孫記濤，阮長青，牛瑞，劉文靜，張雪路，李芳，張愛武，張東杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

大米制品中烏洛托品總含量的檢測

孫記濤，阮長青，牛瑞，劉文靜，張雪路，李芳，張愛武，張東杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

為利用HPLC波長程序法檢測大米制品中烏洛托品的總含量。以乙腈-乙酸銨溶液為流動相，經(jīng)C18反相色譜柱分離，設(shè)定波長程序?qū)崿F(xiàn)烏洛托品總含量的檢測。結(jié)果表明烏洛托品在0.00～200.00 μg·mL-1，甲醛-2，4-二硝基苯腙在0.00～20.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)；烏洛托品檢出限為0.016 mg·kg-1；定量限為0.053 mg·kg-1；甲醛-2，4-二硝基苯腙檢出限為0.026 mg·kg-1；定量限為0.087 mg·kg-1。樣品加標(biāo)回收率為84.84%～92.18%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.70%～3.48%。

高效液相色譜；波長程序法；烏洛托品；甲醛-2，4-二硝基苯腙；米制品

烏洛托品，學(xué)名六亞甲基四胺（C6H12N4），在酸性條件下，能分解出甲醛和氨，甲醛易與人體內(nèi)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的受體發(fā)生反應(yīng)，如與氨基化合物可以發(fā)生縮合，與巰基化合物加成，使蛋白質(zhì)變性。甲醛在人體內(nèi)還可還原為醇，故可表現(xiàn)出甲醇的毒理作用。對人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能及消化系統(tǒng)等均有損害[1]。衛(wèi)生部報(bào)道可能有些生產(chǎn)腐竹、米線的不法廠家違法使用烏洛托品以替代吊白塊會起到增白、保鮮、增加口感和防腐的效果[2]，嚴(yán)禁使用于食品中。

目前檢測烏洛托品的方法有很多，包括比色法[3]、電位滴定法[4]、電導(dǎo)滴定法[5]、分光光度法[6-7]、極譜法[8]、離子色譜法[9]、HPLC法[10-12]、GC法[13-16]、GC-MS法[17]和HPLC-MS法[18-23]。其中分光光度法具有儀器設(shè)備簡單，易于進(jìn)行的特點(diǎn)，但檢測的干擾較大，靈敏度較低；GC-MS法和HPLC-MS法除了具備準(zhǔn)確度高、線性好、檢測限低，檢測靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但儀器價(jià)格昂貴、檢測成本高。HPLC法具有準(zhǔn)確，線性好，回收率高的特點(diǎn)[24]，但靈敏度較前者低。目前HPLC法主要用于檢測烏洛托品片劑本身，在食品中研究烏洛托品的檢測方法較少。HPLC法在檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)中非常普遍，檢測方法應(yīng)用廣泛。由于烏洛托品的檢測存在樣品中的分解問題，目前建立的方法均檢測其殘留量或甲醛的含量，并未檢測其全部含量。針對以上問題建立了大米制品中烏洛托品總含量的檢測方法，采用高效液相色譜波長程序法，對大米制品中未轉(zhuǎn)化的烏洛托品和已轉(zhuǎn)化的烏洛托品進(jìn)行測定，已轉(zhuǎn)化為甲醛的烏洛托品是通過2，4-二硝基苯肼衍生為甲醛-2，4-二硝基苯腙獲得的。該法通過設(shè)定波長程序確保兩種物質(zhì)在最大吸收波長下進(jìn)行同時檢測，通過得到甲醛的含量來換算出已轉(zhuǎn)化烏洛托品的含量，最終得到烏洛托品總含量。

1 材料與方法

1.1 材料

米線、米粉和年糕，來源于大慶市場。

1.2 儀器與試劑

Lab Alliance PC-2025型高效液相色譜儀附205/2000型可編程紫外可見檢測器，（美國SSI/Lab Alliance公司），RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)W80型粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），PHS-3G型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠），752N型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），KQ-400KDE超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司），SHZ-C型水浴恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司），HH-8恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠），AR223CN型分析天平（美國奧豪斯儀器有限公司），TG16-WS臺式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），AL-01型溶劑過濾系統(tǒng)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），針式微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)系（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Synergy超純水系統(tǒng)（MERCK MILLIPORE公司）。

