1997—2010年上海市豬源大腸桿菌耐藥性和產(chǎn)ESBLs菌的基因型檢測(cè)

沈莉萍，徐 鋒，張維誼，王 建

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

1997—2010年上海市豬源大腸桿菌耐藥性和產(chǎn)ESBLs菌的基因型檢測(cè)

沈莉萍，徐 鋒，張維誼，王 建

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

[目的]了解1997—2010年上海市豬源大腸桿菌的耐藥情況和產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的基因型分布。[方法]采用K-B法對(duì)199株豬源大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用PCR方法對(duì)TEM、CTX-M、SHV和OXA等4種基因型進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]199株豬源大腸桿菌對(duì)20種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。耐藥率最低的為大觀霉素（7.04%），其次為頭孢曲松（10.55%）、頭孢哌酮（12.56%），最高的為林可霉素（100%），對(duì)阿莫西林和復(fù)方新諾明的耐藥率分別高于80%和93.33%。5～15耐的菌株占88.94%。15種抗菌藥物之間均存在不同程度交叉耐藥性。共檢出15株產(chǎn)ESBLs菌株（7.54%），其中2株TEM型，5株CTX-M型，7株同時(shí)攜帶TEM、CTX-M型。[結(jié)論]上海市豬源大腸桿菌分離株耐藥譜廣、耐藥率高；對(duì)抗菌藥物的交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，交叉耐藥率有的相似，有的差異大。豬源大腸桿菌ESBLs基因型主要以TEM型和CTX-M型為主，尚無SHV型和OXA型。

豬；大腸桿菌；耐藥性；ESBLs；基因型；上海

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一類在養(yǎng)豬業(yè)中具有重要意義的疾病。其血清型眾多、抗原復(fù)雜；且多與病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)，加大了防控難度。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）由質(zhì)粒編碼，能通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化和傳導(dǎo)等形式，造成耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散，使敏感菌變成耐藥菌。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用或不規(guī)范使用，產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌菌株逐年增多。產(chǎn)ESBLs菌株在菌株間的傳播，更增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致獸醫(yī)臨床中的大腸桿菌耐藥現(xiàn)象也越來越普遍。大腸桿菌是人及動(dòng)物體內(nèi)的主要共生菌，其耐藥性是抗菌藥物壓力的指示器，也是耐藥基因的潛在來源庫[1]，因此開展大腸桿菌耐藥性檢測(cè)具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

本試驗(yàn)對(duì)上海市1997—2010年的199株臨床分離保存的豬源大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)，并篩選出產(chǎn)ESBLs菌株，旨在了解和掌握上海市豬源大腸桿菌臨床分離株的耐藥情況和產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的基因型分布，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。199株豬源大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室從1997—2010年臨床分離鑒定保存；質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 培養(yǎng)基。哥倫比亞羊血瓊脂、MHB、MHA等，購自北京陸橋技術(shù)有限公司，并按常規(guī)法配制。

1.1.3 藥敏紙片。共20種，包括強(qiáng)力霉素（DOX）、氨芐青霉素（AMP）、阿莫西林（AMX）、頭孢曲松（CRO）、頭孢拉定（CED）、頭孢哌酮（CFP）、恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFX）、氟哌酸（NOR）、阿米卡星（AMK）、卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、壯觀霉素（SPT）、鏈霉素（STR）、新霉素（NEO）、復(fù)方新諾明（SXT）、氯霉素（CHL）、四環(huán)素（TCY）、林可霉素（LIN），均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.4 試劑。Marker 、Tax remix、Loading Buffer，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.5 引物。由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)。按照K-B法進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果按2012 CLSI藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，并用WHONET5.6版本統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.2.2 ESBLs表型篩選試驗(yàn)。選用頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松藥敏紙片，用MH瓊脂35 ℃ 18 h培養(yǎng)，觀察結(jié)果。凡頭孢他啶的抑菌圈直徑≤22 mm、頭孢曲松≤25 mm、頭孢噻肟≤27 mm，為可疑ESBLs菌株[2]。

1.2.3 ESBLs表型確證試驗(yàn)。用頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸2組紙片做確證試驗(yàn)，含克拉維酸與其相應(yīng)不含克拉維酸的紙片抑菌圈直徑差值≥5 mm的確定為產(chǎn)ESBLs菌株[2]。

