高遠(yuǎn)，仇建華，常巧呈，高俊峰，王春仁

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

鼻狀杯環(huán)線蟲形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定

高遠(yuǎn)，仇建華，常巧呈，高俊峰，王春仁

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

為了確定收集于馬體內(nèi)某種寄生蟲的種類，采用形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對大慶地區(qū)自然感染馬體內(nèi)的寄生蟲進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定為鼻狀杯環(huán)線蟲。采用PCR方法對其核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，雌、雄兩個蟲體的ITS序列長度均為842 bp，其中ITS1、5.8S和ITS2長度分別為370 bp、152 bp和320 bp。雌蟲、雄蟲ITS序列與GenBank上已發(fā)表的鼻狀杯環(huán)線蟲的ITS序列的同源性分別為99.8%和99.6%。據(jù)此，鑒定該蟲為鼻狀杯環(huán)線蟲。

鼻狀杯環(huán)線蟲；形態(tài)學(xué)觀察；分子生物學(xué)鑒定；ITS序列

鼻狀杯環(huán)線蟲（Cylicocyclusnassatus）隸屬于圓線科（Strongylidae），盅口亞科（Cyathostominae），是馬屬動物體內(nèi)常見且重要的病原之一，寄生在宿主大腸內(nèi)。據(jù)文獻(xiàn)記載該蟲體分布于歐洲、埃及、加拿大、美國、巴西等國，而我國的北京、江西、廣西、黑龍江等地也有報(bào)道[1-2]。該種線蟲往往與多種盅口亞科線蟲同時(shí)寄生，造成馬匹消瘦、貧血、腹瀉、腸絞痛，幼蟲時(shí)期還會引起宿主“幼蟲性盅口線蟲病”，致死率可高達(dá)50%[3]。

寄生蟲的鑒定是寄生蟲研究工作的前提。準(zhǔn)確的鑒定對于病原特性研究、流行病學(xué)調(diào)查、疾病防控等尤為重要。寄生蟲傳統(tǒng)的鑒定方法主要是形態(tài)學(xué)觀察，這對工作人員的要求較高，而且對于形態(tài)上相似的寄生蟲或某些具有隱藏種的蟲種來說往往更具有局限性，如區(qū)別鼻狀杯環(huán)線蟲和阿氏杯環(huán)線蟲以及Hypodontusmacropi的隱藏種。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，為寄生蟲蟲種的分子鑒定提供可靠的基因標(biāo)記和方法。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）因具有選擇壓力較小、進(jìn)化速度快、長度不大、種內(nèi)差異微小、種間差異較大等特點(diǎn)而被認(rèn)為是一種有效的分子標(biāo)記，廣泛的應(yīng)用于寄生蟲的分類鑒定[4-8]。因此研究采取形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對采自馬體內(nèi)的某種線蟲進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 蟲體的來源

蟲體采集自大慶地區(qū)自然感染的馬大腸內(nèi)，保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

將新鮮蟲體置于載玻片上，滴加50%甘油乳酸液，在顯微鏡下先用低倍鏡調(diào)整位置后再用高倍鏡觀察蟲體的具體形態(tài)特征。選取具有代表性的位置進(jìn)行拍照，參考相關(guān)文獻(xiàn)鑒定蟲體[1-2]。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 DNA的提取取已初步鑒定的雌、雄蟲體各一條用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次后，根據(jù)TIANamp Genomic DNA Kit（TIANGEN）說明書提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS序列擴(kuò)增由上海生工生物工程股份有限公司合成的通用引物，序列如下：上游-NC5（5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’）和下游-NC2（5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’）。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，具體如下：2.5 μL Ex Taq Buffer（pH8.5），2 μLdNTP mixture（2.5 mM），上、下游引物各0.5 μL（10 pmol·mL-1），1 μL DNA模板和0.2 μL Ex Taq DNA酶（5 U·mL-1）。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。將所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，將目的條帶切下，根據(jù)DNA凝膠回收試劑盒的說明書回收后，用PMD-18T載體連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，將得到的陽性結(jié)果送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3.3 序列分析將所得測序結(jié)果用DNAstar 5.0，MEGA 5.0等軟件進(jìn)行分析，劃界。最后與NCBI上已發(fā)表的馬相關(guān)線蟲的ITS序列進(jìn)行比對，用Megalign軟件進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 線蟲的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

