安全劑雙苯惡唑酸對水稻精惡唑禾草靈藥害的解毒效應

孫潤紅，徐俊蕾，楊麗榮，張 潔，夏明聰，武 超，薛保國*，吳 坤

(1.河南省農業(yè)科學院 植物保護研究所/河南省農作物病蟲害防治重點實驗室/農業(yè)部華北南部農作物有害生物綜合治理重點實驗室/河南省作物保護國際聯合實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南農業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002)

安全劑雙苯惡唑酸對水稻精惡唑禾草靈藥害的解毒效應

孫潤紅1，徐俊蕾1，楊麗榮1，張 潔1，夏明聰1，武 超1，薛保國1*，吳 坤2*

(1.河南省農業(yè)科學院 植物保護研究所/河南省農作物病蟲害防治重點實驗室/農業(yè)部華北南部農作物有害生物綜合治理重點實驗室/河南省作物保護國際聯合實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南農業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002)

為了解安全劑雙苯惡唑酸緩解除草劑精惡唑禾草靈對水稻藥害的效果，通過溫室水培和盆栽法研究雙苯惡唑酸對水稻精惡唑禾草靈藥害的解毒效果，并對其解毒機制進行初步探討。結果表明：水稻萌發(fā)期，粳稻和秈稻在0.25、0.5、1 μg/mL精惡唑禾草靈處理下，解毒效果最好的安全劑添加比例分別為1∶1、1∶5、1∶5，粳稻株高、胚根長的抑制率比精惡唑禾草靈單獨使用分別降低18.07、37.50，26.56、34.94，41.30、37.50個百分點，秈稻株高、胚根長的抑制率分別降低23.31、42.33，27.22、34.91，46.76、31.14個百分點；水稻兩至三葉期，粳稻和秈稻在25、100 μg/mL精惡唑禾草靈處理下，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)活性最高的安全劑添加比例均為1∶1，此時粳稻的GST活性和ACCase活性比精惡唑禾草靈單獨使用分別增加42.21%和65.63%、46.72%和140.43%，秈稻的GST活性和ACCase活性比精惡唑禾草靈單獨使用分別增加52.18%和105.71%、55.55%和169.52%。安全劑雙苯惡唑酸提高了精惡唑禾草靈處理后水稻幼苗中GST、ACCase活性，減輕了精惡唑禾草靈對水稻的傷害，為水稻生產中通過添加雙苯惡唑酸降低精惡唑禾草靈對水稻的藥害提供了依據。

雙苯惡唑酸； 精惡唑禾草靈； 粳稻； 秈稻； 解毒作用； 谷胱甘肽-S-轉移酶； 乙酰輔酶A羧化酶

水稻是我國的主要糧食作物，在國家糧食安全中有著舉足輕重的地位。由于水稻生長在高溫多雨的夏季，雜草發(fā)生嚴重，化學除草是目前水稻種植過程中必不可少的管理措施。然而，長期使用除草劑之后，部分雜草抗藥性越來越強，千金子、稗草等抗性雜草的發(fā)生越來越嚴重，成為水稻田惡性雜草，十分難以防治[1-3]。為了解決生產上稻田稗草抗藥性和千金子等禾本科雜草防除問題，一些農藥生產廠家將旱地防治禾本科雜草的除草劑精惡唑禾草靈用于水稻田。

精惡唑禾草靈屬環(huán)氧基苯氧基丙酸酯類除草劑，主要抑制脂肪酸合成的關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)，對稗草、馬唐、狗尾草、鄉(xiāng)麥娘、硬草、野燕麥等禾本科雜草有很好的藥效，在大豆等雙子葉作物生產中廣泛使用，其對禾本科作物不安全，但加入安全劑后也可以用于小麥田防除禾本科雜草[4-5]。有報道表明，在日本、印度、馬來西亞和中美洲，精惡唑禾草靈已用于水稻田除草[6-9]，我國也有將精惡唑禾草靈用于水稻田的報道[10-11]，但也有一些報道表明，精惡唑禾草靈對水稻的藥害嚴重，能引起水稻黃化、生長抑制，甚至死亡[12-13]。

