萬古霉素修飾磁性納米粒子用于富集分離細菌的研究

饒大偉，伍 嬌，陳儀軒，楊 坤

(四川大學 化學工程學院 資源與環(huán)境微生物實驗室，四川 成都 610065)

萬古霉素修飾磁性納米粒子用于富集分離細菌的研究

饒大偉，伍 嬌，陳儀軒，楊 坤*

(四川大學 化學工程學院 資源與環(huán)境微生物實驗室，四川 成都 610065)

利用溶劑熱合成法制備Fe3O4磁性納米粒子，并以N-膦羧甲基)亞氨基二乙酸(PMIDA)為橋連接Fe3O4和萬古霉素從而形成Fe3O4-PMIDA-Van 體系用以富集并檢測致病菌，文中介紹了兩種不同的Fe3O4磁粒表面修飾方法， 采用紅外和Zeta電勢對產(chǎn)物進行表征，并研究了其對革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)和革蘭氏陽性菌腸球(Enterococcus)的吸附作用。最后通過 PCR檢測的方法也確定磁粉富集菌體的有效性及。結(jié)果表明，該磁性納米顆粒能在短時間內(nèi)實現(xiàn)樣品中細菌的富集,并且對菌體的吸附平衡可以用Langmuir吸附等溫性進行描述，其對E. coli和Enterococcus的理論濃縮倍數(shù)分別高達2200和4000倍。

磁性納米粒子；菌體富集；PMIDA；萬古霉素

近年來，雖已經(jīng)開發(fā)出眾多精密的生物傳感器和分析方法用于致病菌的檢測[1-5]，但現(xiàn)今致病菌檢測方面的研究多重視檢測方法和設(shè)備(微設(shè)備或生物傳感器)的開發(fā)，卻忽視了樣品制備過程的重要性[6]。目前的檢測手段在檢測低濃度的 致病菌時，所需的富集培養(yǎng)時間較長，難以達到即時檢測的目的。

磁性納米粒子是近年發(fā)展起來的一種新型材料，由于具有超順磁性，在環(huán)境中能達到快速分離的作用而在生物技術(shù)領(lǐng)域被越來越多的研究學者關(guān)注。萬古霉素是一種糖肽類廣譜抗生素，它對細菌有吸附作用主要是萬古霉素與革蘭氏陽性菌細胞壁表面末端D-Ala-D-Ala[7]部分，通過氫鍵來完成與革蘭氏陽性菌的結(jié)合。因此為了結(jié)合以上兩種優(yōu)勢，通過文獻調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)有機磷酸分子(磷酸化合物、含磷化合物、次磷酸化合物及其衍生物)與金屬氧化物、羥化物、磷酸鹽相互之間有著強烈親和作用[8]，因此我們選擇PMIDA(雙甘膦)—廉價的磷酸偶聯(lián)劑作為中間媒介，該分子中含有 1個磷酸基團和 2個羧基，當磷酸基團和納米粒子形成緊密連接時，另一端的羧基與萬古霉素的亞氨基和氨基在EDC和NHS催化下反應形成酰胺鍵，從而將 Fe3O4磁性納米顆粒與萬古霉素成功地結(jié)合在一起，形成Fe3O4-PMIDA-Van 體系。事實上，通過抗生素與致病菌之間的結(jié)合力來吸附菌體已經(jīng)有很多的報道，而本論文優(yōu)勢在于合成方法簡單、快速，成本低，并且也取得了可觀的吸附效果，其對E. coli和Enterococcus的理論濃縮倍數(shù)分別高達2200和4000倍。

1 磁性Fe3O4-PMIDA-Van吸附菌體原理

圖1展示了在磁性納米粒子表面連接PMIDA以及萬古霉素的全過程。其中PMIDA是一種廉價的膦酸偶聯(lián)劑，有機膦酸分子(膦酸化合物、含磷化合物、次磷酸化合物和他們的衍生物)與金屬氧化物、羥化物、碳酸鹽、磷酸鹽的有強烈親和作用[8]該分子中含有1個磷酸基團和2個羧基。當磷酸基團與納米粒子緊密相連時，另一端的-COOH使納米粒子間產(chǎn)生靜電排斥，這使得鐵磁流體異常穩(wěn)定，然后在EDC和NHS的催化下，PMIDA上的-COOH與表面含有-NH2的萬古霉素發(fā)生酰化反應，從而連接到MNP-PMIDA體系上。得到萬古霉素修飾的磁性納米顆粒Fe3O4-PMIDA-Van。其原理合成圖如圖1。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

