冰片對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率的影響

李旭廷，李思聰，周 芳，楊 銳，王 斌

(四川省畜牧科學(xué)研究院/動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066)

冰片對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率的影響

李旭廷，李思聰，周 芳，楊 銳，王 斌

(四川省畜牧科學(xué)研究院/動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066)

為研究冰片對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率的影響，采用超濾法結(jié)合超高效液相色譜法，比較未加冰片和加入冰片后氟苯尼考的血漿蛋白結(jié)合率。25、5 、1 μg/mL三種濃度下，氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率分別為牛23.68%±1.25%、25.26%±1.42%、26.46%±1.48%，大鼠31.33%±1.82%、32.32%±1.46%、34.15%±1.59%，家兔15.69% ±1.45%、19.31%±1.26%、24.38%±1.51%，肉雞21.68% ±1.37%、20.13%±1.84%、20.52%±1.77%,豬30.08%±1.03%、31.02%±1.28%、30.56%±1.55%。氟苯尼考5 μg/mL濃度下與冰片合用,血漿蛋白結(jié)合率無顯著變化。結(jié)果表明，氟苯尼考有較低的血漿蛋白結(jié)合率，冰片對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率無顯著影響。

超濾法；冰片；氟苯尼考；蛋白結(jié)合率；高效液相色譜法

氟苯尼考(florfenicol)是美國先靈-葆雅(Schering-Plough)公司20世紀(jì)80年代研制開發(fā)的獸用廣譜抗菌藥，為新型的氯霉素類抗菌藥，其特點(diǎn)是抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣泛，無潛在的致再生障礙性貧血作用[1]，目前廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中敏感菌引起的感染性疾病的防治[2-5]。冰片作為傳統(tǒng)引經(jīng)藥物，具有“芳香走竄、引藥上行”的功能，臨床上常與他藥聯(lián)用，促進(jìn)藥物吸收、透過“血腦屏障”等[6-10]。盡管冰片與其他藥物聯(lián)用的藥物-藥物影響研究較多，但少有冰片對藥物血漿蛋白結(jié)合率影響的報(bào)道。鑒于冰片作為養(yǎng)殖臨床應(yīng)用非常廣泛的一類中藥，與氟苯尼考等獸用抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的可能性與日俱增，有必要開展冰片對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率影響的研究，以期為臨床安全、合理配伍使用藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 Ultimate 3000 型高效液相色譜儀系統(tǒng)，美國戴安公司產(chǎn)品；Sartorius BD211D電子天平，德國塞多利斯產(chǎn)品；KQ-300VDE雙頻數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A微型渦旋混合儀，上海市滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；TGL-16G 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Eppendorf Research○Rplus精密移液器，艾本德中國有限公司產(chǎn)品；Amicon○RUltra-0.5mL型超濾管(10K),密理博公司產(chǎn)品。

1.1.2 藥品與試劑 氟苯尼考對照品(含量99.3%，批號K0301305)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；冰片(龍腦含量65.0%，批號20150801)，廣州化工有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈(色譜純)，艾萬拓化工產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品；乙酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉，均為分析純，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；純化水為四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所自制。

1.1.3 試驗(yàn)用動物 SD大鼠(200 g±20 g)，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物中心產(chǎn)品(許可證號SYXK(川)2014-189)；新西蘭兔(1.8 kg±0.4 kg)，四川鼎鑫兔業(yè)有限公司產(chǎn)品；大恒肉雞(1.2 kg±0.2 kg)，四川大恒家禽有限公司產(chǎn)品；外三元豬(25.5 kg±5.8 kg)，四川省畜牧科學(xué)研究院試驗(yàn)豬場產(chǎn)品；以上試驗(yàn)用動物均為雄性。大鼠采用毛細(xì)管眼眥取血，家兔采集心血，肉雞翅下靜脈采血，豬前腔靜脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于4℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配制 精密稱取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，于10 mL容量瓶中，加PBS至刻度，超聲20 min溶解，得500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，依次稀釋成100 μg/mL和20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，4℃冷藏備用。

1.2.2.2 冰片溶液配制 精密稱取冰片250 mg，于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min溶解，得5 mg/mL冰片溶液，依次稀釋成1 mg/mL和0.2 mg/mL冰片儲備液，4℃冷藏備用備用。

1.2.2.3 磷酸緩沖溶液(PBS)的配制 稱取十二水磷酸氫二鈉19.028 g，磷酸二氫鈉2.08 g，氯化鈉4.4 g，加水至1 000 mL，即得pH 7.4 的等滲PBS溶液。

