紅景天苷對乳鼠心肌肥大細胞的保護作用研究

吳阿新 劉杭 童芬美

紅景天苷對乳鼠心肌肥大細胞的保護作用研究

吳阿新 劉杭 童芬美

目的 在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞上，觀察紅景天苷（Sal）對苯腎上腺素（PE）誘導的心肌細胞肥大的影響。方法 應用細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞，采用倒置顯微鏡和圖像分析測量細胞面積，測定心肌細胞3H-亮氨酸摻入率作為心肌細胞肥大的指標；用Western blot法檢測心肌細胞熱休克蛋白HSP70蛋白的表達。結果 濃度50μg/ml的Sal能抑制PE誘導的心肌細胞增大及心肌細胞合成速率的增加（P＜0.05）；能顯著增加心肌肥大細胞HSP70蛋白表達（P＜0.05）。結論 Sal可以抑制PE誘導的心肌細胞肥大，這可能與其增加HSP70蛋白表達有關。

紅景天苷 苯腎上腺素 心肌細胞肥大 HSP70

心肌肥大與纖維化是心臟長期負荷過重時發(fā)生的一種心室重構，除心肌細胞蛋白質(zhì)合成增加和細胞體積增大外，還伴隨心肌細胞間結締組織沉積［1］，也是多種心血管系統(tǒng)疾病常見并發(fā)癥和病理基礎［2］。持續(xù)存在的心肌肥大逐漸發(fā)展為失代償，常導致嚴重的心律失常、心力衰竭［3］。紅景天苷（Sal）是紅景天中的主要有效成分之一［4］，其具有抗缺氧、抗疲勞、保護心肌和增強收縮力作用。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70作為心肌細胞耐受缺血、缺氧損傷的一種內(nèi)源性物質(zhì)，在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用［5］。2015年9月至12月作者采用乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)，觀察Sal對心肌細胞肥大中HSP70蛋白表達的影響，探討其心肌肥大的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）受試藥物：Sal為Sigma公司生產(chǎn)。20、5、1.25mg Sal分別溶于100ml DMEM培養(yǎng)液中，高、中、低劑量的終濃度分別為200μg/ml 、50μg/ml和12.5μg/ml。（2）主要試劑及儀器：青霉素、鏈霉素（華美生物），全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（凱基生物），DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（Hyclone），D-Hanks液（Solarbio），Ⅱ型膠原酶（Worthington），5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）、苯腎上腺素（PE）（Sigma），3H-亮氨酸（中科院上 海原子能研究所），牛血清白蛋白（biosharp），SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG（中杉金橋），預染Marker（Thermo），ECL顯色劑（Thermo），Anti-HSP70 antibody，Anti-GAPDH antibody（abcam），PVDF膜（millipore），低溫離心機（eppendorf），酶標儀（ANTAI），電泳儀（Power Pac TM HC，Bio-Rad），電轉(zhuǎn)儀（XCell Sure Lock?，Invitrogen），二氧化碳培養(yǎng)箱（HF240，Heal Force），倒置顯微鏡（CKX41，OLYMPUS），超凈工作臺（SWGL-2FD，蘇凈安泰），LS3810液體閃爍儀（Beckman公司），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。

1.2 方法 （1）心肌細胞的培養(yǎng)：①出生1～2d的SD乳鼠（浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心提供），置于75%酒精中消毒，無菌條件下剪取心室組織，放入D-Hanks液中洗滌3次，剝離心房與血塊后，將心室剪成1mm3大小的碎塊。②濃度為1%的Ⅱ型膠原酶與D-Hanks液1：4混合配成消化液，置于4℃冰箱過夜，消化心室組織碎塊。③用槍頭吹打消化液，以終止液終止消化（終止液為每10m1消化液加入4ml含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基），1000r/min離心15min。④細胞計數(shù)后，以3×105～5×105/ml密度接種于12孔板內(nèi)，每1mlDMEM高糖培養(yǎng)基加10μl配好的抗生素溶液，置于CO2孵箱、37 ℃培養(yǎng)。⑤孵育24h后，先用細胞培養(yǎng)級PBS清洗，再換成含10%胎牛血清和0.1mM BrdU的DMEM高糖培養(yǎng)基，以抑制摻雜的少量非心肌細胞增殖，繼續(xù)孵育48h后換成不含血清與抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基。（2）分組及給藥：無血清無抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育24h后，進行給藥。分成五組：control 組不作處理，PE組給予PE刺激（10uM，10μl/ml），PE+Sal高、中、低組分別給予PE（10uM，10μl/ml）及Sal（200μg/ml、50μg/ml、12.5μg/ml），稍震蕩混勻后，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。（3）心肌細胞肥大檢測：①心肌細胞3H-亮氨酸摻入測定：心肌細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，加入各種處理因素和18.3kBq3H-亮氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，用25mg/L胰蛋白酶消化后收集細胞于玻璃纖維素膜上，用10%的三氯乙酸固定，濾膜烘干后用，LS3910液體閃爍儀測定放射強度。②心肌細胞面積的測定：心肌細胞接種于12孔板，每組設4個平行孔，藥物作用48h后棄培養(yǎng)液，用PBS平衡鹽溶液快速沖洗2遍，于倒置顯微鏡下觀察并拍照（物鏡20倍），每孔取5個視野，每個視野約5個細胞，用Image-Pro Plus5.0專業(yè)圖像分析軟件測量單個細胞面積（μm2）。（4）Western blot法檢測HSP70的表達：①蛋白樣品的制備：取control組、PE組和PE+Sal中劑量組的12孔板心肌細胞，按每孔60μl加入蛋白裂解液，室溫靜置裂解15min，無菌槍頭收集上清液，12000r/min 4℃離心30min，吸取上清液保存于-20℃冰箱備用。②Western blot法檢測靶蛋白HSP70含量：測定樣品中蛋白濃度后，用SDS-PAGE上樣緩沖液（還原，5X）與稀釋后的蛋白樣品按體積比1：4混合，置于水浴鍋中恒溫變性5min。將變性處理過的細胞蛋白樣品加入濃縮膠中，每孔加細胞蛋白樣品500ng進行電泳，電壓80 V。蛋白進入分離膠后，將電壓調(diào)至 100V。電泳結束后，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜條件：恒定電流200mA，轉(zhuǎn)移120min。轉(zhuǎn)膜結束后將膜放入封閉液中封閉。封閉后與1：1000稀釋的一抗HSP70抗體4℃孵育過夜，與1：5000稀釋的二抗室溫孵育1h。二抗結合結束后，在膜上加ECL化學發(fā)光底物，凝膠成像系統(tǒng)拍照，最后對結果進行灰度掃描分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Sal對心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率的影響 給藥24h后，PE組心肌細胞合成速率較control組明顯增加（P＜0.01）；Sal能抑制PE刺激的心肌蛋白質(zhì)合成速率的增加；PE+Sal中劑量組與PE組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PE+Sal高劑量組及PE+Sal低劑量組與PE組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 Sal對心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率的影響（x±s）

