p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)糖尿病小鼠腎小球?yàn)V過率的影響

趙詠莉 姚新明? 陳月平 何春玲 翟清 王勇

p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)糖尿病小鼠腎小球?yàn)V過率的影響

趙詠莉 姚新明? 陳月平 何春玲 翟清 王勇

目的 探討p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）特異性抑制劑SB203580對(duì)糖尿病小鼠腎小球?yàn)V過率的影響及機(jī)制。方法 60只清潔級(jí)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NG組）、糖尿病組（DM組）和SB203580治療組（SB組）。測定小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、尿白蛋白排泄和腎小球?yàn)V過率。結(jié)果 與NG組比較，DM組血清SOD活性明顯降低，MDA含量和尿白蛋白排泄明顯增加（P＜0.05）；與DM組比較，SB組血清SOD活性升高，MDA含量和尿白蛋白排泄降低（P＜0.05）。與NG組比較，DM組腎小球?yàn)V過率降低（P＜0.05）；與DM組比較，SB組腎小球?yàn)V過率升高（P＜0.05）。相關(guān)性分析：腎小球?yàn)V過率與血清SOD活性存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.670，P＜0.001），與血清MDA含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.731，P＜0.001）。結(jié)論 p38MAPK特異性抑制劑SB203580通過減輕氧化應(yīng)激改善腎小球?yàn)V過率。

p38MAPK 氧化應(yīng)激 糖尿病小鼠 腎小球?yàn)V過率

糖尿病腎臟疾?。―KD）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，也是引起終末期腎病的主要原因之一。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）是MAPKs 家族的重要成員，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、分化、增殖及凋亡等具有重要作用。同時(shí)p38MAPK信號(hào)通路是糖尿病腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中較多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的交點(diǎn)，參與糖尿病腎臟細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)及腎臟進(jìn)行性纖維化［1］。2016年7月至2017年2月作者通過觀察SB203580（p38MAPK特異性抑制）抑制p38MAPK信號(hào)通路對(duì)糖尿病小鼠腎小球?yàn)V過率的影響，探討p38MAPK信號(hào)通路在糖尿病腎臟疾病中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，試驗(yàn)使用小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。1.2 主要藥物及試劑 SB203580（sigma公司），STZ（sigma公司），SOD、MDA測試盒（南京建成生物工程研究所），菊粉測試盒（Cayman公司），尿肌酐測定測試盒及尿微量白蛋白測定試劑盒（中國利德曼生化股份有限公司）。

1.3 儀器 德國羅氏血糖儀、Elx800通用型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）、UV754N型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、ADVIA Centaur 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國西門子公司）。

1.4 方法 （1）動(dòng)物模型的制備及分組：60只清潔級(jí)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（NG組）、糖尿病組（DM組）和SB203580治療組（SB組），每組各20只。正常對(duì)照組：正常小鼠。糖尿病組：小鼠高脂飲食4周，腹腔均注射鏈脲佐菌素STZ［0.1mol/ L無菌枸櫞酸緩沖液配制為6.5mg/ml（pH4.3）］，每次40mg/kg，連續(xù)5d，48h后采空腹尾外周血測血糖，以德國羅氏血糖儀測血糖≥16.7mmol/L，入選糖尿病小鼠模型。SB203580治療組：糖尿病小鼠予以1次/d腹腔注射SB203580，5mg/（kg·d），共5次。（2）造模成功后4周行股靜脈插管輸入菊粉，膀胱切開插入導(dǎo)尿管測定腎小球?yàn)V過率，并收集血液及尿液。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢測（1）ELISA法檢測血清超氧化物歧

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 正常對(duì)照組小鼠的一般狀況良好，DM組小鼠出現(xiàn)多飲，多食，多尿，體重減輕，精神萎靡等表現(xiàn)，SB組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中，上述癥狀均較DM組輕，且體重有增加。

2.2 三組各項(xiàng)觀察指標(biāo)比較 與 NG組比較，DM組血液SOD活性明顯降低，MDA含量和尿白蛋白排泄明顯增加（P＜0.05）；與DM組比較，SB組血液SOD活性明顯升高，而MDA含量和尿白蛋白排泄明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與NG組比較，DM組腎小球?yàn)V過率降低（P＜0.05）；與DM組比較，SB組腎小球?yàn)V過率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組各觀察指標(biāo)比較（x±s）

圖1 腎小球?yàn)V過率與血清SOD活性

圖2 腎小球?yàn)V過率與血清MDA含量

2.3 相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，腎小球?yàn)V過率與血清SOD活性間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.670， P＜0.001），見圖1。腎小球?yàn)V過率與血清MDA含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.731，P＜0.001），見圖2。化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量：采用雙抗體夾心-ELISA法。用抗小鼠SOD/MDA單抗（一抗）包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的小鼠SOD/MDA與單抗結(jié)合；加入生物素化的抗小鼠SOD/MDA（二抗），形成免疫復(fù)合物連接在板上。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈球菌（Streptavidin）與二抗的生物素結(jié)合，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍(lán)色；加終止液硫酸，顏色變黃；在450nm處測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出小鼠SOD活性和MDA含量。（2）免疫比濁法檢測尿白蛋白：免疫比濁法檢測尿白蛋白，尿白蛋白與試劑中抗小鼠白蛋白抗體在緩沖液中形成抗原抗體復(fù)合物，可使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。與校正品對(duì)照，即可得出未知白蛋白的含量。（3）肌氨酸氧化酶法檢測尿肌酐：尿液中的肌酐在肌酐酶作用下水解生成肌酸，肌酸在肌酸酶作用下生成肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下生成甘氨酸、甲醛、過氧化氫，在過氧化物酶作用下生成藍(lán)色染料，600nm波長有特異吸收峰，吸光度的升高與肌酐濃度成正比。（4）腎小球?yàn)V過率測定：熒光法檢測血液、尿液菊粉濃度，在激發(fā)光波長540nm，吸收光波長590nm處檢測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出標(biāo)本中菊粉的含量。腎小球?yàn)V過率=尿菊粉濃度（mg/ml）×尿量（ml/min）/血菊粉濃度（mg/ml）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析，變量間相關(guān)分析采用直線相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