聚乙二醇 2000、聚乙二醇 6000、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、無水乙酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉，以上幾種藥品均為分析純，購買于成都市科龍化工試劑廠；N-(膦?；谆?亞氨基二乙酸(PMIDA)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-3二甲基氨丙基-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，以上藥品也同為分析純，購買于合肥博美生物科技有限責任公司，鹽酸去甲基萬古霉素(Van)、瓊脂糖購買于biosharp公司，LB肉湯、營養(yǎng)肉湯購買于北京陸橋技術(shù)有限責任公司。實驗用水均為無菌水。

傅里葉變換紅外光譜儀，Z eta電位儀，ABI Veriti梯度PCR儀 9902(Applied Biosystems),多功能水平電泳槽 EPS600(Tanon)；凝膠成像儀 JY04S-3E(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

2.2 (Fe3O4-PMIDA-Van)復合納米粒子的合成

2.2.1 Fe3O4磁性納米粒子的表面活化

采用溶劑熱法制備取Fe3O4粒子，將FeCl3· 6H2O(2.7 g，10 mmol)，無水乙酸鈉(3.6 g)和聚乙二醇(1.0 g)加入乙二醇溶液(40 mL)中，待完全溶解，然后加入反應釜中，在200 ℃下反應8 h；將上步驟所得產(chǎn)物洗滌干燥處理后，取50 mg該粒子分散在1 mL去離子水中，加入NaOH(183 mg)，PMIDA(250 mg)，水浴條件下用超聲波細胞粉碎機超聲探頭超聲15 min(5s開/5s關(guān)，2 %，20 ℃),然后于搖床27℃保溫振蕩8 h后。分離洗滌出粒子，然后分散在1 mL MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中，得到表面活化磁粉(Fe3O4-PMIDA)。

2.2.2 萬古霉素修飾表面活化的Fe3O4磁性納米粒子(Fe3O4-PMIDA-Van)

方法一：向以上分散在MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中的表面活化磁粉Fe3O4-PMIDA中加入EDC(33 mg)和NHS(9.99 mg)，于冰浴條件下用超聲波細胞粉碎機探頭超聲3 min(2%， 5 s 開/5 s 關(guān)， 20 ℃)后，搖床27 ℃保溫振蕩1 h。然后用MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液洗滌3次，重新分散于1 mL的MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中，加入萬古霉素(50 mg)，于27 ℃搖床保溫振蕩24 h。反應結(jié)束后，用去離子水洗滌，得到萬古霉素修飾的磁性納米顆粒(Fe3O4-PMIDA-Van)。

方法二：稱取向1 mL MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中加入萬古霉素(15 mg)和 EDC(15 mg)，再加入分散于MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中Fe3O4-PMIDA混合液1 mL，于冰水浴條件下用超聲波細胞粉碎機超聲(2%，5 s 開/5 s 關(guān)，20 °C)15min后。再將以上反應液于普通超聲20 min，放于27℃搖床中保溫振蕩反應 24 h。

2.3 Fe3O4-PMIDA-Van與菌體的吸附平衡實驗

取20 μL Fe3O4-PMIDA-Van懸浮液與1mL不同細胞濃度的細菌稀釋液(用高壓滅菌蒸餾水制備)在管式旋轉(zhuǎn)器上在室溫下溫育10min后，使用強磁鐵將磁性顆粒與液相分離。記錄吸附前(和磁分離后)的液相在600nm的光密度(OD)值，通過適當稀釋在線性范圍內(nèi)檢測所有光密度?；谖胶痛欧蛛x前后的懸浮液中的細菌量的差計算吸附細菌的量。對于大腸桿菌，顯示600 nm處的1 OD等同于2.5×1010CFU/mL，對于腸球菌，1OD = 6.4×109CFU/mL。通過將觀察數(shù)據(jù)擬合到Langmuir方程獲得吸附等溫線：

