入Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞；每個(gè)物種選取40個(gè)有效菌落進(jìn)行驗(yàn)證，將其中正確的轉(zhuǎn)化子送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1內(nèi)共生菌的種類分析

利用Bioedit 7.2.6軟件(Hall, 1999)對(duì)測(cè)序所得的16S rRNA基因序列進(jìn)行拼接并輔以人工矯正等處理后，在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，以同源性在99%-100%為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)內(nèi)共生菌的種類進(jìn)行鑒定，并分別對(duì)各內(nèi)共生菌的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)記錄比對(duì)時(shí)各序列同源性最高的序列信息；在Ribosomal Database Project(RDP)上對(duì)共生菌16S rRNA基因序列進(jìn)行Classifier歸類(Wangetal., 2007)。

1.3.2系統(tǒng)發(fā)育分析

基于1.3.1的分析結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂感染的優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以Bioedit 7.2.6軟件讀取序列，對(duì)每條序列進(jìn)行人工堿基讀取和反復(fù)校對(duì)；采用DAMBE 6.4.79軟件(Xia, 2017)對(duì)核苷酸替代飽和性進(jìn)行分析；選取NCBI中已報(bào)道的不同宿主攜帶的上述優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌及隸屬于同屬不同群組的多條16S rRNA基因序列作為參考序列，并選取外群(Outgroup)，結(jié)合本研究測(cè)序獲得的5個(gè)物種攜帶的優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列，利用Clustal W程序?qū)π蛄羞M(jìn)行多重序列比對(duì)，并輔以人工校對(duì)；應(yīng)用Mega 7.0.26(Kumaretal., 2016)軟件以雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter, K2-P)，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)，重復(fù)檢測(cè)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱MEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌的種類豐度分析

對(duì)測(cè)序所得的煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列的同源性比對(duì)表明，這5個(gè)物種感染內(nèi)共生菌的種類豐度有明顯的差異(表1)。煙粉虱2個(gè)隱種均攜帶Portiera、Hamiltonella和Rickettsia，其內(nèi)共生菌的種類豐度要大于3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂；3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂中以麗蚜小蜂內(nèi)共生菌的種類豐度最高，其攜帶有Rickettsia、Hamiltonella和Wolbachia，另外2種寄生蜂則只含有Rickettsia；5個(gè)不同物種均攜帶Rickettsia，海氏槳角蚜小蜂Rickettsia的種類豐度顯著高于其他物種。

內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列同源性比對(duì)中相似度最高的序列信息及Classifier歸類結(jié)果見(jiàn)表2。煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂體感染有Portiera、Hamiltonella、Rickettsia和Wolbachia4種內(nèi)共生菌，均隸屬于變形菌門Proteobacteria，其中Rickettsia屬于α-變形細(xì)菌綱(α-Proteobacteria)，Portiera、Hamiltonella和Wolbachia則屬于γ-變形細(xì)菌綱(γ-Proteobacteria)，每一條序列與NCBI基因庫(kù)中比對(duì)到的序列的相似度均達(dá)到99%。

2.2 煙粉虱MEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂的優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

由2.1結(jié)果可知，煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂共同感染的內(nèi)共生菌有Rickettsia和Hamiltonella2種，為其優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌。煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂均攜帶有Rickettsia，攜帶Hamiltonella的有煙粉虱MEAM1和MED隱種及3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂中的麗蚜小蜂。下面分別對(duì)2種優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌的種類豐度

注：1.Others為比對(duì)結(jié)果不屬于已報(bào)道的8種/屬內(nèi)共生菌；2.“-”表示不含有某種菌。Note: 1. The BLAST results not belonging to the eight species of endosymbiosis that have been reported count in the others; 2. The sign “-” indicates free for one bacterium.