2.2 Sal對心肌肥大細胞面積的影響 PE組細胞面積明顯大于control組和PE+Sal中劑量組（P＜0.05）；PE+Sal中劑量組細胞面積與control組比較差異無統(tǒng)計學意義；PE+Sal高、低劑量組與PE組細胞面積差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 Sal對心肌肥大細胞面積的影響（x±s）

2.3 Sal對心肌細胞HSP70蛋白表達的影響 給藥24h后，PE+Sal中劑量組心肌HSP70蛋白表達顯著高于control組與PE組，為control組的（57.4±0.27）倍；為PE組的（13.6±0.15）倍（P＜0.05，n=3）（見圖1）。

圖1 紅景天苷對心肌肥大細胞HSP70蛋白表達的影響（n=3）

3 討論

隨著對紅景天的研究日益增多，其藥理作用也不斷被發(fā)現(xiàn)并應用。目前研究表明，紅景天對冠心病、高血壓病等疾病的治療效果理想；心腦血管疾病的發(fā)生與血小板聚集、粘附等活性增高相關以外，還與血液流變性異常、血液粘度增加有關。在藏藥紅景天對正常家兔血小板聚集、血液流變性的影響中發(fā)現(xiàn)，藏藥紅景天對ADP、AA、COLL誘導血小板聚集均具有不同程度的抑制及改善血液流變學作用，其具體作用機制，尚待進一步研究［6］。紅景天具有上調(diào)AM、CRLR表達和促進AMI大鼠缺血心肌血管新生的作用，紅景天苷是紅景天發(fā)揮該作用的有效成分之一［7］。

心肌細胞是一種高度分化的終末細胞，但當受到多種因素刺激時，心肌細胞體積變大，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量增加，肌節(jié)數(shù)量增多，肌原纖維積聚而出現(xiàn)心肌肥大，這是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應性反應。HSP70是研究最多的熱休克蛋白亞族，分為組成型和誘導型兩類，前者位于細胞漿內(nèi)，主要發(fā)揮分子伴侶功能，而誘導型HSP70廣泛存在于細胞漿和細胞核，在細胞膜上也可檢測到。HSP在正常細胞內(nèi)低表達；HSP70的異常表達在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用：當細胞受到各種應激時誘導型HSP70表達增加，以提高細胞對有害刺激的抵抗力，是細胞水平上的抗損傷反應，如缺血缺氧誘導熱休克蛋白表達，可減輕再灌注損傷［8］。心肌肥大時，由于應激產(chǎn)生使得HSP70蛋白表達增加，產(chǎn)生對機體的保護作用；適合濃度的Sal可能通過增加HSP70的表達水平，抑制心肌肥大。

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Objective To explore the regulatory effect of salidroside（Sal）on HSP70 expression in improving rat myocardial hypertrophy. Methods Cultured cardiomyocytes of nude rats were used to establish a myocardial hypertrophy model by phenylephrine（PE）stimulation. The cardiomyocyte surface area was detected by inverted microscope and digital image analysis technology. 3H-leucine incorporation was measured to evaluate myocardial hypertrophy. The expression of HSP70 protein was detected by Western blot. Results Sal（50μg/ml）was able to decrease the increased cell surface area and the 3H-leucine incorporation was stimulated by PE（P＜0.05）. Sal was able to increase HSP70 protein expression. Conclusion Sal can ameliorate myocardial hypertrophy，probably through increases HSP70 protein expression.

Salidroside Phenylephrine Myocardial hypertrophy HSP70

310013 杭州市西溪醫(yī)院