安全劑又稱解毒劑或保護劑，可以在不影響除草劑對靶標雜草活性的前提下有選擇地保護作物免受除草劑的藥害，提高對作物的安全性，在化學除草應用中日益發(fā)揮著重要作用[14]。雙苯惡唑酸，即S-4-(苯氧基丁基)-N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯，是由安萬特公司研究開發(fā)的異唑類安全劑，不僅可以提高作物的耐藥性，也可以用來解決難除雜草的防除問題，主要用于防除玉米田間1年及常年生雜草等[15]。為了解雙苯惡唑酸能否同樣減輕精惡唑禾草靈對水稻的傷害，采用溫室水培和盆栽法研究了雙苯惡唑酸對精惡唑禾草靈的解毒效果，初步探討了雙苯惡唑酸保護水稻免受精惡唑禾草靈藥害的作用機制，為水稻生產中通過添加安全劑雙苯惡唑酸降低除草劑精惡唑禾草靈對水稻的藥害提供依據。

1 材料和方法

1.1供試材料

供試粳稻(鄭稻18)由河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所水稻室提供；供試秈稻(秈稻9113)由信陽市農業(yè)科學研究所提供。

1.2試劑和儀器

試劑：95%精惡唑禾草靈原藥(杭州宇龍化工有限公司)、雙苯惡唑酸(Sigma公司)、丙酮(天津天力化學試劑公司)、0.1% 吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司)、二甲基亞砜(青島生工生物科技有限公司)。

儀器：紫外分光光度計(上海精科儀器有限公司)、低溫離心機(賽默飛世爾科技有限公司)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)、ACCase試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1 水稻萌發(fā)期雙苯惡唑酸對精惡唑禾草靈的解毒效果試驗 將水稻種子放入燒杯中，加入自來水至完全淹沒種子，置于室溫中浸泡過夜，之后將水稻種子置于鋪有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫培養(yǎng)，待水稻發(fā)芽，挑選芽長一致的種子備用。取100 mL燒杯，加入250 g石英砂和60 mL不同質量濃度梯度的藥液(精惡唑禾草靈的質量濃度分別為0.25、0.5、1 μg/mL，雙苯惡唑酸的添加比例分別為1∶0、1∶0.04、1∶0.2、1∶1、1∶5、1∶25)，以清水為對照(CK)，接入發(fā)芽的水稻種子，用保鮮膜封口，置于室溫培養(yǎng)3 d后，調查粳稻和秈稻的胚根長，培養(yǎng)6 d后，調查粳稻和秈稻的株高，分別計算抑制率。每個處理設3次重復，數據采用 DPS 7.0軟件進行處理和方差分析。

1.3.2 水稻幼苗期雙苯惡唑酸對GST和ACCase活性的影響試驗 室內盆栽培養(yǎng)粳稻和秈稻幼苗，待水稻生長到兩至三葉時，噴施不同質量濃度梯度的藥液(精惡唑禾草靈的質量濃度分別為25、100 μg/mL，雙苯惡唑酸的添加比例分別為1∶0、1∶0.2、1∶1、1∶5)，以清水為對照(CK)，每個處理設3次重復。施藥5 d后，取各處理的水稻葉片0.1 g，分別按照GST試劑盒和ACCase試劑盒說明書進行操作，于340、660 nm測定吸光度，計算GST、ACCase的活性。

2 結果與分析

2.1雙苯惡唑酸對萌發(fā)期水稻生長的影響

由表1、表2可以看出，隨著精惡唑禾草靈質量濃度的增大，其對粳稻和秈稻株高及胚根長的抑制率逐漸增大。0.25、0.5、1 μg/mL精惡唑禾草靈處理對粳稻株高的抑制率分別為31.69%、45.76%、62.28%，對粳稻胚根長的抑制率分別為65.63%、72.44%、83.24%；對秈稻株高的抑制率分別為38.65%、47.52%、69.17%，對秈稻胚根長的抑制率分別為69.69%、74.53%、80.31%。