表2 煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列比對(duì)信息及分類地位

2.2.1優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌Rickettsia系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取Rickettsia屬的28個(gè)16S rRNA同源基因序列作為參考序列，以纖毛蟲(chóng)Diophrysappendiculata的Rickettisa16S rRNA基因作為外群，結(jié)合本研究測(cè)序獲得的煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂的Rickettisa16S rRNA基因序列，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果分別如圖1和圖2所示。

采用NJ法對(duì)Rickettsia構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)中，本研究中的煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂的Rickettsia與數(shù)據(jù)庫(kù)中以色列的煙粉虱MEAM1隱種和日本的煙粉虱MED隱種的Rickettsia首先聚為一支，然后再與豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、葉蟬Empoascapapayae、葉螨Tetranychusurticae、盲蝽象Macrolophuspygmaeus、煙盲蝽Nesidiocoristenuis及寄生蜂Pnigaliosoemius的Rickettsia和Rickettsiabellii聚為一大支，而與纖毛蟲(chóng)D.appendiculata的Rickettisa親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。采用ML法對(duì)Rickettsia構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)表現(xiàn)出與NJ法類似的結(jié)果。

圖1 鄰接法構(gòu)建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂Rickettsia的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(包含參考序列和外群)Fig.1 Neighbor-Joining tree based on the analysis of Rickettsia from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

圖2 最大似然法構(gòu)建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂Rickettsia的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(包含參考序列和外群)Fig.2 Maximum Likehood based on the analysis of Rickettsia from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

2.2.2優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生菌Hamiltonella系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取Hamiltonella屬的20個(gè)16S rRNA同源基因序列作為參考序列，以水生拉恩氏菌Rahnellaaquatilis和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Yersiniaenterocolitica的16S rRNA基因作為外群，結(jié)合本研究測(cè)序獲得的煙粉虱MEAM1和MED隱種及麗蚜小蜂En.formosa的Hamiltonella16S rRNA基因序列，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likehood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果分別如圖3和圖4所示。

圖3 鄰接法構(gòu)建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂Hamiltonella的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(包含參考序列和外群)Fig.3 Neighbor-Joining tree based on the analysis of Hamiltonella from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

圖4 最大似然法構(gòu)建的煙粉虱MEAM1和MED及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂Hamiltonella的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(包含參考序列和外群)Fig.4 Maximum Likehood based on the analysis of Hamiltonella from B. tabaci MEAM1, MED and its three dominant parasitoids (including the reference sequences and outgroup)

采用NJ法對(duì)Hamiltonella構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)中，本研究中的煙粉虱MEAM1和MED隱種及麗蚜小蜂En.formosa的Hamiltonella與數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)的煙粉虱MEAM1和MED隱種及以色列的煙粉虱MEAM1隱種的Hamiltonella聚為一小支，然后與美國(guó)的煙粉虱MEAM1隱種的Hamiltonella聚為一大支；而與其余物種的Hamiltonella均未在同一分支；與水生拉恩氏菌R.aquatilis和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Y.enterocolitica親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。采用ML法對(duì)Hamiltonella構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)表現(xiàn)出與NJ法類似的結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，煙粉虱MEAM1和MED隱種感染的Hamiltonella含量均最高，這與以前的報(bào)道相一致。目前，Hamiltonella和Rickettsia已成為煙粉虱的優(yōu)勢(shì)次生內(nèi)共生菌。但是，Chu等(2011)研究表明，除了Hamiltonella和Rickettsia外，這兩種煙粉虱隱種還會(huì)感染有Wolbachia、Arsenophonus和Cardinium。由于內(nèi)共生菌在煙粉虱體內(nèi)是不固定的，因此，生物和非生物環(huán)境等因素都會(huì)對(duì)內(nèi)共生菌產(chǎn)生影響，它們可以直接作用于內(nèi)共生菌，或者間接影響宿主，從而導(dǎo)致昆蟲(chóng)胞內(nèi)共生菌與宿主之間關(guān)系的不穩(wěn)定性(Cassetal., 2015)。例如，共生菌Wolbachia在澳大利亞黑腹果蠅Drosophilamelanogaster種群中的感染率比較穩(wěn)定(Hoffmannetal., 1994; Hoffmannetal., 1998)；共生菌Serratia可保護(hù)蚜蟲(chóng)抵抗熱激(Russelletal., 2006)，并與蚜蟲(chóng)分布在干旱地區(qū)有關(guān)(Henryetal., 2013)；共生菌Cardinium在庫(kù)蠓Culicoidesis中的感染率與地中海地區(qū)地面的溫度有關(guān)(Moragetal., 2012)；在日本，感染共生菌Regiella能夠影響豌豆蚜A.pisum宿主的?；?Tsuchidaetal., 2004)；在美國(guó)，Rickettsia的感染頻率在不同地區(qū)之間存在差異：在西南部的棉花種植區(qū)感染頻率特別高，而在圣華金河谷和德克薩斯州的東南以及南部的部分地區(qū)處于中間感染水平(Cassetal., 2015)；同樣，Shan等(2014)對(duì)我國(guó)田間采集到的煙粉虱MEAM1和MED隱種檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MEAM1隱種攜帶有初生內(nèi)共生菌Portiera及2種次生內(nèi)共生菌Hamiltonella和Rickettsia，而MED隱種則攜帶Portiera和Hamiltonella。這些結(jié)果都表明，昆蟲(chóng)體內(nèi)內(nèi)共生菌的存在與變化受多種因素的影響。