烏洛托品（純度≥99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司），甲醛-2，4-二硝基苯腙（純度≥99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司），甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純（美國天地公司），三乙胺、無水乙酸銨、磷酸、甲酸均為優(yōu)級純，2，4-二硝基苯肼、冰醋酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉為分析純，超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

將粉碎后的樣品混勻后，準(zhǔn)確稱取5.000 g于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈為提取溶劑，加入5 mL緩沖溶液（1 mol·L-1氫氧化鈉和冰醋酸調(diào)節(jié)至pH=4.5），然后再加入亞鐵氰化鉀溶液（106 μg·mL-1）和乙酸鋅溶液（220 μg·mL-1）各0.5 mL，用快速混勻器混勻，放于水浴振蕩器上振蕩后或放于超聲波清洗器中超聲提取30 min后，加入2，4-二硝基苯肼乙腈溶液（3.0 μg·mL-1）的衍生劑1 mL，混勻后60℃下衍生30 min，冷卻，以4 000 r·min-1的速度離心15 min，將上清液倒入另外一個離心管中，再加入10 mL乙腈，混勻離心，取上清液合并，將上清液離心后，用塞有脫脂棉的漏斗中加入適量的無水硫酸鈉過濾上清液于的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用流動相A定容至10 mL的容量瓶中，用0.22 μm的濾膜過濾，待上機(jī)測試。

1.3.2 測定條件

確定烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的最大吸收波長、色譜條件、優(yōu)化流動相。在這些條件下對兩種目標(biāo)物定性，根據(jù)保留時間和檢測波長確定波長程序。

1.3.2.1 檢測波長

使用紫外可見分光光度計(jì)對濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在200～550 nm的波長范圍下進(jìn)行掃描，通過最大響應(yīng)值確定其最大吸收波長。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS-C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈：20 mmol·L-1乙酸銨溶液=20∶80；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0.000～4.000 min（100%流動相A），4.000～12.000 min（50%流動相A+ 50%流動相B）；柱溫：25℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2.3 流動相選擇

選取流動相為甲醇：水=75∶25[10，25]、甲醇∶水∶三乙胺∶磷酸=60∶40∶0.25∶0.075[12]甲醇：乙腈：0.1%磷酸溶液=40∶25∶35[26]、乙腈和20 mmol·L-1乙酸銨溶液不同比例為流動相等度洗脫，根據(jù)目標(biāo)物的峰型與保留時間來確定合適的流動相。若等度洗脫效率低，則考慮梯度洗脫。

1.3.2.4 波長程序的設(shè)置

根據(jù)烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙已確定好的最大吸收波長，分別在210 nm和350 nm。分別對烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的單一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性分析，得到保留時間，順序依次為烏洛托品和甲醛-2，4二硝基苯腙，通過保留時間來設(shè)定相對應(yīng)的波長來進(jìn)行檢測，確保目標(biāo)物在最大吸收波長下有最大的響應(yīng)值。

1.3.3 烏洛托品總含量的確定及計(jì)算

1.3.3.1 烏洛托品優(yōu)化方法及計(jì)算方法

烏洛托品在酸性條件下，能分解出甲醛和氨，甲醛與2，4-二硝基苯肼在酸性條件下生成甲醛-2，4-二硝基苯腙。加入100 μL烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）的具塞離心管中，加入的緩沖溶液調(diào)節(jié)pH和2，4-二硝基苯肼乙腈溶液（3.0 μg·mL-1）1 mL，加入乙腈至10 mL，60℃加熱30 min，直接進(jìn)行HPLC分析。通過計(jì)算烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙色譜峰的峰面積，來確定部分烏洛托品轉(zhuǎn)化為甲醛的含量。直接測定得到的烏洛托品含量和轉(zhuǎn)化為甲醛的部分烏洛托品含量的總和即為烏洛托品的總含量。

