• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    苦參堿通過PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

    2017-09-13 09:01:44張小文崔傳寶張平平郗紅娟高爾李聃劉玉珍趙軍朱凱張開蒂
    環(huán)球中醫(yī)藥 2017年8期
    關(guān)鍵詞:苦參堿低濃度高濃度

    張小文 崔傳寶 張平平 郗紅娟 高爾 李聃 劉玉珍 趙軍 朱凱 張開蒂

    ·論著·

    苦參堿通過PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

    張小文 崔傳寶 張平平 郗紅娟 高爾 李聃 劉玉珍 趙軍 朱凱 張開蒂

    目的探究苦參堿通過PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制。方法對(duì)人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)后分為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組以及高濃度組,對(duì)照組中加入生理鹽水,分別向低濃度組、中濃度組以及高濃度組,加入濃度為30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L的苦參堿,作用48小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀及MTT檢測(cè)法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算生長抑制率,并采用Western Blotting和real time PCR檢測(cè)PI3K、p-AKT蛋白以及PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平,比較四組之間的差異。結(jié)果高濃度組、中濃度組、低濃度組生長抑制率和凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且隨著濃度的升高生長抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05);高濃度組、中濃度組、低濃度組PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且隨著濃度的升高PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論苦參堿可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡,推測(cè)其作用機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

    肺癌; A549細(xì)胞; 苦參堿; PI3K/Akt信號(hào)通路

    肺癌多因肺支氣管黏膜在物理、化學(xué)等致癌因素的作用下發(fā)生基因突變,導(dǎo)致細(xì)胞癌基因活化,抑癌基因失去活性[1]。苦參堿是中藥苦參所含的主要生物堿之一,提取于苦豆子根部。有研究指出[2],苦參堿可通過影響腫瘤細(xì)胞DNA合成,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,發(fā)揮其抗腫瘤作用。另有研究指出[3],苦參堿可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),通過影響多種通路,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但關(guān)于苦參堿對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路影響的研究較少。本研究特探究苦參堿誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡機(jī)制以及與PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系,旨在為臨床重要抗腫瘤機(jī)制的研究提供新思路,同時(shí)為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞

    人肺癌A549細(xì)胞株,由山東博德生物科技有限公司提供。

    1.2 主要試劑

    苦參堿,分子量為248.36,購自南京廣潤生物制品有限公司,避光保存,實(shí)驗(yàn)中現(xiàn)用現(xiàn)配所需濃度。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT),購自Sigma公司,用錫箔紙包裝,避光保存?zhèn)溆?,使用前常溫下融化,有效期為一周。RPM1-1640溶液:購自濟(jì)南美森特生物科技有限公司;二甲基亞砜與熒光染料均購自Sigma公司;以及標(biāo)記液、孵育緩沖液、PI染液。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

    二氧化碳孵育箱:型號(hào)SANYO MCO-18M;流式細(xì)胞儀:型號(hào)BD FACSCalibur;微量移液器:型號(hào)HG211-WKYⅢ;倒置顯微鏡:日本奧林巴斯;離心機(jī):德國,型號(hào)Eppendorf525L;熒光顯微鏡:日本奧林巴斯。培養(yǎng)液、培養(yǎng)板由Corning公司提供。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    細(xì)胞培養(yǎng)、傳代:將濃度為4×105個(gè)/mL的A549細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。每孔滴入180 μL,培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。對(duì)照組加入生理鹽水,低、中濃度組及高濃度組分別加入濃度為30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L的苦參堿。

    1.5 A549細(xì)胞生長抑制率及凋亡率檢測(cè)方法

    48小時(shí)后每孔滴入濃度為5 g/L的MTT液,共20 μL,作用時(shí)間為4小時(shí),4小時(shí)后將培養(yǎng)基撇棄,加入150 μL DMSO,震蕩15分鐘,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490 nm的吸光度值,觀察48小時(shí)后苦參堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制情況。48小時(shí)后將細(xì)胞收集,經(jīng)PBS洗滌后進(jìn)行重懸,采用70%的乙醇將其固定,并將碘化丙啶(PI)加入其中進(jìn)行30分鐘的染色,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。制作貼壁細(xì)胞,并使用PBS洗滌1次,可增加適量干燥樣品使細(xì)胞貼得更加牢固,使用免疫染色固定液固定細(xì)胞60分鐘,再用PBS洗滌1次,加入含有0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚的PBS,冰浴孵育2分鐘,采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,并計(jì)算凋亡率。