注：Iso為雙苯惡唑酸，Fen為精惡唑禾草靈；同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

精惡唑禾草靈質量濃度相同時，添加不同比例雙苯惡唑酸各處理之間對精惡唑禾草靈的解毒效果存在差異。當精惡唑禾草靈質量濃度為0.25 μg/mL時，雙苯惡唑酸添加比例為1∶1對其解毒效果最好，對粳稻株高、胚根長的抑制率分別為13.62%、28.13%，分別比0.25 μg/mL精惡唑禾草靈處理降低18.07、37.50個百分點；對秈稻株高、胚根長的抑制率分別為15.34%、27.36%，分別比0.25 μg/mL精惡唑禾草靈處理降低23.31、42.33個百分點。當精惡唑禾草靈質量濃度為0.5 μg/mL時，雙苯惡唑酸添加比例為1∶5對其解毒效果最好，對粳稻株高、胚根長的抑制率分別為19.20%、37.50%，分別比0.5 μg/mL精惡唑禾草靈處理降低26.56、34.94個百分點，對秈稻株高、胚根長的抑制率分別為20.30%、39.62%，分別比0.5 μg/mL精惡唑禾草靈處理降低27.22、34.91個百分點。當精惡唑禾草靈質量濃度為1 μg/mL時，雙苯惡唑酸添加比例為1∶5對其解毒效果最好，對粳稻株高、胚根長的抑制率分別為20.98%、45.74%，分別比1 μg/mL精惡唑禾草靈處理降低41.30、37.50個百分點，對秈稻株高、胚根長的抑制率分別為22.41%、49.17%，分別比1 μg/mL精惡唑禾草靈處理降低46.76、31.14個百分點。

綜合而言，添加不同比例雙苯惡唑酸后，降低了精惡唑禾草靈對水稻生長的抑制作用，減輕了精惡唑禾草靈對水稻的傷害。

表2 精惡唑禾草靈處理中添加不同比例雙苯惡唑酸對萌發(fā)期秈稻生長的影響

2.2雙苯惡唑酸對水稻幼苗體內GST活性的影響

從圖1可以看出，當精惡唑禾草靈的質量濃度為25、100 μg/mL時，粳稻體內GST活性分別為3.272、3.016 μmol/(min·mg)，分別比對照[4.752 μmol/(min·mg)]降低 31.14%、36.53%；秈稻體內GST活性分別為3.927、3.685 μmol/(min·mg)，分別比對照[6.124 μmol/(min·mg)]降低35.88%、39.83%。

Fen、Iso后的數字表示處理所用藥劑的質量濃度(μg/mL)，下同圖1 精惡唑禾草靈處理中添加不同比例雙苯惡唑酸對水稻幼苗體內GST活性的影響

添加不同比例雙苯惡唑酸后，水稻體內GST活性均有所增加。精惡唑禾草靈質量濃度為25 μg/mL條件下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶0.2、1∶1、1∶5時，粳稻體內GST活性分別為3.948、4.653、4.592 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加20.67%、42.21%、40.34%；秈稻體內GST活性分別為4.774、5.976、5.743 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加21.57%、52.18%、46.24%。精惡唑禾草靈質量濃度為100 μg/mL條件下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶0.2、1∶1、1∶5時，粳稻體內GST活性分別為3.742、4.425、4.368 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加24.07%、46.72%、44.83%；秈稻體內GST活性分別為4.515、5.732、5.537 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加22.52%、55.55%、50.26%。

隨著精惡唑禾草靈處理質量濃度的增大，粳稻和秈稻GST活性呈降低的趨勢，而添加不同比例的雙苯惡唑酸，使得GST活性增加，催化谷胱甘肽與精惡唑禾草靈發(fā)生軛合，從而減輕了精惡唑禾草靈對水稻生長的影響。精惡唑禾草靈不同質量濃度處理下，添加雙苯惡唑酸的比例為1∶1時，GST活性最高。相比較而言，添加不同比例的雙苯惡唑酸藥液噴施5 d后，秈稻內GST的活性變化總體上較粳稻劇烈，表明添加雙苯惡唑酸后，秈稻對雙苯惡唑酸產生了更強烈的應激反應。

