群體和單細(xì)胞微囊藻對(duì)短期溫度變化的生理響應(yīng)

付小麗 向 蓉 董聰聰 張紅波 施軍瓊 吳忠興

(西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市三峽庫(kù)區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

群體和單細(xì)胞微囊藻對(duì)短期溫度變化的生理響應(yīng)

付小麗 向 蓉 董聰聰 張紅波 施軍瓊 吳忠興

(西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市三峽庫(kù)區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

為了探索短期溫度變化對(duì)群體微囊藻和單細(xì)胞微囊藻的影響, 在室內(nèi)受控模擬條件下研究了在10℃、25℃和35℃三個(gè)溫度梯度下, 群體和單細(xì)胞微囊藻對(duì)短期溫度變化的生理響應(yīng)。研究表明: 與對(duì)照組25℃相比, 在10℃培養(yǎng)下, 微囊藻葉綠素濃度顯著降低, SOD活性和死亡率均顯著增加。與群體微囊藻相比, 在10℃下單細(xì)胞微囊藻葉綠素濃度顯著下降, Fv/Fm下降, SOD活性顯著增加。在35℃培養(yǎng)下, 單細(xì)胞微囊藻葉綠素濃度上升, 死亡率和SOD活性增加, 而群體微囊藻則呈現(xiàn)出葉綠素濃度和死亡率降低, CAT活性增加。結(jié)果表明短期的溫度變化影響了群體和單細(xì)胞微囊藻生理機(jī)制, 與單細(xì)胞微囊藻相比, 群體更能適應(yīng)短期的溫度脅迫, 導(dǎo)致其更具優(yōu)勢(shì)。

群體和單細(xì)胞微囊藻; 溫度; 生理響應(yīng); 藍(lán)藻水華

近年來(lái), 由于湖泊、河流的氮、磷含量增加,加劇了水體富營(yíng)養(yǎng)化過(guò)程, 引起藍(lán)藻水華的大量暴發(fā)并打破了水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡[1]。藍(lán)藻水華的發(fā)生, 不僅影響了水生生態(tài)系統(tǒng), 也影響了人類的健康[2,3]。在眾多報(bào)道的藍(lán)藻水華種類中, 微囊藻是最常見(jiàn)的水華藍(lán)藻之一, 其分布廣泛, 持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),且一些種類產(chǎn)生的微囊藻毒素引起了許多的生態(tài)環(huán)境和人類健康問(wèn)題[4—7], 因此, 對(duì)微囊藻水華的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[8,9]。溫度是影響生物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子, 研究表明, 水華季節(jié)演替主要依賴溫度、光照等物理?xiàng)l件[10,11]。目前, 人們已經(jīng)把溫度作為監(jiān)測(cè)和預(yù)報(bào)水華的一個(gè)關(guān)鍵因素[12]。在許多淡水微囊藻的研究中, 溫度歷來(lái)作為一個(gè)重要的環(huán)境因子[13]。微囊藻的生長(zhǎng)和光合作用受到各種不同的環(huán)境因子的影響, 其中溫度是最重要的影響因子之一[14]。已研究表明, 在一定范圍內(nèi)溫度的上升, 可以促進(jìn)微囊藻的生長(zhǎng), 但超過(guò)35℃微囊藻的生長(zhǎng)和光合作用就會(huì)受到抑制[25,29],因此, 研究溫度的變化對(duì)微藻的影響有著重要的理論和實(shí)際意義。

在自然環(huán)境條件下微囊藻主要是以群體形式存在, 然而, 當(dāng)其分離到實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng), 群體微囊藻往往解聚為單細(xì)胞的形式[15]。目前對(duì)微囊藻的生理研究主要以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的單細(xì)胞微囊藻為材料, 因而不能很好反映自然條件下微囊藻的生理生化特征。研究已表明在群體微囊藻解聚的過(guò)程中可能引起其生理生化指標(biāo)及其抗性的改變, 且群體微囊藻在光合作用和抵御不利條件均表現(xiàn)出與單細(xì)胞微囊藻不同的特性[16,17]。然而, 群體和單細(xì)胞微囊藻對(duì)溫度的響應(yīng)并未見(jiàn)報(bào)道。因此, 本研究比較了群體微囊藻和單體微囊藻在短期不同溫度培養(yǎng)下的生理生化響應(yīng), 旨在探究不同形態(tài)大小微囊藻對(duì)短期不同溫度的響應(yīng)機(jī)制, 為闡明微囊藻水華的形成及發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻株來(lái)源和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用藻種來(lái)源于中科院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB-collection), 各藻株的相關(guān)特征信息如表 1所示。藻株的培養(yǎng)條件為: 光強(qiáng)25 μE/ (m2·s), 溫度(25±1)℃, 光周期12h:12h。當(dāng)藻株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí), 藻液經(jīng)離心后, 獲得對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞, 然后加入新鮮的BG11培養(yǎng)液, 置溫度為10℃、25℃和35℃下, 持續(xù)培養(yǎng)48h, 其中25℃為對(duì)照組。每個(gè)處理實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