顯微鏡下可觀察到蟲體口領(lǐng)顯著，背腹面觀察可見口囊呈矩形，側(cè)面觀察口囊靠攏呈X狀。偏中乳突長，伸出于口領(lǐng)之外，有背溝，約為口囊深度一半。外葉冠明顯，約20葉，內(nèi)葉冠未能清楚觀察到。頸乳突分兩側(cè)分布，位于食道約三分之一處，與排泄孔位置相似。

雌蟲長10.1 mm，口囊長0.150 mm，寬0.038 mm，食道長0.68 mm，尾部長0.13 mm，陰門與肛門的距離為0.147 mm，雌蟲尾部稍向背部彎曲（圖1）。

圖1 雌蟲形態(tài)特征Fig.1Female morphological characteristics

雄蟲長7.1 mm，口囊長0.105 mm，寬0.021 mm。食道長0.57 mm，雄蟲交合傘背葉寬，長度中等，2個腹肋并列，3個側(cè)肋分開，外背肋從背肋基部發(fā)出，背肋分為兩個分支，每個分支有分為3個小的分支，在第三分支中又出現(xiàn)細(xì)小的分支（圖2）。

圖2 雄蟲形態(tài)特征Fig.2Male morphological characteristics

依據(jù)以上形態(tài)特征，參照相關(guān)文獻(xiàn)初步認(rèn)定該種蟲體為鼻狀杯環(huán)線蟲。

2.2 蟲體的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

研究中獲得的線蟲雌蟲的ITS（包含5.8S）全長為842 bp，其中ITS1長度為370 bp，A+T含量為52.70%。ITS2長度為320 bp，A+T含量為59.38%。5.8S全長為152 bp。與NCBI上已發(fā)表多種線蟲的ITS序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與鼻狀杯環(huán)線蟲（序列號：JQ906420.1）相比，只有ITS2的長度比其少一個堿基。兩者的同源性為99.8%。其中兩者的ITS1和5.8S完全相同，同源性為100%。ITS2序列的同源性為99.4%，有兩處堿基發(fā)生了變化，一處為296 bp的位置發(fā)生A-G堿基的轉(zhuǎn)換，另一處為在310 bp的位置發(fā)生T堿基的缺失。

雄蟲的ITS1，ITS2，5.8S的長度和A+T含量與雌蟲基本相同，但I(xiàn)TS2的A+T含量略低于雌蟲，為59.06%。與NCBI上發(fā)表的鼻狀杯環(huán)線蟲ITS序列同源性為99.6%。ITS2的同源性為99.1%，有三處堿基發(fā)生了變化，即289 bp的位置T-C堿基的轉(zhuǎn)換，296 bp的位置A-G堿基的轉(zhuǎn)化，310 bp的位置同樣發(fā)生了T堿基的缺失。與研究中的雌蟲相比，ITS全長的同源性為99.9%，ITS2的同源性為99.7%，只有一處堿基發(fā)生了變化即T-C堿基的轉(zhuǎn)換。

基于以上的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的結(jié)果鑒定該種線蟲為鼻狀杯環(huán)線蟲。

3 討論

ITS序列存在于高度重復(fù)的核糖體中，因進(jìn)化速度較快，長度不大，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，因而被作為是種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標(biāo)記。Hung等[5]通過比較微小杯冠線蟲的ITS種內(nèi)差異，分析得出微小杯冠線蟲是至少包括兩個種的隱藏種。任娣等[6]對斑鼻羚體內(nèi)分離出的毛首線蟲進(jìn)行ITS序列的擴(kuò)增，分析發(fā)現(xiàn)其屬于羊毛首線蟲。