2.3雙苯惡唑酸對水稻幼苗體內ACCase活性的影響

從圖2可以看出，當精惡唑禾草靈的質量濃度為25、100 μg/mL時，粳稻體內ACCase活性分別為0.678、0.465 μmol/(min·mg)，分別比對照[1.230 μmol/(min·mg)]降低 44.88%、62.20%；秈稻體內ACCase活性分別為0.542、0.374 μmol/(min·mg)，分別比對照[1.215 μmol/(min·mg)]降低55.39%、69.22%。

圖2 精惡唑禾草靈處理中添加不同比例雙苯惡唑酸對水稻幼苗體內ACCase活性的影響

添加不同比例雙苯惡唑酸后，水稻體內ACCase活性均有所增加。精惡唑禾草靈質量濃度為25 μg/mL條件下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶0.2、1∶1、1∶5時，粳稻體內ACCase活性分別為0.874、1.123、1.116 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加28.91%、65.63%、64.60%；秈稻體內ACCase活性分別為0.782、1.115、1.004 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加44.28%、105.71%、85.24%。精惡唑禾草靈質量濃度為100 μg/mL條件下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶0.2、1∶1、1∶5時，粳稻體內ACCase活性分別為0.752、1.118、1.107 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加61.72%、140.43%、138.06%；秈稻體內ACCase活性分別為0.523、1.008、0.999 μmol/(min·mg)，分別比精惡唑禾草靈單獨使用增加39.84%、169.52%、167.11%。

施用不同質量濃度的精惡唑禾草靈后，水稻體內ACCase活性均大幅度下降，且隨著精惡唑禾草靈處理質量濃度的升高呈降低的趨勢。添加不同比例的雙苯惡唑酸，使得ACCase活性增加，減輕了精惡唑禾草靈對水稻生長的影響。精惡唑禾草靈不同質量濃度處理下，添加雙苯惡唑酸的比例為1∶1時，ACCase活性最高。

3 結論與討論

本研究結果表明，添加不同比例的雙苯惡唑酸，降低了精惡唑禾草靈對水稻生長的抑制作用，減輕了精惡唑禾草靈對水稻的傷害。在水稻萌發(fā)期，0.25 μg/mL精惡唑禾草靈處理下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶1對其解毒效果最好，粳稻株高、胚根長的抑制率比精惡唑禾草靈單獨使用分別降低18.07、37.50個百分點，秈稻株高、胚根長的抑制率分別降低23.31、42.33個百分點；0.5 μg/mL精惡唑禾草靈處理下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶5對其解毒效果最好，粳稻株高、胚根長的抑制率比精惡唑禾草靈單獨使用分別降低26.56、34.94個百分點，秈稻株高、胚根長的抑制率分別降低27.22、34.91個百分點；1 μg/mL精惡唑禾草靈處理下，雙苯惡唑酸添加比例為1∶5對其解毒效果最好，粳稻株高、胚根長的抑制率比精惡唑禾草靈單獨使用分別降低41.30、37.50個百分點，秈稻株高、胚根長的抑制率分別降低46.76、31.14個百分點。因此，在水稻生產中應合理安排精惡唑禾草靈與安全劑雙苯惡唑酸的比例。

安全劑的作用機制在過去幾十年來一直受到人們的廣泛關注，但作用機制仍未闡明。結構活性論(QSAR)、細胞色素P450單氧化酶催化的羥基化理論以及谷胱甘肽軛合論是最為普遍的機制解釋[16-18]。其中，谷胱甘肽軛合論指出，安全劑主要通過增加GSH含量及提高GST活性來軛合除草劑的有毒代謝物，從而減輕或消除其毒害[14]。精惡唑禾草靈的作用靶標是脂肪酸合成的關鍵酶ACCase，因此，ACCase活性的變化也可以作為衡量安全劑對精惡唑禾草靈解毒作用的重要指標。本研究中，在水稻兩至三葉期，25、100 μg/mL精惡唑禾草靈處理下，添加不同比例雙苯惡唑酸后，粳稻和秈稻體內GST和ACCase活性均有所增加，GST和ACCase活性最高的雙苯惡唑酸添加比例均為1∶1。該添加比例下，25 μg/mL精惡唑禾草靈處理時，粳稻和秈稻GST活性比精惡唑禾草靈單獨使用分別增加42.21%、52.18%，ACCase活性比精惡唑禾草靈單獨使用分別增加65.63%、105.71%；100 μg/mL精惡唑禾草靈處理時，粳稻和秈稻GST活性比精惡唑禾草靈單獨使用分別增加46.72%、55.55%，ACCase活性比精惡唑禾草靈單獨使用分別增加140.43%、169.52%。