表 1 實(shí)驗(yàn)中所用銅綠微囊藻藻株信息Tab. 1 Information on Microcystis aeruginosa in this study

1.2 葉綠素含量和可溶性蛋白的測(cè)定

葉綠素用80%丙酮于4℃抽提24h, 離心后, 上清液用分光光度計(jì)測(cè)定663 nm的光吸收值, 通過(guò)公式Chl.a (mg/L)=12.19×A663計(jì)算得到葉綠素含量?？偟目扇苄缘牡鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定[18], 以小牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)分析

用浮游植物熒光分析儀(PHYTO-PAM, Waltz公司, 德國(guó))測(cè)定藻細(xì)胞的最大光化學(xué)效率, 測(cè)定方法參照Maxwell等[19]方法。

1.4 抗氧化物酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)的活性根據(jù)Aebi[20]所描述的方法測(cè)定。計(jì)算公式為CAT=(Am–As)/(0.1* V*1*Cp), Am指最大吸光度, As指樣品吸光度, V指提取酶液總體積mL, Cp指蛋白質(zhì)濃度mg/mL。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性根據(jù)Dhindsa等[21]光化還原氧化法進(jìn)行測(cè)定。酶活性采用SOD=[(Amax–A560)/Amax]/0.5公式計(jì)算。

1.5 細(xì)胞死亡率

所有樣品經(jīng)FDA (Fluorescein diacetate)染色后,用流式細(xì)胞儀(Epics Altra Coulter, Beckman, USA)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。群體微囊藻的處理及FCM測(cè)定步驟見(jiàn)Wu等[16]方法, 其中FCM激發(fā)光為488 nm,檢測(cè)熒光為505—545 nm[22]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行, 數(shù)據(jù)處理和分析均在SPSS 16.0中進(jìn)行, 采用方差分析和多重比較(LSD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, P＜0.05為顯著性差異, P＜0.01為極顯著差異。作圖引入“對(duì)比值”, 對(duì)比值=(實(shí)驗(yàn)組–對(duì)照組)/對(duì)照組×100%, 所得數(shù)據(jù)采用EXCEL及Orgin8.6進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下群體和單細(xì)胞微囊藻葉綠素含量變化

與對(duì)照組25℃相比, 在10℃條件下處理48h后,微囊藻葉綠素濃度均下降。單細(xì)胞微囊藻7806、905和942的Chl.a含量隨溫度下降顯著(P＜0.05,圖 1), 分別減少了32.8%、25.9%和35.7%; 小群體微囊藻907和909的Chl.a含量分別降低了40%和44.9%, 下降顯著(P＜0.01); 大群體微囊藻938的Chl.a含量則減少了7.1%; 與群體微囊藻相比, 單細(xì)胞微囊藻葉綠素濃度顯著下降(P＜0.01)。在35℃條件下處理48h后, 微囊藻葉綠素濃度變化有差異, 單細(xì)胞微囊藻7806、905和942的Chl.a含量隨溫度升高而分別增加了20%、20.1%和48.4%; 小群體群體微囊藻907和909隨溫度升高分別降低了11.8%和9.4%, 而大群體微囊藻938則降低了32.1%。與單細(xì)胞微囊藻相比, 群體微囊藻葉綠素濃度顯著降低(P＜0.01)。

圖 1 群體和單細(xì)胞微囊藻的葉綠素含量對(duì)比值

2.2 不同溫度下群體和單細(xì)胞微囊藻最大光合效率(Fv/Fm)的變化

不同溫度培養(yǎng)48h后, 通過(guò)比較微囊藻的最大光合效率(Fv/Fm)表明: 10℃時(shí), 單細(xì)胞微囊藻7806、942和905分別下降了8.7%, 12.8%和43.6%;小群體微囊藻907和909分別上升9.0%和9.1%, 大群體微囊藻938下降23.5%; 與小群體微囊藻相比, 單細(xì)胞和大群體微囊藻顯著降低(P＜0.01, 圖 2)。35℃時(shí), 單細(xì)胞微囊藻7806、942和905分別上升8.7%, 下降8.5%和上升2.6%; 小群體微囊藻907和909分別上升22.7%, 上升5.5%, 而大群體則下降17.6%, 與單細(xì)胞和大群體微囊藻相比, 小群體微囊藻顯著增加(P＜0.05)。

