不同溶藻菌對小球藻破碎及油脂提取效果的影響

鄧春芳，崔 巖，章瑩穎，成家楊

(北京大學深圳研究生院環(huán)境與能源學院，廣東 深圳 518055)

生物工程

不同溶藻菌對小球藻破碎及油脂提取效果的影響

鄧春芳，崔 巖，章瑩穎，成家楊

(北京大學深圳研究生院環(huán)境與能源學院，廣東 深圳 518055)

為探究溶藻菌對微藻細胞破碎及油脂提取效果的影響，以小球藻為研究對象，選取5株溶藻菌進行混合培養(yǎng)。結(jié)果表明：不同溶藻菌對小球藻細胞破碎及油脂提取效果各不相同。不同溶藻菌的溶藻率依次為：Aeromonahydrophila(73%)>Pseudomonasflurescens(65%)>Bowmanelladenitrificans(56%)、Bacilluscirulans(56%)>Kordiasp. (43%)。利用正己烷對小球藻油脂進行提取，提油率依次為：Bowmanelladenitrificans(58.4%)>Kordiasp.(52.7%)>Pseudomonasflurescens(24.1%)>Bacilluscirulans(22.5%)>Aeromonahydrophila(21.1%)>對照組(10.4%)。其中Bowmanelladenitrificans菌株在24 h內(nèi)就能達到高溶藻率，且提油率相比對照組提高4.6倍。

溶藻菌；小球藻；細胞破碎；油脂提取

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，能源的需求不斷增加，能源短缺已經(jīng)成為制約全球經(jīng)濟發(fā)展的一個重要因素。生物柴油作為主要的生物能源之一，是一種可生物降解、無毒的可再生能源，具有環(huán)境友好、原料可再生的等優(yōu)點，是當前可持續(xù)發(fā)展再生能源的研究熱點。目前生物柴油在世界各國得到了大力推進，已成為發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的環(huán)保型可再生能源。微藻是最有發(fā)展?jié)摿Φ纳锊裼偷脑现唬哂猩L繁殖快、生長周期短、油脂含量高并且不受氣候與季節(jié)限制的特點[1-3]。

小球藻是一種單細胞真核微藻，在自然界中分布范圍廣，對生長條件要求低，環(huán)境耐受性好，繁殖速度快，人工培養(yǎng)較容易，以淡水環(huán)境居多，是可進行大規(guī)模戶外培養(yǎng)的微藻品種之一。同時，小球藻細胞內(nèi)油脂累積可高達干重的55%，主要油脂成分以C16和C18的脂肪酸甘油酯為主，與大豆等植物中提取的油脂成分相似，酯交換后得到的脂肪酸甲酯其燃燒性能與石化柴油極其相似。但其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用還需要解決不同環(huán)節(jié)存在的技術(shù)和經(jīng)濟問題，其中，研發(fā)具有高效節(jié)能的油脂提取技術(shù)是降低成本的有效途徑之一[4-6]。

溶藻菌是指能夠抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統(tǒng)稱[7]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，溶藻菌作為生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，對維持微藻的生物平衡具有十分重要的作用。在1942年，Geitler報道了一種能夠使剛毛藻死亡的粘細菌，之后有其他學者陸續(xù)從海洋和淡水系統(tǒng)中分離出多株溶藻菌[8]。主要有：粘細菌(Myxobacter)[9]，交替單胞菌(Alteromonas)[10]，桿菌(Bacillus)[11]，假單胞菌(Pseudomonas)[12]，交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)[13]，葡萄球菌屬(Staphylococcus)[14]，噬胞菌屬(Cytophaga)[15]，纖維弧菌屬(Cellvibrio)節(jié)桿菌(Arthrobacter)[16]，黃桿菌屬(Flavobacterium)弧菌(Vibrio)[17]等。這些溶藻菌大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，溶藻目標廣泛，如藍藻、硅藻、甲藻及綠藻等。而有些則具有一定的特異性，只能對某些單一種屬的微藻產(chǎn)生溶藻作用。因此，不同種類的溶藻菌在目標藻種及溶藻效果方面都存在一定差異。

