3種芝麻蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較研究

張國治,袁東振，蘆 鑫，張問夕，黃紀(jì)念

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，鄭州 450002；3.天津利金糧油股份有限公司，天津 300112)

3種芝麻蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較研究

張國治1,袁東振1，蘆 鑫2，張問夕3，黃紀(jì)念2

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，鄭州 450002；3.天津利金糧油股份有限公司，天津 300112)

采用SDS-PAGE電泳、傅里葉紅外光譜、氨基酸組成分析對亞臨界芝麻粕、天然芝麻和高溫芝麻粕中提取的分離蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：亞臨界芝麻蛋白(SPSI)和天然芝麻蛋白(NSPA)的亞基組成與分布基本一致，高溫芝麻蛋白(SPHS)與前兩種芝麻蛋白的結(jié)構(gòu)有明顯的差異，高溫造成SPHS缺失NSPA的典型亞基，這會(huì)影響其性質(zhì)和應(yīng)用范圍；SPSI、NSPA和SPHS在酰胺III帶的吸收峰分別在1 235、1 237 cm-1和1 240 cm-1；SPSI與NSPA的氨基酸組成基本一致，且相比SPHS的氨基酸配比更符合FAO推薦值；SPSI具有較好的溶解性、吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性。從亞臨界芝麻粕提取的芝麻蛋白的結(jié)構(gòu)破壞程度低，營養(yǎng)價(jià)值較高并且功能性好，更適宜作為食品原料。

芝麻分離蛋白；亞基；結(jié)構(gòu)；性質(zhì)

芝麻是我國重要的油料作物，其中含有20%～25%的蛋白質(zhì)。目前，我國芝麻大部分用于榨油，芝麻餅粕大多用作肥料、動(dòng)物飼料，尚未進(jìn)行深加工，造成大量蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。芝麻蛋白主要由水不溶性11S球蛋白(60%～70%)和可溶性蛋白2S白蛋白(25%)組成，分別被命名為α-球蛋白和β-球蛋白[1]。芝麻蛋白營養(yǎng)價(jià)值較高，其凈蛋白質(zhì)利用率(NPU)為56，蛋白質(zhì)功效比值(PER)為1.8[2]。因此，如何有效利用芝麻餅粕，進(jìn)一步提高芝麻蛋白的深加工水平，開發(fā)芝麻蛋白應(yīng)用領(lǐng)域，成為研究的重點(diǎn)。

本文主要對亞臨界芝麻粕、高溫芝麻粕和天然芝麻中提取的分離蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了比較研究，旨在為開發(fā)具有不同功能特性的芝麻蛋白提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

芝麻：河南平輿康博匯鑫油脂有限公司提供；高溫芝麻粕：河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所提供；大豆油：益海嘉里糧油工業(yè)有限公司。

溴酚藍(lán)、巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R250、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸：美國Amresco公司；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、冰乙酸、甲醇、石油醚，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；K-05型全自動(dòng)凱氏定氮儀；SOX406脂肪測定儀；DGX-9243型鼓風(fēng)干燥箱；Lyovac GT1型冷凍干燥機(jī)：德國SRK公司；DL-5-B離心機(jī)；DS-1型高速組織搗碎機(jī)；TGL20M-Ⅱ高速離心機(jī)、XS205電子天平、FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DYCZ-24DN型電泳槽；DYY-12型電泳儀；WD-9405B脫色搖床；Nicolet IS5傅里葉紅外光譜儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 3種芝麻蛋白的制備

亞臨界芝麻蛋白(SPSI)：芝麻經(jīng)粉碎后，以液化氣為萃取劑，在亞臨界狀態(tài)下，固定萃取次數(shù)3次、壓力1.0 MPa、溫度50℃、料液比1∶3及時(shí)間2 h進(jìn)行芝麻油萃取，固液分離后得到亞臨界芝麻粕。以此粕為原料，經(jīng)過粉碎，脫脂處理后，在pH 10.5、溫度45℃、液固比18∶1、時(shí)間20 min的條件下，提取芝麻蛋白，在-20℃預(yù)凍2 h，最后經(jīng)過真空冷凍干燥處理，得到亞臨界芝麻蛋白成品。