1.3.3.2 衍生的過程中的時間，溫度及pH

采用某一條件為變量，固定其他條件進(jìn)行試驗(yàn)。如固定（60℃水浴，衍生劑用量為1.0 mL，pH=4.8），進(jìn)行了10、20、30、40、50 min的衍生反應(yīng)時間的試驗(yàn)。如固定（反應(yīng)時間為30 min，衍生劑用量為1.0 mL，pH=4.8），進(jìn)行了30、40、50、60、70℃的衍生反應(yīng)溫度的試驗(yàn)。如固定（60℃水浴，反應(yīng)時間為30 min，衍生劑用量為1.0 mL），進(jìn)行了pH=2.50、3.50、4.50、5.50、6.50的衍生反應(yīng)試驗(yàn)，按照1.3.3.1的衍生方法進(jìn)行了試驗(yàn)，根據(jù)甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積變化程度來確定合適的反應(yīng)條件。

1.3.3.3 烏洛托品總含量的計(jì)算

試驗(yàn)采用外標(biāo)法通過濃度和峰面積成正比的關(guān)系得到曲線方程，樣品經(jīng)進(jìn)樣得到峰面積通過曲線方程得到濃度，再利用濃度得到質(zhì)量濃度，乘以稀釋倍數(shù)得到含量。烏洛托品的總含量按公式（1）計(jì)算；轉(zhuǎn)化為甲醛的烏洛托品含量按公式（2）計(jì)算。

m1—烏洛托品的總含量；m2—未轉(zhuǎn)化的烏洛托品的量；m3—轉(zhuǎn)化為甲醛的烏洛托品的含量；m4—甲醛-2，4-二硝基苯腙的量；F為甲醛與甲醛-2，4-二硝基苯腙的換算因子；k為甲醛轉(zhuǎn)化為烏洛托品的系數(shù)為1/6。

1.3.3.4 甲醛含量與甲醛-2，4-二硝基苯腙含量的比值F因子的確定

利用已知濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品配制儲備液，分別取100 μg·ml-1的甲醛儲備液0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mL（相當(dāng)于0、1、2、4、8、10 μg甲醛）于10 mL具塞比色管中，加入5 mL緩沖溶液，用乙腈定容至刻度。經(jīng)60℃水浴衍生化30 min處理后取20 μL進(jìn)樣。根據(jù)保留時間定性，峰面積定量，每個濃度重復(fù)做兩次，取平均值，得到甲醛衍生后甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積A1；配制相同濃度的甲醛-2，4-二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同樣得到峰面積A2。因此可以按公式（3）計(jì)算得到F因子：

1.4 方法評價(jià)

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，檢出限、定量限、精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，對確定的好的樣品前處理方法和測定條件進(jìn)行方法驗(yàn)證[27]。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙用流動相A溶液配制濃度1 000 μg·mL-1的儲備液，利用流動相A將儲備稀釋為濃度為0.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00、200.00 μg·mL-1的烏洛托品和0.00、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00 μg·mL-1甲醛-2，4-二硝基苯腙的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，進(jìn)樣，采用外標(biāo)法通過峰面積和標(biāo)樣的濃度的線性關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品進(jìn)樣后的峰面積與曲線比較定量，得到樣品中目標(biāo)物含量。

1.4.2 檢出限與定量限

通過對陰性樣品中逐級降低加標(biāo)含量來確定檢出限和定量限，以信噪比S/N=3對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以信噪比S/N=10對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量限，得到烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的檢出限和定量限。

1.4.3 精密度

同一操作者使用相同儀器設(shè)備、前處理方法和測定條件，在短時間內(nèi)對相同的樣品進(jìn)行重復(fù)6次的加標(biāo)回收率試驗(yàn)。以米線為樣品，加標(biāo)量為80.00 mg·kg-1，得到日內(nèi)精密度。對100 μg·mL-1烏洛托品和10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品不同日期進(jìn)行重復(fù)6次的測定，得到峰面積和保留時間的日間精密度。

1.4.4 準(zhǔn)確度

對樣品加入烏洛托品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使加標(biāo)含量為10.00、40.00 mg·kg-1和80.00 mg·kg-1三個濃度進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個樣品進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，回收率驗(yàn)證方法的可行性。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行偏差分析和圖表的制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 超聲提取與振蕩提取的對比