(1)

其中：

q：每毫升磁球中吸附的菌體數(shù)(CFU/mL)；c: 吸附平衡液相濃度(CFU/mL)；kd：解離常數(shù)(CFU/mL)；qmax：最大吸附量(CFU/mL)。

2.4 菌體的PCR檢測實驗

將培養(yǎng)了12 h的細菌培養(yǎng)物，通過高壓滅菌的蒸餾水將大腸桿菌稀釋成50至5×106CFU/mL，腸球菌稀釋成的細菌稀釋梯度1至105CFU/mL，每個菌體濃度的體積為3.6 mL，在添加Fe3O4-PMIDA-Van之前，①從每個管各自取90 μL樣品于新試管，再向每只試管中加入10 μL 0.25 mol/L的NaOH溶液用于隨后的PCR擴增；②向每只試管中加入20 μL(Fe3O4-PMIDA-Van)磁粉，吸附10 min后，取出上清液90 μL，加入10 μL 0.25 mol/L的已滅菌的NaOH溶液裂解菌液；③向上述步驟②小心地除去剩余的上清液后，回收每個管中的顆粒-細菌聚集體，并重懸于20μL的0.025 mol/L NaOH中；另外，20μL Fe3O4-PMIDA-Van懸浮液加入3.6 mL以上稀釋所用的高壓滅菌過的蒸餾水中，經(jīng)過以上同樣的處理方式來作為陰性對照。將以上三組菌液放于75 ℃中保溫10min，使其裂解出DNA，使用強磁體從顆粒-細菌聚集體樣品和陰性對照中除去磁性顆粒，小心轉(zhuǎn)移上清液到干凈的離心管，液體樣品用作隨后PCR擴增的模板。分別使用β-酰胺類抗生素的抗性基因Bla-TEM[9](FOR [5'-CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3']和REV [5'-CGTTCATCCAT AGTTGCCTGAC-3'])和多粘菌素類抗性基因mcr-1[10](FOR [5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-'3]和REV [5'- CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3'])兩個特異性引物對來擴增腸球菌和大腸桿菌選定的基因序列。其中Bla-TEM引物的PCR反應條件為94℃ 5min的初始變性，35個循環(huán)的94℃ 30s，60℃ 30s和72℃ 48s，最后在72℃延伸5min終止反應。mcr-1引物的PCR反應條件為94℃ 15min的初始變性，33個循環(huán)的94℃ 30s，60℃ 90s和72℃ 48s，最后在72℃延伸5min終止擴增。相應的PCR產(chǎn)物大小為800bp和309bp。擴增產(chǎn)物通過GelRed染色的瓊脂糖凝膠電泳(1.5%(w / v)瓊脂糖)檢查。

3 結(jié)果與討論

3.1 表征

通過FTIR檢測Fe3O4-PMIDA-Van磁性粒子表面上的官能團，結(jié)果顯示在圖2中。圖2A為Fe3O4的紅外圖譜，中心在594 cm-1的特征峰可以歸因于Fe-O的伸縮振動。3400 cm-1出現(xiàn)的峰值為Fe3O4表面羥基的特征峰；相比于2A，2B在1050 cm-1左右出現(xiàn)了較明顯的新吸收峰，推測為PMIDA叔胺結(jié)構(gòu)C-N的振動吸收峰。并且B的整體吸收峰強度比A要有所增強，推測一方面為摻入新分子后Fe3O4納米粒子的晶化率降低，另一方面為連接的PMIDA分子含有羥基和強電負性O(shè)原子，易在Fe3O4納米粒子表面形成氫鍵，使化學鍵的極化程度增大，紅外吸收峰強度增強；在修飾上萬古霉素后，圖2C中1224.87 cm-1和1188.92 cm-1，推測為芳基醚與脂肪基醚C-O-C的不對稱伸縮振動峰，1040 cm-1為它們的對稱伸縮振動峰；1641 cm-1處的較強峰和1550 cm-1附近的較弱峰推測分別為酰胺基Ⅰ帶中C=O伸縮振動和N-H彎曲振動與酰胺基Ⅱ帶C-N伸縮振動和N-H彎曲振動，上述結(jié)果表明，PMIDA成功的將萬古霉素修飾到Fe3O4上形成Fe3O4-PMIDA-Van體系。而Zeta電勢的實驗結(jié)果(如表1)也印證了以上的結(jié)果，F(xiàn)e3O4的Zeta電勢為22.7 mV，主要是由于該用10 mmol/L的鹽酸活化因此表現(xiàn)正電荷，而Fe3O4-PMIDA的Zeta電勢-11.8 mV主要為修飾上PMIDA后，表面帶有的-COO-顯示出電負性， Fe3O4-PMIDA-Van的Zeta電勢42.5 mV，可能是由于修飾上萬古霉素表面的-NH2表現(xiàn)出正電勢。以上結(jié)果都是在蒸餾水中測量。