目前國內(nèi)對于溶藻菌研究主要集中在生物防治有害藻華，包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻方式的探討以及溶藻活性物質(zhì)的分離純化，而利用溶藻菌對微藻進行預(yù)處理以提高油脂提取率的研究較少。2013年Chen等[18]報道利用溶藻菌Flammeovirgayaeyamensis對小球藻進行細胞破壁預(yù)處理，小球藻油脂提取率可以達到100%。2014年Wang等[19]將溶藻菌Sagittulastellata和兩種微藻(Nannochloropsisoculata、Dunaliellasalina)分別進行混合共培養(yǎng)，得到油脂提取率相比對照分別提高1.39倍和1.85倍。章瑩穎等[20]通過比較不同破碎方法對微藻細胞破碎和油脂提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)溶藻菌不僅具有較好的細胞破碎效果，且能提高油脂提取率。因此，本研究以小球藻為研究對象，選取5株已報道過具有較強溶藻效果的細菌與小球藻進行混合培養(yǎng)，探究溶藻菌對微藻細胞破碎及油脂提取效果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藻種

小球藻由實驗室自主采集及分離，采用BG-11培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，其配方為：在1 L水中加入Na2EDTA 0.001 g，檸檬酸鐵銨0.006 g，檸檬酸0.006 g，CaCl2·2H2O 0.036 g， MgSO4·7H2O0.075 g，K2HPO4·3H2O 0.04 g，H3BO30.002 86 g，MnCl2·4H2O 0.001 86 g，ZnSO4·7H2O 0.000 222 g，CuSO4·5H2O 0.000 079 g，Co(NO3)2·6H2O 0.000 05 g，Na2MoO4·2H2O 0.000 391 g，Na2CO30.02 g，NaNO31.5 g。

1.1.2 溶藻菌

試驗中的5株溶藻菌從國內(nèi)具有資質(zhì)認證的微生物菌種保藏管理中心獲得，如表1所示。表1中菌株在文中依次簡稱為Kordia、Bowmanella、Aeromona、Pseudomonas、Bacillus，相應(yīng)圖表中分別用Kor、Bow、Aer、Pse、Bac表示。

表1 試驗菌種來源

其中溶藻菌Kordia、Bowmanella、Aeromona均采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其配方為：1 L水中加入胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g。Pseudomonas培養(yǎng)基采用菌種庫提供配方：在1 L水中加入蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，氯化鈉5.0 g。Bacillus培養(yǎng)基采用菌種庫提供配方：在1 L水中加入蛋白胨5.0 g,牛肉浸取物3.0 g,氯化鈉5.0 g,MnSO4·H2O 5.0 mg。

1.1.3 儀器與試劑

TS-2102GZ 光照搖床，RF5301立式壓力蒸汽滅菌器，RF5301熒光光度計，AL104電子天平，BX-53熒光顯微鏡，pH計，DHG-9053A烘箱，水浴鍋，RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，UV-1800可見分光光度計，離心機，血球計數(shù)板(16格×25格)，S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡。

正己烷(色譜純)，丙酮(色譜純)，尼羅紅，戊二醛(分析純)。

1.2 試驗方法

小球藻在溫度26℃、轉(zhuǎn)速120 r/min，光暗比12 h∶12 h的搖床里進行培養(yǎng)，每間隔24 h測定藻細胞濃度、光密度(OD值)和相對熒光強度。將培養(yǎng)至對數(shù)期的溶藻菌與小球藻按體積比1∶1進行混合，置于避光搖床(30℃、120 r/min)中，通過定期觀察微藻細胞的破碎情況，測定最終提油率，探究5株溶藻菌對小球藻破碎及油脂提取效果的影響。