在室溫和不同萃取時間下，以乙腈為提取溶劑，對米線進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，加標(biāo)量為40.00 mg·kg-1，對振蕩提取和超聲提取進(jìn)行了比較。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 兩種提取方式的回收率（n=6）Table 1The recoveries of two kinds of extraction method（n=6）

由表1可知，使用具塞離心管選擇超聲提取方式時，當(dāng)30 min時回收率最高，提取效果最好，選擇振蕩提取方式時，當(dāng)提取40 min是回收率最高，提取較好，超聲提取的效果均好于振蕩提取。因此試驗(yàn)選擇超聲提取，提取時間為30 min。

2.1.2 衍生的過程中的時間，溫度及pH的選擇

2.1.2.1 衍生時間的選擇

選擇60℃水浴，衍生劑用量為1.0 mL，pH=4.8為衍生條件，按照1.3.3.1的衍生方法進(jìn)行了10、20、30、40、50 min的衍生反應(yīng)時間的試驗(yàn)，根據(jù)甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積變化程度來確定合適的衍生時間。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 衍生時間和峰面積的關(guān)系Fig.1The relationship between derivative time and peak area

由圖1可知，隨著衍生時間的增加，衍生物甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積逐漸增加至30 min后趨于平穩(wěn)，表明衍生反應(yīng)充分。因此選擇衍生時間為30 min。

2.1.2.2 衍生溫度的選擇

選擇衍生反應(yīng)時間為30 min，衍生劑用量為1.0 mL，pH=4.8為衍生條件，按照1.3.3.1的衍生方法進(jìn)行了30、40、50、60、70℃的衍生溫度的試驗(yàn)，根據(jù)甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積變化程度來確定合適的衍生溫度。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著衍生溫度的增加，衍生物甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積逐漸增加至60℃后趨于平穩(wěn)，表明衍生反應(yīng)充分。因此選擇衍生溫度為60℃。

圖2 衍生溫度和峰面積的關(guān)系Fig.2The relationship between derivative temperature and peak area

2.1.2.3 衍生過程中pH的選擇

選擇60℃水浴，反應(yīng)時間為30 min，衍生劑用量為1.0 mL為衍生條件，使用1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液和冰醋酸進(jìn)行調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH，在2.50、3.50、4.50、5.50、6.50的pH下按照1.3.3.1的衍生方法進(jìn)行反應(yīng)試驗(yàn)，根據(jù)甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積變化程度來確定衍生過程中的pH。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 衍生過程中pH和峰面積的關(guān)系Fig.3The relationship between pH and peak area in the process of derivatives

由圖3可知，隨著衍生過程中pH的增大，衍生物甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面積逐漸增加后又逐漸減少，當(dāng)pH=4.50時衍生物的峰面積最大，表明衍生反應(yīng)效果最好。

2.2 測定條件的確定

2.2.1 檢測波長

根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)定烏洛托品的檢測波長為210 nm[10，12，25]。對甲醛-2，4-二硝基苯腙使用紫外可見分光光度計(jì)在適當(dāng)波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到其最大吸收波長。

圖4 甲醛-2，4-二硝基苯腙的波長與吸光度的關(guān)系Fig.4The relationship between wavelength and absorbance of formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone

由圖4可知，甲醛-2，4-二硝基苯腙的最大吸收波長為350 nm。在對應(yīng)的波長下有最大響應(yīng)值，干擾物響應(yīng)值小[28]。

2.2.2 流動相的選擇

選取流動相為甲醇：水=75∶25、甲醇∶水∶三乙胺∶磷酸=60∶40∶0.25∶0.075甲醇：乙腈：0.1%磷酸溶液= 40∶25∶35、乙腈：20 mmol·L-1乙酸銨溶液不同比例進(jìn)行等度洗脫。選擇烏洛托品（100 μg·mL-1）和甲醛-2，4-二硝基苯腙（10 μg·mL-1）混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣各流動相的色譜圖如圖5至8所示。

圖5 流動相為甲醇：水=75∶25時標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.5The standard chromatogram of mobile phase methanol∶water=75∶25