1.2.4 交叉耐藥。A抗菌藥物對(duì)B抗菌藥物的交叉耐藥率（%）=同時(shí)耐A、B抗菌藥物的菌株數(shù)量/總的耐B抗菌藥物的菌株數(shù)量×100%。當(dāng)交叉耐藥率為0時(shí)，表示A、B這2種抗菌藥物之間不存在交叉耐藥性；交叉耐藥率越高，說明菌株對(duì)B抗菌藥物產(chǎn)生耐藥時(shí)，對(duì)A抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)會(huì)就越大[3]；這里A、B抗菌藥物是指任意2種不同的抗菌藥物。

1.2.5 細(xì)菌DNA提取。從36 ℃過夜培養(yǎng)的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中挑取2～3個(gè)菌落，將其放入100 μL滅菌蒸餾水中，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min，離心5 min，留取上清液作為模板。

1.2.6 PCR擴(kuò)增引物。參照李鳳娟[4]設(shè)計(jì)的TEM、CTX-M、SHV、OXA 4對(duì)引物，引物序列、擴(kuò)增長(zhǎng)度和退火溫度見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.7 PCR反應(yīng)體系。共25 μL：Tax remix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，滅菌蒸餾水10.5 μL。

1.2.8 PCR反應(yīng)參數(shù)。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s、退火45 s（退火溫度見表1）、72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

豬源大腸桿菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥率低于31%，其中對(duì)3種抗菌藥物的耐藥率低于13%，分別為CFP（12.56%）、CRO（10.55%）和SPT（7.04%）；有5種抗菌藥物的耐藥率在49.25%～67.34%之間；對(duì)KAN（73.87%）、ENR（77.39%）和CHL（79.40%）的耐藥率高于70%，對(duì)AMP（93.47%）、SXT（96.98%）和TCY（99.50%）的耐藥率高于90%，對(duì)LIN的耐藥率為100%（表2）。

表2 199株豬源大腸桿菌對(duì)20種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

按照耐藥譜分析，5～15耐的菌株有177株（88.94%），其中12耐菌株有27株，所占比例最大（13.57%），其次為11耐（12.56%）、13耐（11.56%），2耐和3耐的菌株均有4株（2.01%），最高18耐的菌株只有1株（0.50%）（圖1）。

圖1 199株豬源大腸桿菌耐藥譜

按不同年代豬源大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1997—2010年，豬源大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥率均有變化。對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物中CFP和CRO的耐藥率在28%以內(nèi)。2006年出現(xiàn)對(duì)CFP耐藥菌株，耐藥率為20.00%，對(duì)AMX的耐藥率高于80%，1997—2006年對(duì)CED的耐藥率一直維持在10%左右，但到2010年上升到53.33%；在氨基糖苷類抗菌藥物中，對(duì)SPT耐藥率低于16%，對(duì)KAN在60%～92%之間，1997—1999年對(duì)AMK的耐藥率為6.67%，在2002—2010年為30%～40%；對(duì)4種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率在40%～90%；對(duì)DOX的耐藥率在50%～70%，對(duì)SXT的耐藥率高于93.00%（表3）。

表3 不同年代豬源大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算15種抗菌藥物間的交叉耐藥率，結(jié)果所有的抗菌藥物之間均存在交叉耐藥性。其中，SPT對(duì)SXT的交叉耐藥率最低（6.63%），而SXT對(duì)CRO、NOR、AMK、GEN、SPT和CFP、AMP對(duì)CRO、CED、AMK、SPT和CFP、CED對(duì)CRO和CFP、 ENR對(duì)OFX和SPT、CFP對(duì)CRO等的交叉耐藥率均為100%；AMP（OFX除外）、AMX、SXT（ENR除外）分別對(duì)其余抗菌藥物的交叉耐藥率均高于90%；喹諾酮類對(duì)其余14種抗菌藥物的交叉耐藥率均高于50%；僅壯觀霉素對(duì)其余14種抗菌藥物的交叉耐藥率均小于28%。CIP對(duì)SPT的交叉耐藥率為90.63%，而SPT對(duì)CIP的交叉耐藥率為8.71%，說明當(dāng)某1株大腸桿菌對(duì)SPT產(chǎn)生耐藥性時(shí)，對(duì)CIP的耐藥機(jī)會(huì)為90.63%；相反，當(dāng)某1株大腸桿菌對(duì)CIP產(chǎn)生耐藥性時(shí)，對(duì)SPT的耐藥機(jī)會(huì)僅為8.71%（表4）。