    1.6 Real time PCR法檢測(cè)PI3K、AKT mRNA表法

    采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm、280 nm OD值,取樣品低溫保存?zhèn)溆谩<尤?9 μL DEPC水,紫外分光光度計(jì)測(cè)OD 260、OD 280,當(dāng)其比值為1.8~2.0時(shí),提示樣本中RNA純度合格。在37℃ 15分鐘,85℃ 5秒為1個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在反應(yīng)體系為20 μL,95℃ 0.5分鐘,1個(gè)循環(huán),95℃ 5秒、60℃ 34秒、40個(gè)循環(huán),95℃ 15秒、60℃ 60秒、95℃ 15秒,1個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件下,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解度曲線分析,根據(jù)系統(tǒng)給出的數(shù)值,使用內(nèi)參actin,計(jì)算各組PI3K、AKT mRNA的表法水平。

    1.7 PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況檢測(cè)方法

    根據(jù)PI3K、p-AKT蛋白質(zhì)分子量配置相應(yīng)的分離膠,混合均勻,置于烘箱中靜置30分鐘,直至水層與膠層出現(xiàn)明顯界限,向其中灌注濃縮膠,室溫靜置30分鐘,直至凝膠聚合。將制作的樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜制作成轉(zhuǎn)移“三明治”。將膜放入TBST沖洗1次,置于麗春紅染色液中染色5分鐘,放入盛有封閉液的容器中,封閉1小時(shí),根據(jù)抗體說明書,使用脫脂奶粉溶液稀釋一抗,將其加入到封閉容器中,放置于冰箱內(nèi)過夜孵育。清除一抗,后室溫下?lián)u床孵育2小時(shí)進(jìn)行二抗孵育。最后在暗盒內(nèi)進(jìn)行曝光鑒定。采用Quantity One凝膠圖像分析軟件對(duì)膠片進(jìn)行分析光密度值。使用內(nèi)參GAPDH條帶的光密度比值表示PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 肺癌A549細(xì)胞生長抑制率及凋亡率比較

    高濃度組、中濃度組、低濃度組生長抑制率和凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且隨著濃度的升高,生長抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05),其中高濃度組生長抑制率和凋亡率最高。詳見表1。

    表1 四組肺癌A549細(xì)胞48生長抑制率及凋亡率比較結(jié)果(%)

    注: 與對(duì)照組相比,aP<0.05;與低濃度組相比,bP<0.05;與中濃度組相比,cP<0.05。

    2.2 四組PI3K、AKT mRNA表達(dá)情況比較

    高濃度組、中濃度組、低濃度組PI3K、AKT mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且隨著濃度的升高PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),其中高濃度組PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平最低。詳見表2。

    表2 四組PI3K、AKT mRNA表達(dá)情況比較結(jié)果

    注:與對(duì)照組相比,aP<0.05;與低濃度組相比,bP<0.05;與中濃度組相比,cP<0.05。

    2.3 四組PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況比較

    與對(duì)照組相比,苦參堿處理細(xì)胞48小時(shí)后,隨濃度的增加,A549細(xì)胞可見染色質(zhì)凝集、核碎裂等形態(tài)學(xué)改變,PI3K和Akt蛋白表達(dá)在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中的均明顯減弱,由棕黃色逐漸變淺,提示PI3K和Akt蛋白陽性表達(dá)下降(見圖1、圖2)。Western Blotting定量分析結(jié)果與此一致,顯示出高濃度組、中濃度組、低濃度組PI3K、AKT蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且隨著濃度的升高PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。詳見表3、圖3。

    3 討論

    肺癌是常見的惡性腫瘤,目前對(duì)于該病的治療臨床上多采用手術(shù)、放療、化療以及分子靶向藥物治療,但治療效果不理想[4-5],且毒副作用明顯,尤其是化療藥物對(duì)患者骨髓造血功能有明顯的抑制作用,導(dǎo)致患者不得不中斷治療[6-7]。