1.2.3 專屬性考察 取400 μL空白動物血漿置于超濾管中，37℃孵育2 h，12 000 r/min離心20 min，得空白血漿超濾液。分別對氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿超濾液、空白血漿超濾液+氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣20 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取濃度為100 μg/mL氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，PBS緩沖液梯度稀釋為質(zhì)量濃度分別為100、20、5、1、0.1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，均進(jìn)樣20 μL，以峰面積(A)對標(biāo)準(zhǔn)品濃度(C，μg/mL) 進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度和回收率考察 考察取PBS配制50、10、1 μg/mL 的高、中、低3種濃度的氟苯尼考對照品溶液，1 d內(nèi)分別測定5次，連續(xù)測定5 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。

另取PBS配制濃度為50、10、1 μg/mL 3 個濃度的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品溶液各400 μL置于超濾管，37℃孵育2 h，12 000 r/min離心20 min，取超濾液20 μL進(jìn)樣測定，與對照品溶液峰面積對比計(jì)算回收率。

CT增強(qiáng)掃描：醫(yī)護(hù)人員在CT檢查前應(yīng)叮囑患者身上不得放置金銀首飾，處于空腹?fàn)顟B(tài)，并指導(dǎo)患者做好呼吸運(yùn)動訓(xùn)練，以維持良好的呼吸頻率與深度，需要注意的是，應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行碘過敏試驗(yàn)。之后借助CT掃描機(jī)進(jìn)行動態(tài)增強(qiáng)掃描，向肘靜脈內(nèi)注入碘帕醇注射液，注入速度控制在3.0mL/s，注入劑量控制在65mL，注射對比劑后掃描時間選擇為：20s、80s、140s、200s、260s，掃描范圍主要包括腫塊及其周圍5mm范圍內(nèi)，同時統(tǒng)計(jì)計(jì)算灌注參數(shù)，主要包括血流量、血容量、通過時間以及表面滲透性。

1.2.6 血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)

1.2.6.1 氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率測定 精密吸取50 μL濃度為500、100 、20 μg/mL的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品溶液加至950 μL血漿的潔凈離心管中，配制成濃度為25、5、1 μg/mL的血漿待測樣本，渦旋15 s，37℃孵育2 h，分別取400 μL血漿待測樣本于超濾管中，12 000 r/min離心20 min，取超濾液20 μL進(jìn)樣檢測。每種濃度平行5份。

1.2.6.2 冰片濃度對氟苯尼考溶液血漿蛋白結(jié)合率影響 精密吸取5 μL濃度為5、1、0.2 mg/mL冰片溶液，加至945 μL血漿的潔凈離心管中，渦旋15 s，再加入50 μL濃度為100 μg/mL的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品溶液，渦旋15 s，37℃孵育2 h，配制成含每毫升分別含25、5、1 μg冰片并含5 μg氟苯尼考的血漿待測樣本。分別取400 μL血漿待測樣本于超濾管中，12 000 r/min離心20 min，取超濾液20 μL進(jìn)樣檢測。每種濃度平行5份。

1.2.6.3 血漿蛋白結(jié)合率計(jì)算 參照文獻(xiàn)[11-12]進(jìn)行。

血漿蛋白結(jié)合率/%=(血漿中藥物總濃度Ct-游離藥物濃度Cf)/血漿中藥物總濃度Ct × 100，計(jì)算氟苯尼考的血漿蛋白結(jié)合率。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

在所采用的色譜條件下，氟苯尼考保留時間在16.7 min左右，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，具有較高的專屬性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明在0.1 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.961 8C-0.026 8(R2=0.999 9)。

2.3 精密度與回收率

根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各成分濃度，求得日內(nèi)精密度、日間精密度和回收率。結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合生物樣本分析的要求，超濾膜對不同濃度氟苯尼考平均吸附率小于3%，對氟苯尼考無特異性吸附，回收率良好(表1)。

表1 氟苯尼考精密度和回收率結(jié)果

2.4 氟苯尼考血漿蛋白的結(jié)合率

高、中、低3種濃度氟苯尼考血漿樣品(25、5、1 μg/mL)與不同動物血漿蛋白結(jié)合率測定結(jié)果見表2。從表2可見，氟苯尼考血漿蛋白平均結(jié)合率從高到低依次為大鼠32.60%、豬30.55%、BSA25.28%、家兔19.80%、肉雞20.78%，且種屬之間差異顯著(P<0.05)。5 μg/mL氟苯尼考濃度條件下加入不同濃度(25、5、1 μg/mL)冰片溶液后，氟苯尼考血漿蛋白平均結(jié)合率分別為大鼠31.53%、豬31.18%、BSA 25.30%、家兔17.68%、肉雞19.32%，與單獨(dú)使用氟苯尼考無明顯變化(P>0.05)(表3)。

表2 不同濃度氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同寫字母表示差異顯著(P<0.05))。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表3 冰片對氟苯尼考血漿結(jié)合率影響