天然芝麻蛋白(NSPA)：以芝麻為原料，經(jīng)過粉碎、脫脂處理后，在pH 9.5、溫度40℃、液固比 20∶1、提取時(shí)間60 min的條件下，提取芝麻蛋白，在-20℃預(yù)凍2 h，最后經(jīng)過真空冷凍干燥處理，得到天然芝麻蛋白成品。

高溫芝麻蛋白(SPHS)：以高溫芝麻粕為原料，經(jīng)過粉碎、脫脂處理后，在pH 12、溫度40℃、液固比20∶1、提取時(shí)間90 min的條件下，提取芝麻蛋白，在-20℃預(yù)凍2 h，最后經(jīng)過真空冷凍干燥處理，得到高溫芝麻蛋白成品。

1.2.2 芝麻蛋白主要成分的測定

水分的測定：參照GB 5009.3—2010；粗蛋白質(zhì)的測定：參照GB 5009.5—2010；灰分的測定：參照GB 5009.4—2010；粗脂肪的測定：參照GB 5009.6—2003；氨基酸分析：參照GB/T 5009.124—2003。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

借鑒Achouri等[3]的方法，利用SDS-PAGE凝膠電泳測定SPSI、NSPA和SPHS在相對分子質(zhì)量分布上的差異。采用12%分離膠(pH 8.8)和3%分離膠(pH 6.8)，芝麻蛋白樣品溶解于0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中，沸水加熱5 min以使芝麻蛋白變性，8 000 r/min離心，上樣8 μL，凝膠電泳于恒流下進(jìn)行，在濃縮膠中電流為10 mA，進(jìn)入分離膠后增至20 mA。凝膠以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250染色2 h，最后用含10%(體積分?jǐn)?shù))甲醇和10%(體積分?jǐn)?shù))冰乙酸的脫色液脫色10 h后，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理[4]。

1.2.4 紅外光譜分析

將樣品干燥后，分別取樣品1 mg與100 mg溴化鉀粉末研磨混勻，壓制成薄片，在傅里葉紅外光譜儀上做全波段(400～4 000 cm-1)掃描測定，以KBr作為空白。

1.2.5 氮溶解指數(shù)的測定

參照AACC 46-23進(jìn)行氮溶解指數(shù)的測定。分別準(zhǔn)確稱取5 g(換算后純蛋白質(zhì)的質(zhì)量)芝麻蛋白(SPSI、 NSPA、 SPHS)樣品，置于3個(gè)400 mL燒杯中，用量筒量取200 mL 30℃的蒸餾水，分幾次加入到燒杯中，樣品混合后將其浸在30℃水槽中，120 r/min 攪拌120 min，在攪拌過程中不斷調(diào)節(jié)pH為7，最后將混合物轉(zhuǎn)到250 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，靜置5 min，取40 mL于50 mL離心管中在8 000 r/min離心20 min，隨后采用微量凱氏定氮法測定上清液中可溶解氮質(zhì)量(N1)和樣品總氮質(zhì)量(N0)。

氮溶解指數(shù)(NSI)的計(jì)算公式如下：

NSI=N1/N0×100%

1.2.6 吸水性及吸油性的測定

參照文獻(xiàn)[5]測定。

1.2.7 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照文獻(xiàn)[6]測定。

1.2.8 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

參照文獻(xiàn)[7]測定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)平行測定3次。采用SAS 9.1.3分析和處理數(shù)據(jù)。P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種芝麻蛋白的主要成分(見表1)