準(zhǔn)確鑒定煙粉虱及其寄生蜂攜帶的內(nèi)共生菌種類并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)于研究?jī)?nèi)共生菌與宿主間的互作關(guān)系意義重大。本研究中，通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)和Classifier歸類，得到了內(nèi)共生菌鑒定和分類相同的結(jié)果；在以Rickettsia或Hamiltonella的16S rRNA基因序列為靶標(biāo)對(duì)兩者進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，無(wú)論是鄰接法還是最大似然法，煙粉虱MEAM1和MED隱種及其3種優(yōu)勢(shì)寄生蜂的Rickettsia或Hamiltonella均聚為一支，且就煙粉虱及其寄生蜂而言可形成獨(dú)立的進(jìn)化支，其聚類結(jié)果也符合BLAST同源性比對(duì)和Classifier歸類結(jié)果。這說(shuō)明內(nèi)共生菌的16S rRNA基因可用于對(duì)其進(jìn)行鑒定和分類分析。

無(wú)論是煙粉虱還是寄生蜂的內(nèi)共生菌均屬于變形菌門的α-變形細(xì)菌綱或γ-變形細(xì)菌綱。已有研究表明，Rickettsia可分為4個(gè)分支，即bellii group、transitional group、spotted fever group和typhus group，而本研究中煙粉虱和寄生蜂攜帶的Rickettsia16s rRNA基因序列均聚為一支，屬于Rickettsiabellii group，與其他取食植物韌皮部汁液類的刺吸式昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)和葉蟬的Rickettsia也有較近的親緣關(guān)系(Bruminetal., 2012)。此外，除了MEAM1和MED隱種外，Rickettsia在煙粉虱Asia II 3(即“ZHJ1型”)、Asia II 7(即“Cv型”)、Indian Ocean(即“MS型”)和China 1(即“ZHJ3型”)等隱種上均有報(bào)道(Bingetal., 2013)。對(duì)于Hamiltonella而言，本研究中煙粉虱和寄生蜂的Hamiltonella16s rRNA基因序列同其他4個(gè)煙粉虱種群均聚為一支，說(shuō)明煙粉虱感染的Hamiltonella具有較近的親緣關(guān)系。這說(shuō)明，刺吸式昆蟲(chóng)煙粉虱及其優(yōu)勢(shì)寄生蜂所攜帶的Rickettsia和Hamiltonella在“煙粉虱-寄生蜂”間可能存在水平傳播，同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明，內(nèi)共生菌在不同宿主昆蟲(chóng)之間進(jìn)行相互感染和傳播的可能性很大。

在煙粉虱中，Rickettsia的分布呈現(xiàn)多樣性(Gottliebetal., 2006)，而其他內(nèi)共生菌都存在于宿主的菌胞中。有研究表明，Rickettsia一般隨卵母細(xì)胞進(jìn)行垂直傳播，而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在煙粉虱成蟲(chóng)的中腸中聚集有大量的Rickettsia，其可能是在卵母細(xì)胞和卵細(xì)胞發(fā)育后期進(jìn)入腸組織(Bruminetal., 2012)。對(duì)于內(nèi)共生菌在宿主體內(nèi)的分布和傳播，還有待進(jìn)一步研究。