    近年來,PI3K/Akt信號(hào)通路引起國內(nèi)外研究人員的注意, 其傳導(dǎo)途徑為PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生信使PIP3,PIP3與細(xì)胞內(nèi)PH結(jié)構(gòu)的信號(hào)蛋白Akt和PDKI結(jié)合,促進(jìn)PDKI磷酸化AKT蛋白的Ser308,進(jìn)而導(dǎo)致AKT激活,并通過磷酸化多種酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[8-9]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),肺癌腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要作用機(jī)制為PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。細(xì)胞在一系列內(nèi)外因素作用下,通過啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化,減少細(xì)胞的凋亡[10-11]。

    注:A對(duì)照組;B低濃度組;C中濃度組;D高濃度組

    注:A對(duì)照組;B低濃度組;C中濃度組;D高濃度組

    表3 四組PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況比較結(jié)果

    注: 與對(duì)照組相比,aP<0.05;與低濃度組相比,bP<0.05;與中濃度組相比,cP<0.05。

    注:1高濃度組;2中濃度組;3低濃度組;4對(duì)照組

    苦參堿屬于四環(huán)的喹嗪啶類,分子骨架為2個(gè)喹嗪啶環(huán)的雜體。有研究表明[11-12],苦參堿具有抗腫瘤作用,且可抑制多種細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡。其主要作用機(jī)制可能為苦參堿可增強(qiáng)促凋亡因子的表達(dá),同時(shí)抑制促癌基因的表達(dá)。有關(guān)研究指出,苦參堿可通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖分化,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,其中MAKP/ERK以及MAPK、JAK-STAT信號(hào)通路在作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用[13]。此外,苦參堿可通過影響人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響[14]。

    本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組A549細(xì)胞株生長抑制率和凋亡率顯著低于其他組,且濃度越高生長抑制率和凋亡率越高,提示藥物濃度越高對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用以及促進(jìn)其凋亡作用越明顯。顯微鏡下可觀察到隨著藥物濃度的增加,壞死細(xì)胞脫落逐漸增多,貼壁細(xì)胞逐漸減少,呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性[15]。此外,本研究中苦參堿三個(gè)濃度組PI3K、AKT蛋白以及PI3K、AKT mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組,且隨著濃度的升高表達(dá)水平顯著降低,提示藥物濃度越高抑制PI3K、AKT蛋白和mRNA的表達(dá)作用越強(qiáng)。

    綜上所述,苦參堿可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡,其可能作用機(jī)制為通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),且隨著藥物濃度的增加,生長抑制率和凋亡率以及對(duì)相關(guān)基因和蛋白的抑制作用越明顯。

    [1] 侯曉瑋,莊興俊,宋謙,等.CT引導(dǎo)經(jīng)皮肺穿刺活檢檢測(cè)晚期非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變[J].介入放射學(xué)雜志,2013,22(2):125-128.

    [2] 何光耀,謝貌,唐安洲,等.苦參堿對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,49(2):169-172.

    [3] 周娟,倪松石,賁素琴.苦參堿對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及HIF-10α,VEGF表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2012,52(3):25-27.

    [4] 蔡俊霞,譚潔,王彬,等.DC—CIK治療43例晚期非小細(xì)胞肺癌的近期療效觀察[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014,22(1):67-70.

    [5] Hsieh M J,Tsai T L,Hsieh Y S,et al.Dioscin-induced autophagy mitigates cell apoptosis through modulation of PI3K/Akt and ERK and JNK signaling pathways in human lung cancer cell lines[J].Archives of toxicology,2013,87(11):1927-1937.

    [6] 敖曼,連相堯,劉承一,等.參芪扶正注射液對(duì)肺癌化療患者造血功能和免疫功能的影響[J].山東醫(yī)藥,2012,52(3):60-61.

    [7] 丁春杰,楊磊.參芪扶正注射液對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌化療患者免疫功能的影響[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(1):7-9.

    [8] 殷舞,鐘曉剛,黃順榮,等.PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在大腸腺瘤惡性轉(zhuǎn)化中的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(2):238-240.

    [9] 隋華,付曉伶,潘樹芳,等.PI3K/Akt/NF-κB通路調(diào)控ABCB1/P-gp介導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥的研究[J].中國癌癥雜志,2014,24(2):106-111.