表1 Fe3O4，F(xiàn)e3O4-PMIDA和Fe3O4-PMIDA-Van(方法二)的電勢

圖2 Fe3O4，F(xiàn)e3O4-PMIDA和Fe3O4-PMIDA-Van的紅外圖譜

Fig.2 Infrared spectra of Fe3O4,Fe3O4-PMIDA and Fe3O4-PMIDA-Van

3.2 細菌濃度的定量分析過程

我們觀察到兩種方法制備的Fe3O4-PMIDA-Van顆粒對大腸桿菌和腸球菌的吸附平衡很好的符合了Langmuir(公式1)模型。兩種方法制備Fe3O4-PMIDA-Van顆粒對兩種細菌的吸附參數(shù)總結(jié)在表2中，在吸附等溫線的基礎(chǔ)上，使用質(zhì)量守恒分析來檢查磁性細菌濃縮過程，可以估計其濃度程度。當菌液被稀釋到低濃度時(比如c≤105)，c值會比kd值小2個數(shù)量級，即c值相對于kd極小，可理解為kd+ c =kd，則Langmuir方程就可以被簡化為：

(2)

而質(zhì)量平衡可以表達為：

c0V1=cV1+qVs

(3)

c0：原始菌液的濃度(CFU/mL)；V1：樣品溶液的體積(mL)；Vs：加入磁球的體積(mL)。

聯(lián)立等式(2)、(3)，可得：

(4)

所以，濃縮比q/C0可表達為：

(5)

其大小主要取決于磁球?qū)毦奈教匦?qmax/kd)和固液兩相的比(V1/Vs)，

而當V1/Vs趨近于無窮大時，理論最大濃縮比q/c0=qmax/kd。

圖3 方法一對大腸桿菌吸附數(shù)據(jù)擬合吸附等溫線

圖4 方法一對腸球菌的吸附數(shù)據(jù)擬合吸附等溫線

圖5 法二對大腸桿菌和腸球菌的吸附數(shù)據(jù)擬合吸附等溫線

由圖3～5的數(shù)據(jù)處理可知，F(xiàn)e3O4-PMIDA對兩種菌的理論最高濃縮比分別約為12倍和4倍，可見其對于細菌幾乎不存在吸附作用。而由方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van對大腸桿菌和腸球菌均表現(xiàn)出吸附作用。其中對大腸桿菌的理論最高濃縮倍數(shù)約2200倍，對腸球菌測理論最高濃縮倍數(shù)近1500倍，即方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van對大腸桿菌的吸附選擇性強于腸球菌(表2)。而由方法二制得的Fe3O4-PMIDA-Van只對腸球菌表現(xiàn)出較強的吸附作用，理論最高濃縮比高達約4000倍；而對大腸桿菌的理論最高濃縮比僅約為500倍，方法二制得的Fe3O4-PMIDA-Van對腸球菌的吸附選擇性強于大腸桿菌(表3)。

表2 方法一 Fe3O4-PMIDA-Van對細菌吸附朗繆爾等溫線參數(shù)

表3 方法二 Fe3O4-PMIDA-Van對細菌吸附朗繆爾等溫線參數(shù)