圖6 流動相為甲醇∶水∶三乙胺∶磷酸=60∶40∶0.25∶0.075時標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.6The standard chromatogram of mobile phase methanol∶water∶triethylamine∶phosphoric acid=60∶40∶0.25∶0.075

圖7 流動相為甲醇∶乙腈∶1%磷酸銨=40∶25∶35時標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.7The standard chromatogram of mobile phase imethanol∶acetonitrile∶1%ammonium phosphate=40∶25∶35

圖8 流動相為乙腈：20 mmol·L-1乙酸銨=20：80時標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.8The standard chromatogram of mobile phase acetonitrile：ammonium acetate of 20 mmol·L-1

由圖5至圖7可知，混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣后烏洛托品的峰型不好，由于甲醇在做流動相時210 nm處有吸收，對烏洛托品有干擾，因此有機(jī)相選擇乙腈。由圖8可知，烏洛托品在流動相乙腈∶20 mmol·L-1乙酸銨溶液=20∶80峰型較好，經(jīng)過試驗(yàn)得出甲醛-2，4-二硝基苯腙在流動相乙腈∶20 mmol·L-1乙酸銨溶液= 20∶80保留時間延后至44.521 min。甲醛-2，4-二硝基苯腙在乙腈∶20 mmol·L-1乙酸銨溶液=60∶40的保留時間可以提前至9.445 min可以有效節(jié)省檢測時間。因此采用梯度洗脫程序流動相A：乙腈∶20 mmol·L-1乙酸銨溶液=20∶80；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0.000～4.000 min（100%流動相A），4.000～12.000 min（50%流動相A+50%流動相B），可以縮短保留時間和改善峰型。

2.2.3 波長程序的設(shè)置

根據(jù)烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙已確定好的最大吸收波長，分別在210 nm和350 nm。分別對烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的單一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性分析，得到保留時間，順序依次為烏洛托品t=2.663 min和甲醛-2，4-二硝基苯腙t=9.485 min，通過保留時間來設(shè)定相對應(yīng)的波長來進(jìn)行檢測，確保目標(biāo)物在最大吸收波長下有最大的響應(yīng)值。波長程序?yàn)?.000～4.000 min（烏洛托品，210 nm），4.000～12.000 min（甲醛-2，4-二硝基苯腙，350 nm）。

2.2.4 甲醛含量與甲醛-2，4-二硝基苯腙含量的比值F的確定

烏洛托品轉(zhuǎn)化為甲醛后，甲醛與2，4-二硝基苯肼衍生為甲醛-2，4-二硝基苯腙，要明確甲醛衍生的量，按照公式（3-4）計(jì)算確定二者的轉(zhuǎn)化比值F。試驗(yàn)結(jié)果見表2所示。確定F的平均值為0.133 8[29]。

表2 甲醛衍生后峰面積與甲醛-2，4-二硝基苯腙峰面積的比值FTable 2The ratio F of formaldehyde derivative peak area to formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone peak area

2.3 方法評價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限試驗(yàn)結(jié)果見表3，烏洛托品在0～200.00 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，甲醛-2，4-二硝基苯腙在0～20.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 8；烏洛托品檢出限為0.016 mg·kg-1；定量限為0.053 mg·kg-1；甲醛-2，4-二硝基苯腙檢出限為0.026 mg·kg-1；定量限為0.087 mg·kg-1。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限Table 3The standard curve，detection limit and quantitation limit

2.3.2 精密度

試驗(yàn)對方法和儀器進(jìn)行了精密度評價(jià)，日內(nèi)精密度測定結(jié)果如表4所示，圖9為米線加標(biāo)量為80.00 mg·kg-1的色譜圖。儀器精密度如表5所示。圖10為100 μg·mL-1烏洛托品和10 μg·mL-1甲醛-2，4-二硝基苯腙的混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

由表4可知，同一操作者使用相同的儀器和相同的前處理方法，連續(xù)測定6次，得到的方法精密度，RSD為2.47%，方法重現(xiàn)性良好。

由表5可知，對100 μg·mL-1烏洛托品和10 μg·mL-1甲醛-2，4-二硝基苯腙的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)6次的測定，得到峰面積的RSD范圍在1.15%～1.72%之間和保留時間的RSD范圍在0.81%～1.16%之間，重現(xiàn)性良好，儀器穩(wěn)定，可行性得到驗(yàn)證。