傳統(tǒng)的馬的盅口亞科線蟲鑒定主要是依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，如蟲體的葉冠數(shù)量與大小，口囊形狀，雌蟲、雄蟲尾部特征等。盅口亞科線蟲種類多且形態(tài)相似，即使是對有經(jīng)驗(yàn)的研究人員來說形態(tài)學(xué)鑒定也較難，因此借助分子生物學(xué)手段鑒定是十分必要的。例如：阿氏杯環(huán)線蟲曾被認(rèn)為是鼻狀杯環(huán)線蟲的同物異名，但最終阿氏杯環(huán)線蟲被Lichtenfels等人[7]確定為一種有效的物種。此后，Hung等[8]通過比較阿氏杯環(huán)線蟲、鼻狀杯環(huán)線蟲和隱匿杯環(huán)線蟲的ITS的差異，從分子層面證明了阿氏杯環(huán)線蟲是不同于鼻狀杯環(huán)線蟲的另一個物種。研究通過形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)手段，對盅口亞科的鼻狀杯環(huán)線蟲進(jìn)行鑒定，與GenBank上已發(fā)表的該蟲體ITS序列比對，全I(xiàn)TS的同源性達(dá)99.6%和99.8%，ITS1序列完全相同，ITS2序列在雌蟲和雄蟲中分別有兩處和三處的堿基發(fā)生了改變，由此證明了研究中的蟲體為鼻狀杯環(huán)線蟲，還說明了ITS序列是寄生蟲分子鑒定的有效基因標(biāo)記。

［1］張路平，孔繁瑤.馬屬動物的寄生線蟲［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［2］齊普生，李靚如.中國草食家畜常見寄生蠕蟲圖鑒［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

［3］Traversa D，Milillo P，Barnes H，et al.Distribution and species-specific occurrence of cyathostomins（Nematoda， Strongylida）in naturally infected horses from Italy，United Kingdom and Germany.［J］.Vet Parasitol，2010，168（1-2）：84-92.

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［5］Hung G C，Chilton N B，Beveridge I，et al.Molecular evidence for cryptic species within Cylicostephanusminutus（Nematoda：Strongylidae）［J］.Int J Parasitol，1999，29（2）：285.

［6］任娣，陳武，宋亞芬，等.斑鼻羚毛首線蟲ITS序列的PCR擴(kuò)增及分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（3）：47-50.

［7］Lichtenfels J R，Kharchenko V A，Sommer C，et al.Key characters for the microscopical identification of CylicocyclusnassatusandCylicocyclusashworthi（Nematoda，Cyathostominae）of the horse，Equuscaballus［J］.J Helminthol Soc W，1997，64，120-127.

［8］Hung G C，Chilton N B，Beveridge I，et al.Molecular delineation of Cylicocyclusnassatus and C.ashworthi（Nematoda：Strongylidae）［J］.Int J Parasitol，1997，27，601-605.

Identification of Morphology and Molecular Biology of Cylicocyclusnassatus

Gao Yuan，Qiu Jianhua，Chang Qiaocheng，Gao Junfeng，Wang Chunren
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to confirm the species of the nematodes，the worms from the naturally infected horse in Daqing were identified based on the morphological observation and molecular biological method.The result of the morphological observation showed that the worms mightbe theCylicocyclusnassatus.The nuclear ribosomal internal transcribed spacer sequences（ITS）of single female and male worms were amplified by PCR.The results showed that the length of the ITS sequences were all 842 bp，and the length of the ITS1，5.8S and ITS2 were 370 bp，152 bp and 320 bp，respectively.Compared the ITS sequences of female and male worms with the C.nassatus available in the GenBank，the sequences identity were 99.8%and 99.6%，respectively.So the result demonstrated that the nematodes wereC.nassatus.

Cylicocylusnassatus；morphological observation；molecular biological identification；ITS sequence

S855.9+1

A

1002-2090（2017）04-0045-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.011

2016-04-20

黑龍江省普通高等學(xué)校黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（AMKL201304）。

高遠(yuǎn)（1992-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2015級碩士研究生。

王春仁，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chunrenwang@sohu.com。