3.3 磁性吸附及PCR-Gel檢測

使用方法一制備的Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)磁粉對大腸桿菌的水性樣品進行磁性濃縮，隨后進行PCR檢測。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，如圖6所示。如凝膠中所示，在凝膠中都沒有看到非特異性產(chǎn)物，說明引物設(shè)計和PCR條件是比較合理的。從前7個樣品(泳道1至7)，可以看出對于大腸桿菌，無磁性濃度的PCR擴增的檢測限為約106CFU / mL。接下來的六個樣品(泳道8至14)代表用Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)吸附后收集的上清液。測試的任何上清液中都沒有檢測到細菌，顯然，通過Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)的大腸桿菌捕獲效率非常高，在磁性濃縮(凝膠上的泳道15至21)后，分別將大腸桿菌的PCR擴增的檢測限提高至104和103CFU / mL。而且比較前六個泳道和泳道15之間的條帶強度，細菌濃度變化是顯而易見的。

使用方法二制備的Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)磁粉對腸球菌的水性樣品進行磁性濃縮后進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，如圖7所示。從前7個樣品(泳道1至7)和接下來的用Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)吸附后收集的上清液的7個樣品(泳道8至14)測試中都沒有檢測到細菌，原因是原始樣品的濃度稀釋較低，未達到 PCR擴增檢測不到的水平，但是，通過Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)磁性濃縮(凝膠上的泳道15至21)后，出現(xiàn)了兩條較強條帶，細菌濃度變化也是顯而易見的。

其中1-6、8-13分別為原始菌液、磁粉吸附原始菌液之后上清液，15-20為吸附菌液的磁粉菌體，而7，14，21分別陰性對照

圖6 Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)PCR分析

Fig.6 PCR analysis of Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)

其中1-6、8-13分別為原始菌液、磁粉吸附原始菌液之后上清液，15-20為吸附菌液之后的磁粉菌體，而7，14，21分別陰性對照

圖7 Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)PCR分析

Fig.7 PCR analysis of Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)

4 討論

以上的結(jié)果表示：方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒的細菌吸附實驗結(jié)果表明此法制得的磁粒對大腸桿菌的吸附選擇性強于腸球菌；而方法二的實驗結(jié)果表明對腸球菌的吸附選擇性強于大腸桿菌。方法一是先通過將已經(jīng)制得的Fe3O4-PMIDA用EDC與其PMIDA結(jié)構(gòu)中的羧基反應生成一種不穩(wěn)定的脲衍生物中間物，再用NHS與該不穩(wěn)定中間產(chǎn)物反應生成更穩(wěn)定的酯化物而增強碳二亞胺交聯(lián)產(chǎn)物的穩(wěn)定性[10-11]，防止其自身重排成相應的穩(wěn)定的脲的副產(chǎn)物的方法獲得Fe3O4-PMIDA活化后的中間體，再用萬古霉素中的氨基和亞氨基進攻該中間體的O-異?；褰Y(jié)構(gòu)形成酰胺交聯(lián)最終生成Fe3O4-PMIDA-Van磁粒。而方法二是先將EDC與萬古霉素溶解于MES緩沖液并混合一段時間，再將實驗制得的Fe3O4-PMIDA加入混合液中以與方法一相同的原理進行反應，只是其中沒有加入NHS。

針對以上實驗結(jié)果，我們有如下猜測：

方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒對大腸桿菌的吸附選擇性強于腸球菌可能是因為萬古霉素的氨基與亞氨基主要集中在吸附革蘭氏陽性菌的活性部位內(nèi)部，而在萬古霉素以固體形式溶解于已經(jīng)充分活化的Fe3O4-PMIDA分散液時，該部位內(nèi)的氨基與亞氨基與活化的中間體發(fā)生快速反應，導致大部分萬古霉素以單分子的形式連接在磁粒表面且其活性部位因結(jié)構(gòu)變化喪失活性。同時，以此方式連接的萬古霉素朝向外側(cè)的配糖基可能與革蘭氏陰性菌表面的尚未探究清晰的不知名的受體相結(jié)合導致該法制得的磁粒對大腸桿菌的吸附選擇性強于腸球菌；而據(jù)報道EDC也可用于活化磷酸酯基團[12]，故推測過量的EDC使得PMIDA與Fe3O4所成的亞磷酸酯鍵斷裂，最終導致該實驗方案難以獲得完整的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒，這也可能是造成方法一中實驗重復率較低的原因。