2.2 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的表型和基因型檢測(cè)結(jié)果

199株豬源大腸桿菌經(jīng)表型篩選和確證試驗(yàn)，共檢出15株產(chǎn)ESBLs菌株（7.54%）。對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株經(jīng)TEM、CTX-M、SHV、OXA型引物擴(kuò)增，結(jié)果TEM型陽性2株，CTX-M型陽性5株，同時(shí)攜帶TEM、CTX-M型7株，未檢測(cè)到SHV、OXA型，有1株ESBLs陽性菌株沒有檢測(cè)到上述4種基因型。

2.3 產(chǎn)ESBLs菌株和非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥情況比較

對(duì)比分析15株產(chǎn)ESBLs和184株非產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)20種抗菌藥物的耐藥情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)SPT和STR這2種抗菌藥物的耐藥率均低于35%，而對(duì)其余的抗菌藥物的耐藥率均高于50%，尤其對(duì)NOR、ENR、SXT、TCY、AMP、AMX和LIN等7種抗菌藥物的耐藥率均為100%；非產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)SPT、CRO和CFP等3種抗菌藥物的耐藥率均低于10%，對(duì)STR、NEO、AMK和CED等4種抗菌藥物均低于30%，對(duì)DOX、GEN和NOR等3種抗菌藥物均高于50%、對(duì)SXT、TCY和AMP等3種抗菌藥物均高于90%，僅對(duì)LIN的耐藥率為100%。產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌株之間對(duì)CRO、CFP、CED和NOR等4種抗菌藥物的耐藥率相差40%以上、對(duì)CHL、TCY和LIN等3種抗菌藥物的耐藥率接近（表5）。

表5 豬源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株和非產(chǎn)ESBLs菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

按耐藥譜分析，產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥現(xiàn)象均嚴(yán)重。產(chǎn)ESBLs菌株為9～17耐，其中15耐所占比例最大（33.33%）。非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥譜廣，為2～18耐（17耐除外），以11～13耐為主，占40.22%，18耐1株，占0.54%（表6）。

3 討論

本次調(diào)查結(jié)果表明，豬源大腸桿菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，以多重耐藥為主，耐藥譜廣。但十多年來對(duì)大觀霉素的耐藥率一直低于10%，究其原因是由于大觀霉素一直沒有獸用的注射劑，僅有鹽酸大觀-林可霉素可溶性粉劑，也沒有原料粉劑，因此大腸桿菌不易對(duì)大觀霉素產(chǎn)生耐藥性。將本次調(diào)查結(jié)果與金凌艷等[6]的調(diào)查結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2008年上海市豬源大腸桿菌的耐藥率明顯高于其他動(dòng)物源大腸桿菌，這是由于其他動(dòng)物源大腸桿菌是從養(yǎng)殖場(chǎng)健康動(dòng)物的泄殖腔棉拭分離到的。通常養(yǎng)殖場(chǎng)在飼料中添加的是預(yù)防用量的抗生素，而本次調(diào)查中的大腸桿菌是從病死豬內(nèi)臟分離到的，對(duì)其使用的是治療劑量的抗生素，而且養(yǎng)殖場(chǎng)的豬一旦發(fā)病，場(chǎng)主往往超劑量或?yàn)E用抗生素，不遵守用藥原則，因此，細(xì)菌很快對(duì)使用的抗生素產(chǎn)生耐藥性。據(jù)姚瓊芬等[7]對(duì)牛源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查表明，牛源大腸桿菌耐藥率比較低，且不存在較大的耐藥風(fēng)險(xiǎn)，這是由于相關(guān)部門對(duì)奶制品的監(jiān)督嚴(yán)格，在牛飼養(yǎng)過程中降低了抗菌藥物的使用。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在1997—2010年，上海市養(yǎng)殖場(chǎng)由于長(zhǎng)期大劑量使用KAN、AMX、SXT、DOX和ENR等抗菌藥物，對(duì)這些藥物的耐藥率均高于50%，尤其對(duì)SXT在的耐藥率1997—2010年均大于93%，說明大腸桿菌對(duì)SXT耐藥性一旦產(chǎn)生，很難消除，建議豬場(chǎng)少用或停用SXT。國(guó)家相關(guān)職能部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)獸藥的管理，規(guī)范在動(dòng)物生產(chǎn)過程中各個(gè)環(huán)節(jié)的獸藥使用，加強(qiáng)監(jiān)督，禁止濫用抗生素，尤其要禁止使用第三代頭孢菌素。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)采取聯(lián)合用藥、輪換用藥的方式，增強(qiáng)療效，降低細(xì)菌耐藥性的幾率。