本研究中所用的煙粉虱種群都攜帶有Portiera、Hamiltonella和Rickettsia，其寄生蜂都攜帶有Rickettsia，部分?jǐn)y帶有Hamiltonella或Wolbachia，而宿主體內(nèi)內(nèi)共生菌的存在受多種因素的影響，不同種群攜帶的內(nèi)共生菌種類豐度存在一定差異，對(duì)于本研究討論的Rickettsia和Hamiltonella以外的其他內(nèi)共生菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育情況，還有待于進(jìn)一步對(duì)其他種群進(jìn)行研究。此外，本研究選取細(xì)菌16s rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，其存在于所有細(xì)菌的基因組中，具有高度的保守性，但是相對(duì)于其他技術(shù)方法，如宏基因組測(cè)序而言，仍存在一定的局限性。例如，16s rRNA基因測(cè)序得到的序列很多鑒定不到種水平，而宏基因組測(cè)序能鑒定微生物到種水平甚至菌株水平。

寄生蜂對(duì)于煙粉虱具有較大的控害效果和防治潛力，對(duì)寄生蜂和煙粉虱共同感染的內(nèi)共生菌的種類及系統(tǒng)發(fā)育研究，不僅有助于進(jìn)一步明確內(nèi)共生菌對(duì)于宿主的重要作用及其在“煙粉虱-寄生蜂”間可能存在水平傳播途徑，還可為深入研究?jī)?nèi)共生菌在“煙粉虱-寄生蜂”間的互作關(guān)系提供一定參考。

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DiversityandphylogeneticaffiliationofendosymbiontsfromBemisiatabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)anditsdominantparasitoids

XUE Yan-Tao1,2, ZHANG YI-Bo2, ZHANG Yan1,2, ZHANG Gui-Fen2, LIU Huai1, WAN Fang-Hao2*, GE Jin-Yan3

(1. Chongqing Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. State Key Laboratory for the Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Plant Protection Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 3. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To determine the diversity and phylogenetic affiliation of endosymbionts harboured by two mainly invasive cryptic speciesBemisiatabaciMEAM1 and MED and its three dominant parasitoids (Encarsiasophia,En.formosa,Eretmocerushayati), the 16S rRNA gene sequences of the endosymbionts was cloned, sequenced and analyzed using molecular biology methods. Phylogenetic trees based on the sequences of the dominant endosymbionts were constructed with Neighbor-Joining (NJ) and Maximum Likehood (ML). The results showed that the symbiotic diversity ofB.tabaciMEAM1 and MED was greater than those of the three dominant parasitoids. Among three dominant parasitoids, the diversity of endosymbionts inEn.formosawas the highest. In the homology analysis, theRickettsiain the five insect species had 99% similarity, and all belonged toRickettsiabelliigroup. The phylogenetic trees showed that theRickettsiain the five insect species were clustered together, and theHamiltonellashowed similar results. It suggested thatB.tabaciand its three dominant parasitoids contained a variety of endosymbionts, and the dominant endosymbiontsRickettsiain the five insect species have a close genetic relationship, which is conformed to theHamiltonella, indicating that the endosymbionts could occur horizontal transmission betweenB.tabaciand parasitoids.

Bemisiatabaci; parasitoids; endosymbionts; 16S rRNA; phylogenetic

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)(2016YFC1202100)；中國(guó)博士后基金面上基金(2015M570183)；泰山學(xué)者項(xiàng)目；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)資助(2015DFG32300)

薛延韜，男，1992年生，碩士研究生，研究方向?yàn)槿肭稚飳W(xué)，E-mail：yantao_xue@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: wanfanghao@caas.cn

Received: 2017-07-17; 接受日期Accepted: 2017-07-31

Q968;S476+.3

：A

1674-0858(2017)04-0741-11

薛延韜，張毅波，張焱,等.煙粉虱及其優(yōu)勢(shì)寄生蜂內(nèi)共生菌的種類及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017,39(4):741-751.