1.2.1OD值和相對熒光強度的測定

OD值：利用可見分光光度計測定藻活體細胞在最大吸收波長680 nm處的吸光值和5株溶藻菌在最大吸收波長600 nm處的吸光值。

藻細胞相對熒光強度測定：取4 mL藻液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS緩沖液重懸，加入12 μL尼羅紅丙酮溶液進行染色，利用熒光光度計在激發(fā)波長480 nm、400～700 nm內(nèi)掃描，峰值為吸收強度[21]。

1.2.2 藻細胞濃度的測定及溶藻率計算

藻細胞濃度：利用血球板計數(shù)法在顯微鏡下對完整微藻細胞進行計數(shù)。

為直觀反映溶藻菌的溶藻效果，引用溶藻率作為評價指標，其計算公式如下：

(1)

式中：Ni為藻細胞原始個數(shù)，Nf為經(jīng)過破碎后完整藻細胞個數(shù)。

1.2.3 提油率計算

小球藻油脂提取采用有機溶劑(正己烷)浸提法：取藻菌混合液120 mL(菌藻各60 mL)分裝于6個50 mL的離心管，按1∶1的比例加入正己烷，在150 r/min搖床過夜，12 h后，進行離心(4 000 r/min，15 min)，收集上清液。將收集的上清液進行蒸餾分離(蒸餾瓶100 mL，溫度45℃，轉(zhuǎn)速110 r/min)，在65℃烘箱中干燥1.5 h后稱重(烘箱提前預(yù)熱)。

提油率計算公式如下：

(2)

式中：W2為提取油質(zhì)量；WD為細胞干重，其測定方法為取60 mL藻液于已稱重離心管(W0)中，在4 000 r/min條件下離心10 min，去上清液，在真空冷凍干燥機干燥12 h后稱重(W1)，WD=W1-W0。

1.2.4 掃描電鏡分析

取15 mL樣品，在離心機中離心10 min(2 800 r/min)，棄去上清液，留下絮狀物，即刻在離心管中加入2.5%戊二醛固定液進行固定，12 h后用微孔濾膜截留樣品，再用pH 7.0的磷酸緩沖溶液清洗2 h。然后經(jīng)乙醇上升梯度脫水，其順序為30%、50%、70%、80%和90%，每梯度各1次，每次15 min，100%乙醇脫水3次，每次15 min，放入-20℃冰箱12 h，再放入-80℃冰箱4 h，之后在冷凍干燥機中干燥24 h。將預(yù)處理完的樣品在場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行觀察拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻生長情況

為選取最優(yōu)時間點進行小球藻收獲，本試驗通過可見分光光度計和熒光光度計分別測定OD680和相對熒光強度來表征小球藻生長和油脂積累情況，結(jié)果見圖1。

圖1小球藻OD680與相對熒光強度隨時間變化規(guī)律

由圖1可知，在培養(yǎng)時間1～15 d內(nèi)，小球藻的OD680和相對熒光強度隨時間的延長而逐漸增大，在15 d時，OD680為1.216，相對熒光強度達到最大值56.868。此后OD680仍逐漸增大，相對熒光強度緩慢減小。由此可知，微藻細胞內(nèi)油脂含量會隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸積累，到一定階段油脂總量達到穩(wěn)定值。因而本試驗選取培養(yǎng)至15 d的小球藻進行試驗研究。

2.2 溶藻菌的生長情況

溶藻菌的生長曲線如圖2所示。

圖2 5株溶藻菌的生長曲線

由圖2可知，5株溶藻菌在接種后的0～4 h處于延滯期，4～24 h處于對數(shù)生長期，24 h后進入穩(wěn)定期。為使溶藻菌的溶藻效果達到最優(yōu)，本試驗選取了培養(yǎng)至24 h的溶藻菌進行混合培養(yǎng)試驗。