    [10] Gadgeel S M,Wozniak A.Preclinical rationale for PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors as therapy for epidermal growth factor receptor inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer[J].Clinical lung cancer,2013,14(4):322-332.

    [11] 成撒諾,徐亞麗,戴曉波,等.Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子8在肝細(xì)胞癌中經(jīng)PI3K/Akt通路調(diào)控VEGFA的表達(dá)[J].腫瘤,2016,34(12):1075.

    [12] 鮑嬌琳,陸金健,陳修平,等.苦參堿與氧化苦參堿抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(3):369-373.

    [13] 殷飛,趙軍艷,姚樹坤.苦參堿對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MAPK,JAK—STAT信號(hào)通路的影響[J].腫瘤防治研究,2008,35(2):84-87.

    [14] 陳曉峽,向小慶,葉紅.苦參堿及氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(11):361-364.

    [15] Papadimitrakopoulou V.Development of PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitors and their application in personalized therapy for non-small-cell lung cancer[J].Journal of Thoracic Oncology,2012,7(8):1315-1326.

    (本文編輯: 禹佳)

    StudyontheapoptosismechanismoflungcancerA549cellsinducedbymatrinethroughPI3K/Aktsignalingpathway

    ZHANGXiaowen,CUIChuanbao,ZHANGPingping,etal.

    PharmacologyteachingandresearchsectionofQILUMedicalUnivercity,Zibo255213,China

    Correspondingauthor:ZHANGXiaowen,E-mail:mted12@163.com

    ObjectiveTo explore the apoptosis mechanism of lung cancer A549 cells induced by matrine through PI3K/Akt signaling pathway.MethodsHuman lung cancer A549 cells were cultured, which were divided into control group, low concentration group, middle concentration group and high concentration group. The cells in control group were given normal saline, and the low concentration group, middle concentration group and high concentration group were respectively given matrine with concentrations of 30 mg/L, 60 mg/L, 120 mg/L, and the apoptosis situations of lung cancer A549 cells were detected by flow cytometry and MTT detection, and the growth inhibition rates were calculated, then the PI3K, p-AKT protein and PI3K, AKT mRNA levels were detected by Western Blotting and real time PCR, the differences between the four groups were compared.ResultsThe growth inhibition rates and apoptosis rates of high concentration group, middle concentration group and low concentration group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), which were significant increased with the increasing of concentrations (P<0.05). The levels of PI3K, AKT mRNA and PI3K, p-AKT protein in the high concentration group, middle concentration group and low concentration group were significantly lower than those in the control group (P<0.05), which were significantly decreased with the increasing of concentrations (P<0.05).ConclusionThe matrine can induce the apoptosis of lung cancer A549 cells, and the action mechanism may relate to the PI3K/Akt signaling pathway.

    Lung cancer; A549 cells; Matrine; PI3K/Akt signaling pahway

    山東省高等學(xué)??萍加?jì)劃(J14LM55)

    255213 淄博,齊魯醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室

    張小文(1980- ),女,碩士,講師。研究方向:藥理學(xué)。E-mail:mted12@163.com

    R285.5

    A

    10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.005

    2016-10-27)