表1 3種芝麻蛋白的主要成分 %

注：同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

由表1可知，SPSI與NSPA的組成成分沒有顯著性差異；SPHS的粗蛋白質(zhì)含量低于前兩者，而粗脂肪、灰分和水分含量高于前兩者。

2.2 SDS-PAGE電泳分析(見圖1)

注：M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1.SPSI；2.NSPA；3.SPHS。

圖13種芝麻蛋白的SDS-PAGE圖譜

由圖1可知，SPSI和NSPA的亞基組成基本一致，說明亞臨界工藝條件比較溫和，對粕中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響比較小。而SPHS中已經(jīng)沒有天然芝麻蛋白的典型亞基，主要亞基組成是在200 kDa左右，原因可能是高溫芝麻粕在加工過程中受到高溫的影響，大部分蛋白質(zhì)發(fā)生聚集現(xiàn)象，通過共價(jià)鍵重新組合成相對分子質(zhì)量較大的條帶。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析(見圖2)

由圖2可知，3種芝麻蛋白的紅外光譜圖基本一致。酰胺A是由N—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，其吸收峰通常在3 400～3 440 cm-1之間。而SPSI、NSPA和SPHS的酰胺A吸收峰分別為3 304、3 373 cm-1和3 396 cm-1，這是因?yàn)楫?dāng)含有N—H基團(tuán)的分子肽段參與氫鍵的形成時(shí)，N—H的伸縮振動(dòng)會(huì)向低頻率移動(dòng)[5]，這也表明3種芝麻蛋白中存在氫鍵。

酰胺B是由飽和結(jié)構(gòu)中CH3和CH2基團(tuán)的C—H 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，在2 850～2 980 cm-1波段有吸收峰[6]。由圖2可知，SPSI、NSPA和SPHS 3種芝麻蛋白的吸收分別在2 960、2 958 cm-1和2 961 cm-1，符合酰胺B的特征吸收。

多糖分子存在C—OH基團(tuán)，因此在1 000～1 100 cm-1之間會(huì)出現(xiàn)C—O伸縮振動(dòng)峰[10]，而SPSI和NSPA特征吸收峰分別是1 076 cm-1和1 096 cm-1，而SPHS在此沒有特征吸收峰。

圖2 3種芝麻蛋白的紅外光譜圖

2.4 氨基酸組成分析(見表2)

表2 3種芝麻蛋白的氨基酸組成 g/100 g

由表2可知，SPSI和NSPA的氨基酸組成基本接近，富含8種必需氨基酸，其蘇氨酸、絲氨酸、胱氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸的含量明顯高于SPHS中的含量。由此可見，亞臨界萃取工藝對芝麻蛋白的影響比較??；而高溫條件下，芝麻粕中的蛋白質(zhì)可能發(fā)生了變性。相比于FAO氨基酸推薦標(biāo)準(zhǔn)，SPSI中的蘇氨酸、組氨酸和精氨酸明顯高于其推薦值。所以，亞臨界芝麻蛋白相比于高溫芝麻蛋白更具有利用的價(jià)值。

2.5 3種芝麻蛋白功能性質(zhì)的比較(見表3)

表3 不同芝麻蛋白的功能性質(zhì)比較

注：同行不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

由表3可知， SPHS的NSI最低，是因?yàn)槭艿礁邷氐挠绊?，芝麻蛋白變性程度較大，疏水基團(tuán)外露，增加了表面疏水性，造成NSI降低。一般情況下，組成蛋白質(zhì)的非極性氨基酸側(cè)鏈分布于分子內(nèi)部，形成疏水性內(nèi)核；而極性氨基酸分布在蛋白質(zhì)的外圍，形成親水的表面。由于SPSI和NSPA沒有經(jīng)過高溫過程，所以它們的NSI要高于SPHS。SPSI和NSPA的吸水性和吸油性無顯著性差異，SPHS的吸水性弱可能因?yàn)楦邷厥沟鞍踪|(zhì)的疏水性氨基酸側(cè)鏈暴露，導(dǎo)致其吸水性最弱；而SPHS的吸油性弱可能因?yàn)樵诟邷剡^程中蛋白質(zhì)發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變性，疏水基團(tuán)受到破壞，導(dǎo)致其吸油性最低。