2.3.3 準(zhǔn)確度

所選的米線、米粉、年糕樣品均未檢出烏洛托品及甲醛，因此空白值可以不計(jì)。對一個樣品同時加入烏洛托品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使三個濃度進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個樣品進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果如下表6所示。

圖9 米線加標(biāo)量為80 mg·kg-1的色譜圖Fig.9The chromatograms of rice noodle with 80 mg·kg-1added standard amount

圖10 烏洛托品（100 μg·mL-1）和甲醛-2，4-二硝基苯腙（10 μg·mL-1）混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.10The mixed standard chromatogram of methenamine（100 μg·mL-1）and formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone（10 μg·mL-1）

表4 樣品連續(xù)測定結(jié)果Table 4The results of continuous determination of the sample

表5 混合標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和保留時間的精密度（n=6）Table 5RSD of Peak area and retention time of mixed standard（n=6）

表6 樣品加標(biāo)回收率測定結(jié)果（n=6）Table 6The recovery rate of standard addition in sample（n=6）

由表6可知，樣品平均回收率在84.84%～92.18%之間，RSD范圍在1.70%～3.48%之間，回收率試驗(yàn)結(jié)果滿足有機(jī)殘留物和污染物關(guān)于加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求[30]。

3 結(jié)論

建立了大米制品中烏洛托品總含量的檢測方法，采用高效液相色譜法，通過設(shè)置波長程序同時檢測未轉(zhuǎn)化的烏洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙（甲醛衍生物）實(shí)現(xiàn)同時檢測得到烏洛托品總含量。方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度均滿足檢測需要。采用的高效液相色譜儀在實(shí)驗(yàn)室較普遍適用范圍廣、儀器成本較低、縮短檢測時間，提高檢測效率，減少日常分析中儀器的損耗并節(jié)約試驗(yàn)試劑等經(jīng)濟(jì)性特點(diǎn)，對大米制品及其他食品中烏洛托品的測定有參考價(jià)值。

［1］李紅霞，黃厚今.甲醛的毒性研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)，2006（2）：41-42.

［2］張斌.甲醛與食品安全［J］.口岸衛(wèi)生控制，2008（2）：71-72.

［3］Betram W Grlfflths，James E Logan.Determination of methenamine and menthenamine mandelate by nesslerization following dilute acid hydrolysis［J］.Anal Chem，1959（31）：1882-1884.

［4］Charles A Gaglia，Jr.Leo A Gosser，Lester Chafetz.Methenamine mandelate assay procedures based on a 2∶1 silver nitratemethenamine complex［J］.Anal Chem，1972（44）：1690-1692.

［5］Nikoli＇c K I，R，Conductometric determination of methenamine［J］.Pharm Week Sci Edi，1983（5）：28-30.

［6］辛志偉，臧志和，趙小玉，等.分光光度法測定烏洛托品的含量研究［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2001，14（6）：569.

［7］唐紅霞，趙路漫，許旭，等.分光光度法檢測腐竹中烏洛托品［J］.糧油食品科技，2014，22（5）：62-65.

［8］魏小平.一種檢測微量烏洛托品的新方法［J］.桂林工學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25（4）：556-558.

［9］張社利，許文靜，范云場.離子色譜法檢測腐竹、粉絲中的烏洛托品［J］.應(yīng)用化學(xué)，2014，31（4）：1352-1355.

［10］步雪，張作華，周錦勇.反相HPLC法測定烏洛托品合劑含量［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，1996，14（1）：49-50.

［11］John T Pinto，Jeremy M Van Raamsdonk，Blair R Leavitt，et al.Treatment of YAC128 mice and their wild-type litter-mates with cystamine dose not lead to its accumulation in plasma or brain：implications for the treatment of Huntington disease［J］.J.Neurochem，2005（94）：1087-1101.

［12］李莉，張鋼平.高效液相色譜法測定烏洛托品片的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009（29）：335-336.

［13］李薇，陳天科，徐暉，等.烏洛托品的氣相色譜分析［J］.分析儀器，2007（3）：29-31.