    猜你喜歡
    苦參堿低濃度高濃度
    水環(huán)境中低濃度POPs的控制技術(shù)研究進(jìn)展
    高濃度石化污水提標(biāo)改造工程實(shí)例
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:18
    愛眼有道系列之三十二 用低濃度阿托品治療兒童近視,您了解多少
    系列嵌段聚醚在高濃度可分散油懸浮劑的應(yīng)用
    苦參堿對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞增殖和凋亡的影響
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:54
    氧化苦參堿對(duì)SGC7901與ECV304的體外活性比較研究
    維藥苦豆子中苦參堿的提取
    高濃度高氣壓在燒結(jié)用石灰氣力輸送中的應(yīng)用
    雙流體模型在高濃度含沙水流模擬中的應(yīng)用
    改良長效低濃度骶管阻滯用于藥物中期引產(chǎn)43例
    久久久久久大精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| АⅤ资源中文在线天堂| 又粗又爽又猛毛片免费看| 永久网站在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产一区有黄有色的免费视频 | 少妇的逼好多水| 午夜老司机福利剧场| 嘟嘟电影网在线观看| 99久久精品一区二区三区| 国产av码专区亚洲av| 在线观看一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 三级国产精品片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产成人一区二区在线| 国产精品无大码| 日韩强制内射视频| 精品无人区乱码1区二区| 成人一区二区视频在线观看| 欧美精品一区二区大全| 美女黄网站色视频| 亚洲av免费高清在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产毛片a区久久久久| 久久99蜜桃精品久久| 一级毛片电影观看 | 91狼人影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 97超视频在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲综合色惰| 日本一二三区视频观看| 国产色婷婷99| 两个人的视频大全免费| 色哟哟·www| 大香蕉97超碰在线| 国产淫语在线视频| 男人舔奶头视频| 九色成人免费人妻av| 午夜精品在线福利| 中文字幕av在线有码专区| 边亲边吃奶的免费视频| 变态另类丝袜制服| 久久久久性生活片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 免费看a级黄色片| 久久久久久大精品| 如何舔出高潮| 国产精品.久久久| 五月伊人婷婷丁香| 91精品伊人久久大香线蕉| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费无遮挡裸体视频| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲最大成人av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成年女人永久免费观看视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲18禁久久av| 精品国产三级普通话版| 国产黄色小视频在线观看| 色视频www国产| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩精品有码人妻一区| 最近手机中文字幕大全| 日韩一区二区视频免费看| 永久免费av网站大全| 国产亚洲91精品色在线| 久久99热6这里只有精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 精品免费久久久久久久清纯| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久亚洲精品不卡| 99在线视频只有这里精品首页| 99热这里只有是精品50| 日韩欧美 国产精品| 一边亲一边摸免费视频| 韩国高清视频一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产免费视频播放在线视频 | 岛国毛片在线播放| 美女黄网站色视频| 久久人人爽人人片av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产亚洲5aaaaa淫片| 乱人视频在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av中文av极速乱| 激情 狠狠 欧美| 桃色一区二区三区在线观看| 看十八女毛片水多多多| 国产一区亚洲一区在线观看| 成年免费大片在线观看| 看十八女毛片水多多多| 99在线人妻在线中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 特级一级黄色大片| 国产成人91sexporn| 亚洲va在线va天堂va国产| 日本一本二区三区精品| 在线观看av片永久免费下载| 国产亚洲最大av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人一区二区在线| 黄片wwwwww| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 日本欧美国产在线视频| 国产美女午夜福利| a级毛色黄片| 免费黄网站久久成人精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 在线免费观看的www视频| 亚洲最大成人手机在线| 青春草视频在线免费观看| 国产乱人视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产极品精品免费视频能看的| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品蜜桃在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲一区高清亚洲精品| 熟女电影av网| 久久综合国产亚洲精品| 国产在视频线在精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 丰满乱子伦码专区| av线在线观看网站| 午夜福利高清视频| 超碰av人人做人人爽久久| 在线观看一区二区三区| 一本一本综合久久| 国产免费男女视频| 婷婷六月久久综合丁香| 成人性生交大片免费视频hd| 国产毛片a区久久久久| 日日撸夜夜添| 三级毛片av免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产一区有黄有色的免费视频 | 精品久久久久久久久亚洲| 午夜福利在线观看吧| 男女那种视频在线观看| 日韩欧美精品v在线| 久久午夜福利片| 亚洲在线自拍视频| 深夜a级毛片| 一级毛片我不卡| 麻豆一二三区av精品| av播播在线观看一区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲电影在线观看av| 国产视频首页在线观看| 国产在线一区二区三区精 | 男女视频在线观看网站免费| 欧美潮喷喷水| 精品久久久久久电影网 | 精华霜和精华液先用哪个| 美女内射精品一级片tv| 久久这里有精品视频免费| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲五月天丁香| 日韩视频在线欧美| 日韩中字成人| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩综合久久久久久| 少妇的逼好多水| 欧美成人精品欧美一级黄| 最近中文字幕2019免费版| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产麻豆成人av免费视频| 国产在线男女| 伦理电影大哥的女人| 网址你懂的国产日韩在线| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 成人三级黄色视频| 看非洲黑人一级黄片| 