安全劑作為一種增強除草劑除草效果又保護農作物免受除草劑藥害的化合物，具有廣闊的發(fā)展前景及開發(fā)應用市場。由于安全劑的作用機制還不十分清楚，因此，從分子水平上研究安全劑的作用機制，結合生理生化學研究除草劑和安全劑對作物的影響迫在眉睫。

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Detoxification Effect of Safener Isoxadifen-ethyl in Protecting Rice from the Phytotoxicity of Fenoxaprop-P-ethyl

SUN Runhong1,XU Junlei1,YANG Lirong1,ZHANG Jie1,XIA Mingcong1,WU Chao1,XUE Baoguo1*,WU Kun2*

(1.Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Region of North China,Ministry of Agriculture/International Joint Research Laboratory for Crop Protection of Henan,Zhengzhou 450002,China;2.College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

The detoxification effect of isoxadifen-ethyl safener on fenoxaprop-P-ethyl was studied by hydroponics-culture and pot-culture in the greenhouse,in order to know whether isoxadifen-ethyl safener could alleviate the injury of fenoxaprop-P-ethyl on rice,and the detoxification mechanism was preliminarily analyzed.In rice germination,the best addition ratios of isoxadifen-ethyl for detoxification in japonica and indica rice under 0.25,0.5,1 μg/mL fenoxaprop-P-ethyl were 1∶1,1∶5,1∶5 respectively,the inhibition rates of plant height and radicle length were reduced by 18.07 and 37.50,26.56 and 34.94,41.30 and 37.50 percentage points compared to the fenoxaprop-P-ethyl alone treatment for japonica rice respectively,and were reduced by 23.31 and 42.33,27.22 and 34.91,46.76 and 31.14 percentage points for indica rice respectively.And in the 2—3 leaf stage,the best addition ratios of isoxadifen-ethyl in japonica and indica rice for the highest GST activity and ACCase activity under 25,100 μg/mL fenoxaprop-P-ethyl were both 1∶1,the GST and ACCase activities of japonica rice were increased by 42.21% and 65.63%,46.72% and 140.43% compared with the fenoxaprop-P-ethyl alone treatment,and the GST and ACCase activities of indica rice were increased by 52.18% and 105.71%,55.55% and 169.52% compared with the fenoxaprop-P-ethyl alone treatement.Therefore，isoxadifen-ethyl safener could increase GST and ACCase activities of rice treated by fenoxaprop-P-ethyl，and alleviate the injury of fenoxaprop-P-ethyl on rice as a whole,which provides the basis in rice production that adding isoxadifen-ethyl safener can reduce the damage of fenoxaprop-P-ethyl to rice.

isoxadifen-ethyl； fenoxaprop-P-ethyl； japonica rice； indica rice； detoxification effect； GST； ACCase

2017-03-03

河南省農業(yè)科學院科研發(fā)展專項資金項目(201513117)；河南省博士后基金科研資助項目(2015107)

孫潤紅(1976-)，女，河南孟津人，助理研究員，博士，主要從事植物病害綜合防治研究。 E-mail：sunrunhong_2007@163.com

*通訊作者：薛保國(1957-)，男，河南汝南人，研究員，博士，主要從事分子微生物學研究。E-mail：13613714411@163.com 吳 坤( 1963-)，男，河南平輿人，教授，主要從事微生物研究。E-mail：wukun63@126.com

S511；S451.2

： A

： 1004-3268(2017)09-0067-06