表4 大腸桿菌對(duì)2種藥物的交叉耐藥率（%）

將199株大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的交叉耐藥性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間均存在著不同程度的交叉耐藥性。同一類型或不同類型的2種抗菌藥物之間的2個(gè)交叉耐藥率有的基本一致，如β內(nèi)酰胺類抗菌藥物中，AMP對(duì)AMX、AMX對(duì)AMP的交叉耐藥率分別為98.87%、94.00%，DOX對(duì)GEN、GEN對(duì)DOX的交叉耐藥率分別為65.50%、64.37%；有的則差異很大，如β內(nèi)酰胺類抗菌藥物中，CED對(duì)CRO、CFP的交叉耐藥率均為100%，CRO、CFP對(duì)CED的交叉耐藥率分別為43.40%、42.39%。因此，不同抗菌藥物之間的交叉耐藥性有的相似，有的差異較大。

喹諾酮類藥物是養(yǎng)殖場(chǎng)普遍使用的一類抗菌藥物。通常如果分離菌株對(duì)1種喹諾酮類藥物耐藥，對(duì)其他喹諾酮類藥物也會(huì)表現(xiàn)為耐藥或敏感性降低。環(huán)丙沙星對(duì)腸桿菌科菌株具有明顯抗菌活性[8]，這就提示在日常的檢測(cè)工作中，如果環(huán)丙沙星對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性，那么對(duì)其他喹諾酮類藥物的敏感性也非常低，因此，應(yīng)盡可能避免使用其他喹諾酮類藥物。

產(chǎn)ESBLs菌株的基因型檢測(cè)表明2010年之前上海市產(chǎn)ESBLs豬源大腸桿菌的基因型以TEM型和CTX-M型為主，尚無SHV型和OXA型，這與劉雅妮等[9]的研究結(jié)果一致。本次試驗(yàn)沒有檢測(cè)到SHV型基因，說明上海市豬源大腸桿菌可能未通過質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌間耐藥基因的交換。15株產(chǎn)ESBLs菌株中有1株未檢測(cè)到上述4種基因型，可能是含有4種基因型以外的其他基因。

產(chǎn)ESBLs豬源大腸桿菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥率均較高，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。除β內(nèi)酰胺類耐藥外，對(duì)喹諾酮類、氨基糖苷類的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株，說明產(chǎn)ESBLs是大腸桿菌對(duì)此類藥物耐藥的主要原因。在所有檢測(cè)的大腸桿菌中，

表6 豬源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株和非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥譜

有1株非產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)18種抗菌藥物都產(chǎn)生耐藥性，這有可能是該大腸桿菌的耐藥基因不同，下一步將對(duì)此進(jìn)行研究。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Drug Resistance of Escherichia coli Isolated from Swine in Shanghai City from 1997 to 2010 and Genotype Detection of Strains Expressing ESBLs

Shen Liping，Xu Feng，Zhang Weiyi，Wang Jian
（Shanghai Animal Disease Prevention and Control Center，Shanghai 201103）

[Objective]To investigate the drug resistance of E. coli from swine in Shanghai from 1997 to 2010 and genotype distribution of strains expressing ESBLs. [Methods]The antimicrobial susceptibility of 199 strains of E. coli isolated from swine was determined by K-B method，and the genotypes of TEM，CTX-M，SHV and OXA genes were analyzed by PCR. [Results]199 strains of E. coli isolated from swine showed different degrees of resistance to 20 kinds of antibiotics. The lowest rate of drug resistance was spectinomycin（7.04%），followed by ceftriaxone（10.55%） and cefoperazone（12.56%），the highest was lincomycin（100%），and the resistance rates to amoxicillin and compound sulfamethoxazole were greater than 80% and 93.33%，respectively. 88.94% of the isolates exhibited multiple resistance from 5 to 15. There was cross-resistance among the 15 kinds of antibiotics. There were 15 strains expressing ESBLs and the detection rate was 7.54%，including 2 strains expressing TEM gene，5 strains expressing CTX-M gene，and 7 strains expressing both TEM gene and CTX-M gene. [Conclusion]The isolates of E. coli from swine in Shanghai had wide spectrum of resistance and high resistance rates. Cross-resistance of antibiotics was serious. Cross-resistance rate was somewhat similar，but some were different. TEM type and CTX-M type were predominant genotypes of ESBLs in E. coli strains，and both SHV type and OXA weren′t detected.

swine；E.coli；drug-resistance；ESBLs；genotype；Shanghai

S852.612

A

1005-944X（2017）09-0026-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.008

上海市農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)性項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字〔2014〕第7-3-3號(hào)）

王 建