欧美一区二区亚洲| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 麻豆一二三区av精品| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 看十八女毛片水多多多| 一级二级三级毛片免费看| 日本三级黄在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩一区二区视频免费看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一本久久精品| 黄色欧美视频在线观看| 国产极品天堂在线| 国产成人a∨麻豆精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩欧美精品v在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产色爽女视频免费观看| 国产黄片美女视频| 国产av在哪里看| 久久这里只有精品中国| 国产成人福利小说| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品一二三区在线看| 国产伦理片在线播放av一区| 婷婷色麻豆天堂久久 | 欧美潮喷喷水| 免费观看在线日韩| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 在线免费观看不下载黄p国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久热精品热| 九九热线精品视视频播放| 日韩一区二区三区影片| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇的逼好多水| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美丝袜亚洲另类| 国产在线男女| 国产精品一区二区性色av| 久久热精品热| 日日撸夜夜添| 一夜夜www| 国产精品熟女久久久久浪| 99久久成人亚洲精品观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成年av动漫网址| 蜜臀久久99精品久久宅男| 禁无遮挡网站| 小说图片视频综合网站| 一区二区三区四区激情视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 在线免费观看不下载黄p国产| 99视频精品全部免费 在线| 视频中文字幕在线观看| 赤兔流量卡办理| 日韩大片免费观看网站 | 亚洲精品自拍成人| 男人和女人高潮做爰伦理| 少妇高潮的动态图| 亚洲内射少妇av| 三级国产精品片| 麻豆一二三区av精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 九色成人免费人妻av| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人精品久久久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久精品夜色国产| 国产午夜精品论理片| 精品国产三级普通话版| 乱系列少妇在线播放| 亚洲国产精品合色在线| av免费在线看不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美人与善性xxx| 91精品国产九色| 特级一级黄色大片| 七月丁香在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国国产精品蜜臀av免费| 国产一级毛片在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲国产欧美人成| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美高清性xxxxhd video| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 只有这里有精品99| videossex国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 村上凉子中文字幕在线| 乱人视频在线观看| 三级毛片av免费| 国产成人一区二区在线| 中文欧美无线码| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产高清三级在线| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲av.av天堂| 六月丁香七月| 直男gayav资源| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产单亲对白刺激| 大香蕉久久网| 亚洲伊人久久精品综合 | 国产淫语在线视频| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 啦啦啦韩国在线观看视频| www.色视频.com| 男人狂女人下面高潮的视频| av播播在线观看一区| 99热6这里只有精品| 国内精品美女久久久久久| 美女内射精品一级片tv| 国产精品一区二区在线观看99 | 大香蕉97超碰在线| 成年版毛片免费区| 免费大片18禁| 欧美日韩国产亚洲二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 老女人水多毛片| 精品久久久久久电影网 | 天堂√8在线中文| 亚洲人成网站高清观看| 精品午夜福利在线看| 国产av一区在线观看免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 韩国av在线不卡| 亚洲精品亚洲一区二区| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 免费av观看视频| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 午夜爱爱视频在线播放| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲怡红院男人天堂| 18禁在线播放成人免费| 国产成人精品一,二区| 免费av不卡在线播放| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 色5月婷婷丁香| 亚洲国产精品专区欧美| 美女内射精品一级片tv| 欧美+日韩+精品| 美女国产视频在线观看| 乱系列少妇在线播放| 国产精品不卡视频一区二区| 久久久成人免费电影| 国产美女午夜福利| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲伊人久久精品综合 | 国产精品国产高清国产av| 99在线人妻在线中文字幕| 九九爱精品视频在线观看| 1000部很黄的大片| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩一区二区视频免费看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品嫩草影院av在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美日本亚洲视频在线播放| 老司机影院成人| 国产黄片美女视频| 久久久久久久午夜电影| 国产乱人偷精品视频| 男人舔奶头视频| 亚洲高清免费不卡视频| 免费人成在线观看视频色| 国产不卡一卡二| 男人和女人高潮做爰伦理| 可以在线观看毛片的网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 69人妻影院| 国产探花在线观看一区二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久久网色| 精品酒店卫生间| 亚洲自偷自拍三级| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜久久久久精精品| 又粗又爽又猛毛片免费看| 激情 狠狠 欧美| 高清在线视频一区二区三区 | 一级二级三级毛片免费看| 欧美97在线视频| 两个人的视频大全免费| 午夜亚洲福利在线播放| 男女那种视频在线观看| 日本午夜av视频| 老司机影院成人| 久久精品国产亚洲av涩爱| 色综合亚洲欧美另类图片| 女人被狂操c到高潮| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一级毛片久久久久久久久女| 国产 一区 欧美 日韩| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 