根據(jù)查閱的文獻可知萬古霉素吸附革蘭氏陽性菌的原理為萬古霉素的N端(N-甲基亮氨酸)、B-羥基氯代酪氨酸、天冬氨酸以及對羥基苯基甘氨酸中的4個NH聚合成簇與D-Ala-D-Ala的C-端羧基陰離子形成氫鍵,且N端N-甲基亮氨酸折疊形成一個疏水的腔體,加強了該氫鍵作用力[13]，而本實驗方法二所制備的磁粉對革蘭氏陽性菌的非常良好的吸附作用原因可能有：1)在萬古霉素溶解于MES緩沖溶液中，通過自身含有的大量氫鍵進行了自組裝形成雙聚體；同時，在EDC的催化作用下，萬古霉素可能通過自身具有的羧基和氨基進行分子間的酰胺化反應形成二聚體甚至是多聚體。1998年，Williams[14]通過進一步的研究表明萬古霉素二聚體的形成可大大提高萬古霉素對革蘭氏陽性菌的吸附作用，并且形成二聚體的萬古霉素按照方法一里的方式連接在Fe3O4-PMIDA上后因不以單分子形式存在致使吸附部位仍具有活性，而配糖基中的氨基用于與其它萬古霉素分子的羧基進行酰胺連接或背靠背形成雙聚體的話可能導致配糖基無法用于吸附革蘭氏陰性菌的未知受體，最終導致方法二制得的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒對革蘭氏陰性菌吸附能力大大減弱[14-15]；2)方法二中EDC可能首先與萬古霉素反應消耗了一定量。并且在Fe3O4-PMIDA加入后，由于反應的難易程度，EDC可能選擇與羧基先進行反應進而催化Fe3O4-PMIDA與萬古霉素的酰胺化反應，沒有足夠的時間和濃度繼續(xù)催化Fe3O4-PMIDA亞磷酸酯基斷裂，使完整Fe3O4-PMIDA-Van形成的可能性大大增加；3)據(jù)報道，由于萬古霉素的過度使用,細菌糖蛋白合成啟動子C-端(D-Ala-D-Ala)經(jīng)自身修飾部分變成D-Ala-D-Lactate,即以酯鍵代替酰胺鍵。酰胺鍵與酯鍵的轉(zhuǎn)換不僅導致一個氫鍵的減少,而且D-Ala-D-Lactate的酯氧原子與萬古霉素的對羥基苯基甘氨酸的羰氧原子之間的排斥作用使萬古霉素與胞壁酰五肽作用大大減弱。對于該類萬古霉素耐藥革蘭氏陽性菌而言，EDC可能與萬古霉素的對羥基苯基甘氨酸的羧基進行反應生成不穩(wěn)定的脲衍生物中間物，而方法二中并未加入NHS，不穩(wěn)定的脲衍生物中間物進而自身重排成相應的穩(wěn)定的脲的副產(chǎn)物，該脲副產(chǎn)物中包含的許多酰胺鍵的-NH-可能與D-Ala-D-Lactate的酯氧原子形成氫鍵，提高萬古霉素對革蘭氏陽性耐藥菌的吸附能力。

5 結(jié)論

本篇文章運用了一種簡單、快速、廉價、對環(huán)境友好的合成方法，用PMIDA在磁性納米粒子表面引入活性集團，再在EDC和NHS催化下與萬古霉素連接，形成Fe3O4-PMIDA-Van體系，用以吸附革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌腸球菌，通過實驗和理論分析表明，經(jīng)修飾后的磁性納米粒子富集菌體稀釋液，可以將PCR檢測靈敏度提高兩到三個數(shù)量級。此種磁性納米粒子用在菌體的磁性分離中，可用于在短時間內(nèi)提高樣品中的菌濃度，大大縮短檢測時間，總體上，我們的研究表明本方法制備的磁粉和PCR檢測提供了一種吸引人的替代免疫磁性分離/PCR改進農(nóng)業(yè)和食品生物技術(shù)應用的病原體檢測。

[1] Lazcka O,Del Campo F J,Munoz F X.Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors[J].Biosens Bioelectron,2007,22:1205-1217.

[2] Palchetti I,Mascini M.Electroanalytical biosensors and their potential for food pathogen and toxin detection[J].Anal Bioanal Chem,2008,391:455-471.