蛋白質(zhì)是兩親結(jié)構(gòu)，由親水的表面和疏水的核心組成，這種特殊的結(jié)構(gòu)決定了芝麻蛋白具有乳化性。相比于SPSI和NSPA，SPHS具有較好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。因?yàn)镾PHS在高溫過程中發(fā)生較大變性，空間結(jié)構(gòu)受到破壞，大量疏水基團(tuán)外露，NSI降低，但在某種程度上增加了蛋白質(zhì)和油的結(jié)合能力，與SPSI、NSPA相比較，可能更容易使乳化體系趨于穩(wěn)定。

研究表明，蛋白質(zhì)的起泡性與其結(jié)構(gòu)之間有著密切的關(guān)系。起泡性較好的蛋白質(zhì)，其分子柔韌性較好，并能快速在界面上吸附并展開，降低表面張力；而分子呈高度有序排列的球蛋白，分子柔韌性較差，其起泡能力相對較差[11-14]。SPHS的起泡性優(yōu)于SPSI、NSPA，但泡沬穩(wěn)定性較差于后兩者。原因可能是因?yàn)镾PHS在高溫作用下，蛋白質(zhì)分子肽鏈重新展開，其柔韌性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子向氣水界面的遷移速率得到提升，因此改善了其起泡性。而又因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的起泡能力和穩(wěn)定性可能受不同的兩組蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響，而這兩組性質(zhì)彼此是對抗的，因此SPHS泡沫穩(wěn)定性較差。

3 結(jié) 論

(1)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明：亞臨界芝麻蛋白(SPSI)和天然芝麻蛋白(NSPA)的亞基組成與分布基本一致，高溫芝麻蛋白(SPHS)與SPSI、NSPA的組成有明顯的差異，高溫造成SPHS缺失天然芝麻蛋白的典型亞基，這會(huì)影響其性質(zhì)和應(yīng)用范圍。通過紅外譜圖分析可知，SPSI、NSPA、SPHS在酰胺Ⅲ帶的吸收峰分別在1 235、1 237、1 240 cm-1。氨基酸組成分析結(jié)果表明，SPSI與NSPA的氨基酸組成基本一致，且較SPHS的氨基酸配比更符合FAO推薦值。

(2)對3種芝麻蛋白性質(zhì)的比較發(fā)現(xiàn)，SPSI具有較好的溶解性、吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性，并且SPSI與NSPA的功能性質(zhì)基本一致，說明亞臨界萃取工藝對芝麻粕中蛋白質(zhì)的損害較小。由于高溫作用導(dǎo)致SPHS的功能性質(zhì)較差，不利于蛋白質(zhì)的深加工和利用。

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Comparisonofstructureandpropertiesofthreekindsofsesameproteins

ZHANG Guozhi1，YUAN Dongzhen1，LU Xin2，ZHANG Wenxi3，HUANG Jinian2

(1. School of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 3. Tianjin Lijin Grain and Oil Co., Ltd., Tianjin 300112,China)

The differences in structure and properties of supercritical sesame protein(SPSI), natural sesame protein (NSPA) and high temperature sesame protein(SPHS) were comparatively studied by SDS-PAGE electrophoresis, FTIR and amino acid composition analysis. The results showed that there was no difference in the composition and distribution of subunits of SPSI and NSPA. While the structure of SPHS was different from the above sesame proteins, and the typical subunits of the NSPA were lost because of high temperature, which would affect its properties and application range. The amide III band absorption peaks of SPSI, NSPA and SPHS were at 1 235, 1 237 cm-1and 1 240 cm-1respectively. Amino acid compositions of SPSI and NSPA were basically the same, and the amino acid ratio was more in line with the FAO recommended values than SPHS. SPSI had good solubility, water absorption, oil absorption, emulsifying ability, emulsion stability and foam stability. The level of structural damage was low in the protein which was extracted from subcritical sesame meal, and it was more suitable as a food ingredient because of the highly nutritional value and functional property.

sesame protein isolate; subunit; structure; property

2016-11-25

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(201315614)

張國治(1964)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称焚Y源開發(fā)與利用(E-mail)zgzhi11@163.com。

TS229；TQ936.2

：A

：1003-7969(2017)07-0055-05