18+在线观看网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 天美传媒精品一区二区| 久久这里有精品视频免费| 色吧在线观看| 久久人人爽人人片av| 全区人妻精品视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久人妻av系列| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费观看人在逋| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 永久网站在线| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲国产精品国产精品| 婷婷色麻豆天堂久久 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费电影在线观看免费观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲自拍偷在线| 韩国av在线不卡| 男的添女的下面高潮视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美97在线视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 午夜爱爱视频在线播放| .国产精品久久| 乱人视频在线观看| 久久久精品大字幕| 日本wwww免费看| 婷婷色av中文字幕| 国产成人精品久久久久久| 插阴视频在线观看视频| 在线观看66精品国产| 欧美一区二区亚洲| 免费观看精品视频网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 日本午夜av视频| 能在线免费观看的黄片| 免费观看在线日韩| 国产精品熟女久久久久浪| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 我要看日韩黄色一级片| 欧美潮喷喷水| 国产成人精品婷婷| 美女被艹到高潮喷水动态| 五月玫瑰六月丁香| 久久久久久久久久久丰满| 日日撸夜夜添| 韩国av在线不卡| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲人成网站高清观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产亚洲精品久久久com| 国语自产精品视频在线第100页| 狠狠狠狠99中文字幕| www.av在线官网国产| 两个人视频免费观看高清| 久久久久久久久中文| 变态另类丝袜制服| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| ponron亚洲| 亚洲精品国产av成人精品| 色5月婷婷丁香| 国产视频首页在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 床上黄色一级片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产午夜福利久久久久久| 精品久久久久久久末码| 国产成人午夜福利电影在线观看| 长腿黑丝高跟| 国产在线一区二区三区精 | 天美传媒精品一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲国产欧美人成| 赤兔流量卡办理| 久久久久久大精品| 久久久久久久久中文| 欧美性猛交黑人性爽| 99久久精品一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品电影一区二区三区| 床上黄色一级片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品爽爽va在线观看网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 天美传媒精品一区二区| 搞女人的毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美日本视频| 欧美性猛交黑人性爽| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品一及| av黄色大香蕉| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 高清毛片免费看| 最近最新中文字幕免费大全7| 成人美女网站在线观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产在视频线在精品| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品伦人一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| 婷婷色麻豆天堂久久 | 一级黄色大片毛片| 一区二区三区乱码不卡18| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品久久久久久av不卡| 老司机影院毛片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 黄色一级大片看看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国内精品一区二区在线观看| 国产免费视频播放在线视频 | 国产乱人视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 91久久精品电影网| 麻豆成人午夜福利视频| 1000部很黄的大片| 能在线免费观看的黄片| 日韩精品青青久久久久久| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品自拍成人| 成年免费大片在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 久久久久久久久中文| 性色avwww在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美97在线视频| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩av不卡免费在线播放| 国产乱人偷精品视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年女人看的毛片在线观看| 极品教师在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 在线a可以看的网站| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 岛国毛片在线播放| 热99re8久久精品国产| 高清日韩中文字幕在线| av在线亚洲专区| 好男人在线观看高清免费视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产午夜精品一二区理论片| 最近手机中文字幕大全| 亚洲成人精品中文字幕电影| 天堂网av新在线| 国产免费视频播放在线视频 | 欧美性感艳星| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 在线免费观看的www视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 成人午夜高清在线视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 内地一区二区视频在线| 亚洲av福利一区| 日韩欧美在线乱码| 国产免费视频播放在线视频 | 一个人免费在线观看电影| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲图色成人| 综合色丁香网| 成人综合一区亚洲| 日韩av在线大香蕉| 国产av在哪里看| 青春草视频在线免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久午夜欧美精品| 国产高清三级在线| 亚洲国产精品成人综合色| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产色婷婷99| 国产精品久久视频播放| 深夜a级毛片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 男插女下体视频免费在线播放| 国产极品天堂在线| 国产高清三级在线| 一个人观看的视频www高清免费观看|