3 討論

研究藥物血漿結(jié)合率的方法有超濾法、平衡透析法、超速離心法、凝膠過濾法等，其中較常用的為平衡透析法與超濾法，但前者耗時較長，可能引起藥物代謝降解，對藥物蛋白結(jié)合率的測定造成較大誤差[13-14]。超濾法因設(shè)備簡單，操作簡便、耗時短、血漿樣本需求量少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物血漿蛋白結(jié)合率測定試驗(yàn)[15-19]。本試驗(yàn)選擇超濾法，考察了藥物模擬動物機(jī)體體溫37℃的孵育時間，發(fā)現(xiàn)氟苯尼考在溫孵2 h 時，與蛋白達(dá)到結(jié)合平衡狀態(tài)。同時，還研究了超濾離心的轉(zhuǎn)速和時間，根據(jù)不漏蛋白，而且超濾液體積與超濾前總體積之比為0.3～0.6為宜的標(biāo)準(zhǔn)[11]，最終確定離心時間為20 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min。因選擇甲醇作為冰片溶劑，本試驗(yàn)考察了不同體積甲醇對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20 μL以上體積的甲醇加入到950 μL體積血漿中，氟苯尼考蛋白結(jié)合率下降18.5%～22.7%，為避免甲醇的干擾，各冰片組添加量最終確定為5 μL(血漿中甲醇體積比約占5‰)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20-26]，無論口服還是注射途徑給藥，氟苯尼考推薦劑量一般為10 mg/kg～30 mg/kg體重，動物體內(nèi)血藥濃度峰值在2 μg/mL～25 μg/mL。本試驗(yàn)選擇25、5、1 μg/mL 3個氟苯尼考濃度符合臨床用藥實(shí)際。

目前，尚無氟苯尼考與大鼠血漿蛋白結(jié)合率的公開報(bào)道。本試驗(yàn)顯示，氟苯尼考與大鼠血漿蛋白和豬血漿蛋白結(jié)合率平均值分別為32.60%和30.55%，高于BSA(25.26%)、兔(19.80%)、雞(20.78%)(P<0.05)。試驗(yàn)中氟苯尼考BSA結(jié)合率為25.26%，與Bretzlaff K N等[23]報(bào)道一致，Bretzlaff K N等采用平衡透析法和超濾法分別測定50 μg/mL和5 μg/mL濃度條件下氟苯尼考和牛血漿蛋白結(jié)合率，得出平衡透析法為19%和18%，超濾法為19%和23%，二者差異不顯著。本試驗(yàn)測定的氟苯尼考雞血漿蛋白結(jié)合率為20.78%，與Afifi N A等報(bào)道[22]的氟苯尼考雞血漿蛋白結(jié)合率為18.5%接近。而新西蘭兔血漿蛋白結(jié)合率為19.80%比Abd ElAty A M等報(bào)道[24]的氟苯尼考兔血漿蛋白結(jié)合率為11.65%略高，應(yīng)與選擇的試驗(yàn)方法和動物具體品種有一定關(guān)系。同一動物不同亞種或不同品系血漿蛋白構(gòu)成和含量是否影響藥物結(jié)合率值得進(jìn)一步研究探索。

本試驗(yàn)建立了超濾法結(jié)合超高效液相色譜法測定氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率的方法，試驗(yàn)中未觀測到冰片對氟苯尼考血漿蛋白結(jié)合率有顯著影響，未來將進(jìn)一步考察冰片對氟苯尼考藥代動力學(xué)和組織分布變化情況。

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EffectsofBorneolonPlasmaProteinBindingRatesofFlorfenicol

LI Xu-ting,LI Si-cong,ZHOU Fang,YANG Rui，WANG Bin

(SichuanKeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreeding/SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu,Sichuan，610066,China)

To investigate the effect of borneol on the plasma protein binding rates (PPBR) of florfenicol,the ultrafiltration combined with UHPLC was employed to determine the PPBR of florfenicol with rat, rabbit, chicken, pig and bovine plasma. The PPBR of florfenicol with rat plasma at the concentrations of 25,5,1 μg/mL were(23.68%±1.25%，25.26%±1.42%,26.46%±1.48%)with BSA，(31.33%±1.82%,32.32%±1.46%，34.15%±1.59%) with rat plasma protein，(15.69% ±1.45%，19.31%±1.26%，24.38%±1.51%) with rabbit plasma protein，(21.68% ±1.37%，20.13%±1.84%，20.52%±1.77%) with chicken plasma protein, and (30.08%±1.03%，31.02%±1.28%，30.56%±1.55%) wiht pig plasma protein, respectively.The plasma protein binding rate of florfenicol was low in all species and no concentration dependence was evident.The results indicated that borneol did not influence the PPBR of florfenicol.

ultrafiltration;borneol;florfenicol;protein binding rate;UHPLC

2017-01-16

四川省財(cái)政運(yùn)行專項(xiàng)項(xiàng)目(SASA2014CZYX010)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(16ZC2945)

李旭廷(1977-)，男，四川簡陽人，副研究員，學(xué)士，主要從事中獸藥研究。

S859.7

:A

:1007-5038(2017)09-0014-05