［14］黃春國.氣相色譜法測定腐竹中烏洛托品含量的研究［J］.廣西輕工業(yè)，2008（6）：26-27.

［15］王帥，王煥鋒，許君亭，等.氣相色譜法測定烏洛托品含量的研究［J］.貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，32（2）：107-109.

［16］吳曉燕，宋合興，趙娜，等.氣相色譜-FID技術(shù)測定化妝品中的烏洛托品［J］.河北工業(yè)科技，2014，31（2）：116-119.

［17］徐小民，黃百芬，任一平.豆制品和粉干中烏洛托品的氣質(zhì)聯(lián)用測定［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2013，4（3）：873-876.

［18］SN/T 2226-2008.進(jìn)出口動物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［19］張愛芝，張書芬，王全林，等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定腐竹、米線、年糕中的烏洛托品［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2013，4（2）：472-478.

［20］盧曉蕊，陶柏秋，許海東，等.超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的烏洛托品［J］.糧油加工，2014（11）：71-74.

［21］冼燕萍，陳立偉，羅東輝，等.UPLC-MS/MS測定腐竹和米粉中的烏洛托品［J］.江南大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，11（1）：78-82.

［22］周秀云，趙勇，俞婧.SPE-UPLC-MS/MS快速測定豆制品中的烏洛托品［J］.河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，30（1）：64-68.

［23］楊芳，董劉敏，蘇晶.HPLC-MS/MS測定豆制品、米線、年糕中的烏洛托品［J］.商品與質(zhì)量·學(xué)術(shù)觀察，2014（11）：242-246.

［24］賈鵬禹，李朝陽，曹龍奎，等.高效液相色譜法測定小米中黃色素的含量［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（5）：111-115.

［25］溫韜，徐強(qiáng)，張少梅，等.高效液相色譜法測定腐竹中的烏洛托品［J］.洛陽理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，23（3）：1-4.

［26］海川，何勝利.高效液相色譜法測定馬尿酸烏洛托品片的有關(guān)物質(zhì)［J］.藥品鑒定，2013，3（18）：118-120.

［27］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.附錄XIX A.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：194-195.

［28］高智席，江忠遠(yuǎn)，王柏人，等.水果和蔬菜中嘧菌酯的固相萃取-反相高效液相色譜測定法［J］.環(huán)境與健康雜志，2011，28（8）：719-720.

［29］吳新華，朱瑞芝，陸舍銘，等.高效液相色譜法測定香精中甲醛的含量［J］.化學(xué)試劑，2010，32（9）：817-818.

［30］張寒琦.儀器分析［M］.2版.北京：高等教育出版社，2013.

Detection of the Total Amount of Methenamine in Rice Products

Sun Jitao，Ruan Changqing，Niu Rui，Liu Wenjing，Zhang Xuelu，Li Fang，Zhang Aiwu，Zhang Dongjie
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The detection of the total content of methenamine in rice products was established by using HPLC wavelength program method.Sample solutions were extracted under ultrasonic condition with acetonitrile，and centrifuged，the supernatant was concentrated by rotary evaporator.The aqueous solution of acetonitrile-ammonium acetate was added to the mobile phase and carried on C18 column，then the programmed wavelength ultraviolet detection was performed to determine the total content of methenamine. The results showed that the concentration range was 0.00-200.00 μg·mL-1and 0.00-20.00 μg·mL-1for methenamine and formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone，respectively.The detection limit of methenamine was 0.016 mg·kg-1，the quantitation limit was 0.053 mg·kg-1.The detection limit of formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone was 0.026 mg·kg-1，the quantitation limit was 0.087 mg·kg-1.The recoveries range of sample added standards was 84.84%-92.18%with RSD of 1.70%-3.48%.

HPLC；wavelength program method；methenamine；Formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone；rice products

TS207.3

A

1002-2090（2017）04-0054-08

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.013

2016-04-20

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJS（X2015-Y51）；黑龍江省高?！稗r(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2014TD006）。

孫記濤（1987-），男，助理工程師，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事食品營養(yǎng)與安全方面的研究。

阮長青，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：cqruan@163.com。