2.3 不同溶藻菌的溶藻效果研究

將溶藻菌和小球藻進行混合培養(yǎng)，每隔24 h取樣計數(shù)完整藻細胞，溶藻率計算結(jié)果如圖3所示。

圖3 5株溶藻菌對小球藻溶藻率的影響

由圖3可知，5株溶藻菌對小球藻均具有良好的溶藻效果，且溶藻率隨著時間的延長而逐漸增大。在本試驗中藻菌混合培養(yǎng)至96 h時，5株溶藻菌的溶藻率均達到最高，依次為Aeromona(73%)>Pseudomonas(65%)>Bowmanella(56%)、Bacillus(56%)>Kordia(43%)。在混合24 h時，Bowmanella溶藻率迅速升高，較于其他4個菌種最高(47%)，說明該菌種對小球藻具有較強攻擊性，能達到迅速溶藻效果。Aeromona在混合24 h時溶藻率最低，但在72 h內(nèi)溶藻率呈現(xiàn)線性增長趨勢，從14%增長到65%，說明該菌株需要對環(huán)境的適應(yīng)，一旦適應(yīng)環(huán)境后可迅速達到較好的溶藻效果。Bacillus，Kordia和Pseudomonas在藻菌混合后溶藻率變化趨勢相似，即溶藻率在48 h內(nèi)迅速增長，之后呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢。

溶藻率試驗結(jié)果表明：不同溶藻菌對小球藻的適應(yīng)能力和攻擊能力呈現(xiàn)差異性。結(jié)合5菌株的生物安全性，以及時間和管理成本，能在短時間內(nèi)達到較好溶藻效果的Bowmanella菌株將更具有實際應(yīng)用潛力。

2.4 掃描電鏡分析

為進一步分析小球藻和溶藻菌細胞結(jié)構(gòu)所發(fā)生的變化，采用掃描電鏡對共培養(yǎng)4 d后的藻菌混合液進行觀察，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，未經(jīng)處理的小球藻形態(tài)完好，表面光滑，細胞結(jié)構(gòu)完整，呈橢圓形。而經(jīng)不同溶藻菌處理后的小球藻在視野范圍內(nèi)觀察不到完整的藻細胞，細胞壁破碎，體積變小，發(fā)生了不同程度的變形和破壞。直觀判斷加入Aeromona和Pseudomonas溶藻菌后的小球藻的藻細胞結(jié)構(gòu)破壞最嚴重，藻細胞整體變小，細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生重度變形，有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和孔隙。掃描電鏡圖進一步說明了溶藻菌的破碎作用，至于溶藻菌對藻細胞表面結(jié)構(gòu)的破壞性不同可能與它們分泌的溶藻物質(zhì)不同有關(guān)，具體的溶藻機理有待于進一步深入研究。

注：(a)小球藻；(b)Bow和小球藻；(c)Kor和小球藻；(d)Aer和小球藻；(e)Pse和小球藻；(f)Bac和小球藻。

圖4小球藻溶藻前后掃描電鏡圖

2.5 不同溶藻菌的油脂提取效果研究

試驗采用有機溶劑浸提法對溶藻菌處理之后的微藻細胞進行油脂提取。為了排除溶藻菌對最后提油效果的影響，采用正己烷浸提法對5株溶藻菌分別進行油脂提取的預(yù)試驗。結(jié)果表明，5株溶藻菌均無油脂提取出來。說明采用此方法提取的藻菌混合液中的油脂均來源于小球藻。

對5株溶藻菌處理前后的小球藻進行油脂提取，所得結(jié)果如圖5所示。

圖5 5株溶藻菌對小球藻提油率的影響

由圖5可知，小球藻的提油率依次為：Bowmanella(58.4%)>Kordia(52.7%)>Pseudomonas(24.1%)>Bacillus(22.5%)>Aeromona(21.1%)>對照組(10.4%，對照組為未經(jīng)溶藻菌處理的小球藻)。由此可知，采用溶藻菌進行預(yù)處理對小球藻油脂提取有明顯的促進作用。其中Bowmanella和Kordia對小球藻的提油率相對于對照組分別提高了4.6倍和4.1倍，另外3株菌Aeromona、Pseudomonas、Bacillus對小球藻的提油率較對照組均提高1倍以上。