[3] Morris B A,Sadana A.A fractal analysis of pathogen detection by biosensors[J].Biophys Chem,2005,113:67-81.

[4] Kim D K,Yoo S M,Park T J,et al.Plasmonic properties of the multispot copper-capped nanoparticle array chip and its application to optical biosensors for pathogen detection of multiplex DNAs[J].Anal Chem,2011,83:6215-6222.

[5] Cho I H,Irudayaraj J.In-situ immuno-gold nanoparticle network ELISA biosensors for pathogen detection[J].Int J Food Microbiol,2013,164:70-75.

[6] Brehm-Stecher B,Young C,Jaykus L A,et al.Sample preparation: the forgotten beginning[J].J Food Prot,2009,72:1774-1789.

[7] Walsh C. Microbiology-deconstructing vancomycin[J]. Science,1999,284(5413):442-443.

[8] Mutin P H,Guerrero G,Vioux A.Hybrid materials from organophosphorus coupling molecules[J].Journal of Materials Chemistry,2005,15(35-36):3761-3768.

[9] Liu Y Y,Wang Y,Walsh T R,et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study[J].Lancet Infectious Diseases,2016,16(2):161-168.

[10] Lee J M,Edwards H H L,Pereira C A,et al.Crosslinking of tissue-derived biomaterials in 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide(EDC)[J]. J Biomed Med,1996,7(9):531-541.

[11] Olde D L H,Dijkstra P J,Van Luyn M J,et al.Cross-linked of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimde[J].Biomaterials,1996,17(8):765-773.

[12] 喻 平,胡泉源,祁小云,等.EDC在有機合成中的應用研究進展[J].廣州化工,2011(8):9-11,23.

[13] Pearce C M,Gerhard U,Williams D H.Ligands whichbind weakly to vancomycin:studies by13C NMR spectroscopy[J].Journal of the Chemical Society,1995,12(1):159-162.

[14] Dancer R J,Try A C,Sharman G J,et al.Binding of a vancomycin group antibiotic to a cell wall analogue from vancomycin-resistant bacteria[J].Chemical Communications,1996,12:1445-1446.

[15] Konrad Bleicher,Mengfen Lin,And M J S,et al.Diffusion edited NMR: screening compound mixtures by affinity NMR to detect binding ligands to vancomycin[J].Journal of Organic Chemistry,1998,63(23):8486-8490.

(本文文獻格式：饒大偉，伍 嬌，陳儀軒，等.萬古霉素修飾磁性納米粒子用于富集分離細菌的研究[J].山東化工,2017,46(11):42-46.)

Vancomycin-modified Magnetic Nanoparticles and the Endowed Bacteria Enrichment Capacity

RaoDawei,WuJiao,ChenYixuan,YangKun*

(College of Chemical Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

In this study,magnetic Fe3O4nanoparticles were synthesized by solvent thermal synthesis method,followed by modifying the surface of Fe3O4nanoparticles containing hydroxyl using phosphonomethyl iminodiacetic acid,thus the formation of Fe-O-P bonds tightly fixed to the magnetic surface of the nanoparticles to successfully introduce -COOH. The s
Table surface functionalized nanoparticles were further linked with vancomycin (Van) for the enrichment of bacteria.Then the shape and structure of Fe3O4-PMIDA-Van Composite Nanoparticles were characterized by using a transmission electron microscope (TEM) .The adsorption capacity of the Van modified MNPs to gram-negative (E. coli) and gram-positive (Enterococcus)bacteria were determined,respectively. These result demonstrated that surface modified nanoparticles exhibited high affinity to bacteria,which could realize fast enrichment of bacteria from samples .And adsorption isotherms were obtained by fitting observed data to the Langmuir equation. In the case of bacteria concentration with the MNPs,the theoretical highest concentration ratio were calculated to be 2300 and 1300 for E. coli and Enterococcus,respectively.

magnetic nanoparticles;bacteria enrichment;PMIDA;Van

2017-04-07

國家自然科學基金(11375123)

饒大偉(1990—)，男，碩士在讀，主要從事化學與生物工程研究；*通訊作者：楊 坤，副教授。

TQ138.1

A

1008-021X(2017)11-0042-05