DKD是以腎小球系膜細(xì)胞增殖、肥大及細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚為特點(diǎn)的腎臟病變。近年來研究顯示，氧化應(yīng)激在DKD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在高糖狀態(tài)下，清除氧自由基的各種抗氧化酶的活性被抑制，引起氧自由基增多，進(jìn)而損傷腎臟組織。有研究報(bào)道高血糖導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物受損，產(chǎn)生過量腎皮質(zhì)總活性氧（ROS），激活一系列信號(hào)分子，介導(dǎo)多種炎性因子、趨化因子釋放并作用于腎臟細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞及組織損傷，發(fā)生糖尿病腎臟疾?。?］。SOD是機(jī)體內(nèi)源性最主要的氧自由基清除劑，能保護(hù)細(xì)胞免受損傷，MDA是氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化物的降解終產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，間接反映細(xì)胞的受損程度及自由基的含量。通過測定SOD活性和MDA含量可以反映出機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，本資料結(jié)果顯示與 NG組比較，DM組血清SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加，尿白蛋白排泄升高，腎小球?yàn)V過率下降（P＜0.05）。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，腎小球?yàn)V過率與血清SOD活性之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.670，P＜0.001）；與血清MDA含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.731，P＜0.001），表明高血糖加劇氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激加強(qiáng)后進(jìn)而降低腎小球?yàn)V過率并促進(jìn)尿白蛋白排泄。

p38MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)化過程，可引起腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎小球硬化，有研究顯示p38MAPK信號(hào)通路與DKD密切相關(guān)［3］。p38MAPK信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致腎小球硬化，而抑制p38MAPK信號(hào)通路的激活，可改善DKD的炎癥性損傷［4］。SB203580可能通過下調(diào)p38MAPK 表達(dá)，抑制近端腎小管上皮細(xì)胞增殖及胞漿中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，從而延緩腎臟纖維化進(jìn)程［5］。本資料結(jié)果顯示與 NG組比較，DM組腎小球?yàn)V過率降低，尿白蛋白排泄升高，SB203580治療后，腎小球?yàn)V過率升高，尿白蛋白排泄降低（P＜0.05），提示抑制p38 MAPK信號(hào)通路可改善腎小球?yàn)V過率并延緩DKD的發(fā)展。

P38MAPK信號(hào)通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道高糖刺激能使體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞 p38MAPK 信號(hào)通路激活，氧化應(yīng)激增強(qiáng)［6］。Song等揭示p38MAPK抑制劑SB203580能降低脊髓損傷大鼠體內(nèi)MDA含量，并提高SOD活性［7］，本資料結(jié)果顯示予以SB203580治療后，血清SOD活性明顯升高，而MDA含量明顯降低，與DM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步提示p38 MAPK信號(hào)通路的激活可以增強(qiáng)氧化應(yīng)激，促進(jìn)DKD的發(fā)展，而特異性抑制p38MAPK信號(hào)通路后可有效改善氧化應(yīng)激狀態(tài)。

總之，DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床尚缺乏有效的治療手段。本資料結(jié)果提示SB203580特異性抑制p38MAPK信號(hào)通路，可減輕氧化應(yīng)激并改善腎小球?yàn)V過率，具有腎臟保護(hù)作用。因此，p38MAPK在DKD中的作用有待進(jìn)一步深入研究，其有可能成為治療DKD的新靶點(diǎn)。

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Objective To observe the effect of p38 mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）specific inhibitor SB203580 on glomerular filtration rate in diabetic mice. Methods Sixty clean mice were randomly divided into normal control group（NG group），diabetic group（DM group）and SB203580 treatment group（SB group）. The activity of superoxide dismutase（SOD），content of malondialdehyde（MDA），urinary albumin excretion and glomerular filtration rate were measured. Results （1）Compared with NG group，the activity of SOD in DM group was significantly decreased，the content of MDA and urinary albumin excretion were significantly increased（P＜0.05）. Compared with DM group，the activity of SOD in SB group was increased，the content of MDA and urinary albumin excretion were decreased（P＜0.05）.（2）The glomerular filtration rate of DM group was lower than that of NG group（P＜0.05），and the glomerular filtration rate of SB group was higher than that of DM group（P＜0.05）.（3）Correlation analysis：The glomerular filtration rate was positively correlated with the activity of SOD（r=0.67，P＜0.001），and the glomerular filtration rate was negatively correlated with the content of MDA（r=-0.731，P＜0.001）. Conclusion p38MAPK specific inhibitor SB203580 improves glomerular filtration rate by reducing oxidative stress.

p38MAPK Oxidative stress Diabetic mice Glomerular filtration rate

安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（1608085QH191）；安徽省蕪湖市皖南醫(yī)學(xué)院校中青年科研基金（WK200938F）

241000 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院

*通信作者