Lenneman等[22]將自主分離的溶藻菌(AeromonashydrophilaAD9)與兩種微藻(Dunaliellatertiolecta,Neochlorisoleoabundans)分別進行混合培養(yǎng)，利用正己烷進行油脂提取，其提油率相比未經(jīng)溶藻菌處理的對照組分別提高12倍和6倍。試驗結(jié)果表明，溶藻菌對微藻細胞的油脂提取有促進作用，但提油率的高低與微藻細胞以及菌種的選擇有直接關(guān)系。雖然利用溶藻菌降解藻細胞相對于傳統(tǒng)的機械和化學方法具有較好的經(jīng)濟效益，但溶藻菌對微藻細胞具有選擇特異性，菌的接種量需要嚴格控制，否則很難達到預(yù)期效果[23]。

3 結(jié) 論

綜合溶藻率和提油率可知，Bowmanelladenitrificans是5株溶藻菌中最具應(yīng)用潛力的菌株。因其不僅可在短時間內(nèi)達到高溶藻率，且油脂提取率最高，可以同時滿足對時間成本和技術(shù)成本的要求。5株溶藻菌對小球藻油脂的提取均有明顯的促進作用，為開發(fā)高效、低能耗的生物油脂生產(chǎn)工藝提供了部分理論依據(jù)。

雖然本研究初步證實了溶藻菌應(yīng)用于微藻油脂的提取是可行的，但藻菌之間的作用方式和作用機理仍未清楚，有待進一步深入研究。此外，由于溶藻菌對微藻具有選擇特異性，所以關(guān)于溶藻菌和藻種的選擇、菌用量的控制以及對溶藻時間點的把握都是后續(xù)一系列可開展的工作。

[1] 李濤，李愛芬，萬凌琳，等. 中國微藻生物質(zhì)能源專利技術(shù)分析[J]. 可再生能源，2012(3)：36-42.

[2] 賀賜安，余旭亞，趙鵬，等. 微藻油脂提取方法研究進展[J]. 中國油脂，2012，37(8)：16-20.

[3] 繆曉玲，吳慶余. 微藻油脂制備生物柴油的研究[J]. 太陽能學報，2007，28(2)：219-222.

[4] 徐進，徐旭東，方仙桃，等. 高產(chǎn)油小球藻的篩選及其油脂分析[J]. 水生生物學報，2012，36(3)：426-432.

[5] MERCER P, ARMENTA R E. Developments in oil extraction from microalgae[J]. Eur J Lipid Sci Technol, 2011, 113(5): 539-547.

[6] HALIM R, GLADMAN B, DANQUAH M K, et al. Oil extraction from microalgae for biodiesel production[J]. Bioresour Technol, 2011, 102(1): 178-185.

[7] 吳剛，席宇. 溶藻細菌研究的最新進展[J]. 環(huán)境科學研究，2002，15(5)：43-46.

[8] 楊麗麗. 溶藻細菌L7溶藻活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)與提純技術(shù)研究[D]. 廣州：華南理工大學，2010.

[9] DAFT M J, MCCORD S B, STEWART W D P. Ecological studies on algal-lysing bacteria in fresh waters[J]. Freshw Biol, 1975, 5(6): 577-596.

[10] IMAI I, ISHIDA Y, SAKAGUCHI K, et al. Algicidal marine bacteria isolated from northern Hiroshima Bay, Japan[J]. Fish Sci, 1995, 61(4): 628-636.

[11] 彭超，吳剛，席宇，等. 3株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻效應(yīng)[J]. 環(huán)境科學研究， 2003，16(1)：37-40.

[12] BAKER K H, HERSON D S. Interactions between the diatomThallasiosirapseudonannaand an associated pseudomonad in a mariculture system[J]. Appl Environ Microbiol, 1978, 35(4): 791-796.

[13] LEE S, KATO J, TAKIGUCHI N, et al. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacteriumPseudoalteromonassp. strain A28[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(10): 4334-4339.

[14] 史順玉. 溶藻細菌對藻類的生理生態(tài)效應(yīng)及作用機理研究[D]. 武漢：中國科學院研究生院，2006.

[15] IMAI I, ISHIDA Y, HATA Y. Killing of marine phytoplankton by a gliding bacteriumCytophagasp., isolated from the coastal sea of Japan[J]. Mar Biol, 1993, 116(4): 527-532.

[16] BERGER P S, RHO J, GUNNER H. Bacterial suppression ofChlorellaby hydroxylamine production[J]. Water Res, 1979, 13(3): 267-273.

[17] YOSHIKAWA K, ADACHI K, NISHIJIMA M, et al.β-cyanoalanine production by marine bacteria on cyanide-free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacteria[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(2): 718-722.

[18] CHEN C Y, BAI M D, CHANG J S. Improving microalgal oil collecting efficiency by pretreating the microalgal cell wall with destructive bacteria[J]. Biochem Eng J, 2013, 81: 170-176.

[19] WANG M, YUANG W. Bacterial lysis of microalgal cells[J]. J Sustainable Bioenergy Syst, 2014, 4(4): 243.

[20] 章瑩穎，鄧春芳，崔巖，等. 不同方法對微藻細胞破碎及油脂提取效果的影響[J]. 中國油脂，2016，41(3)：61-65.

[21] 胡小文，馬帥，弓淑芬，等. 熒光光譜法檢測微藻中油脂[J]. 中國油脂，2011，36(4)：70-74.

[22] LENNEMAN E M, WANG P, BARNEY B M. Potential application of algicidal bacteria for improved lipid recovery with specific algae[J]. FEMS Microbiol Lett, 2014, 354(2): 102-110.

[23] DEMUEZ M, GONZLEZ-FERNNDEZ C, BALLESTEROS M. Algicidal microorganisms and secreted algicides: new tools to induce microalgal cell disruption[J]. Biotechnol Adv, 2015, 33(8): 1615-1625.

EffectsofalgicidalbacteriaoncelldisruptionandoilextractionofmicroalgaeChlorellavulgaris

DENG Chunfang, CUI Yan, ZHANG Yingying, CHENG Jiayang

(School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, Guangdong, China)

In order to investigate the effects of algicidal bacteria on the cell disruption and oil extraction of microalgaeChlorellavulgaris, with microalgaeChlorellavulgarisas the study object, five strains of algicidal bacteriaKordiasp.,Bowmanelladenitrificans,Aeromonahydrophila,Pseudomonasflurescens, andBacilluscirulanswere mixed cultured. The results showed that the effects of different algicidal bacteria on the cell disruption and oil extraction of microalgaeChlorellavulgariswere different.The aglae-lysing rate ofAeromonahydrophila,Pseudomonasflurescens,Bowmanelladenitrificans,BacilluscirulansandKordiasp. were 73%, 65%, 56%, 56% and 43%, respectively. The oil was extracted fromChlorellavulgarisbyn-hexane.The oil extraction rate ofBowmanelladenitrificans,Kordiasp.,Pseudomonasflurescens,Bacilluscirulans,Aeromonahydrophilaand control group were 58.4%, 52.7%, 24.1%, 22.5%, 21.1% and 10.4%, respectively.Bowmanelladenitrificanswas the most potential algicidal bacterium with high aglae-lysing rate which could be reached in 24 h and the oil extraction rate was 4.6 times higher than that of the control group.

algicidal bacteria;Chlorellavulgaris; cell disruption; oil extraction

2016-10-29；

：2017-03-14

深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20150626110855791)；海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201305022)

鄧春芳(1992)，女，碩士研究生，研究方向為生物能源(E-mail)dcfalice@126.com。

崔 巖，助理研究員，博士(E-mail)cuiyan@pkuse.edu.cn。

TS222+.3；TS225.6

：A

：1003-7969(2017)07-0106-05