圖 2 群體和單細(xì)胞微囊藻的Fv/Fm對(duì)比值

2.3 群體和單細(xì)胞微囊藻的抗氧化酶活性的變化

對(duì)群體和單細(xì)胞微囊藻的超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)分析表明, 群體微囊藻和單細(xì)胞微囊藻在應(yīng)對(duì)短期溫度變化方面有明顯的差異。如上圖 3a所示, 10℃時(shí), SOD酶活性在微囊藻中表現(xiàn)為顯著增加(P＜0.01)。單細(xì)胞微囊藻7806、942和905分別上升了3.8倍, 4.6倍及1.6倍, 小群體微囊藻907和909分別上升8.9倍和1.3倍, 大群體938上升2.9倍, 單細(xì)胞與群體之間與群體之間差異顯著(P＜0.01)。35℃時(shí), 單細(xì)胞微囊藻7806、942和905分別下降78%, 上升30.6%及下降68.2%,小群體微囊藻907和909分別下降55.4%, 56%, 大群體938下降54.3%(圖 3a), 單細(xì)胞與群體之間差異顯著(P＜0.01)。

如上圖 3b所示, 通過(guò)對(duì)微囊藻的CAT酶活性比較分析表明, 微囊藻CAT對(duì)短期不同溫度也有不同的變化趨勢(shì): 10℃時(shí), 單細(xì)胞微囊藻7806、942和905分別下降67%, 下降35%, 上升115%, 小群體微囊藻907和909分別下降16.1%, 上升118%, 大群體938下降13.7%; 單細(xì)胞和群體均上升顯著(P＜0.05);單細(xì)胞與群體之間差異顯著(P＜0.01)。35℃時(shí), 單細(xì)胞微囊藻7806、942和905分別上升87%, 上升27.7%, 下降38.2%; 小群體微囊藻907和909分別上升110%和上升99%, 大群體上升8.3%; 群體較單細(xì)胞上升幅度大(圖 3b)。單細(xì)胞與群體907、909差異顯著(P＜0.05)與群體938、差異極顯著(P＜0.01)。

圖 3 群體和單細(xì)胞微囊藻的SOD和CAT對(duì)比值

2.4 群體和單細(xì)胞微囊藻細(xì)胞死亡率的變化

如表 2所示, 處理48h后, 死亡率均有上升, 10℃死亡率最高, 而25℃和35℃死亡率低。與單細(xì)胞微囊藻相比, 群體較單細(xì)胞死亡率低, 差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

3.1 不同溫度對(duì)兩種形態(tài)微囊藻葉綠素含量的影響

微囊藻的生長(zhǎng)和光合作用受到各種不同的環(huán)境因子的影響, 其中溫度是最重要的影響因子之一[13]。銅綠微囊藻喜好高溫, 在30—35℃時(shí)生長(zhǎng)最佳, 在水溫30℃條件時(shí)細(xì)胞密度最大, 而溫度低于20℃時(shí)生長(zhǎng)明顯受抑制[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖 1):在10℃時(shí), 微囊藻葉綠素含量呈下降趨勢(shì)。單細(xì)胞和小群體顯著下降, 大群體不顯著下降, 群體和單細(xì)胞呈現(xiàn)出差異顯著, 說(shuō)明實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)微囊藻單細(xì)胞和群體都有影響, 且對(duì)單細(xì)胞的影響更大。微囊藻群體的形態(tài)隨季節(jié)而變化, 它們?cè)谇锛净蚴嵌灸芤誀I(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的形式集積在底泥中, 俗稱為“越冬體”[23]。在10℃條件下形成的大群體可能就是微囊藻的越冬體, 以此來(lái)抵御不利條件, 在條件適宜的時(shí)候就會(huì)恢復(fù)到原來(lái)的代謝活力。此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。在35℃時(shí), 微囊藻葉綠素含量有所變化, 單細(xì)胞微囊藻葉綠素含量均上升, 而小群體微囊藻葉綠素含量顯著下降, 大群體不顯著下降(圖 1), 群體和單細(xì)胞大部分差異顯著。單細(xì)胞葉綠素的上升, 則暗示了短期高溫并不影響單細(xì)胞微囊藻生長(zhǎng)和繁殖。劉玉生等[24]的研究表明: 在35℃時(shí), 銅綠微囊藻生長(zhǎng)達(dá)到最大增殖后, 馬上開(kāi)始沉淀, 綠色消退, 溶液呈乳白色。銅綠微囊藻對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣, 在15—40℃溫度內(nèi)銅綠微囊藻均可生長(zhǎng), 當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí), 銅綠微囊藻停止生長(zhǎng)并逐漸死亡[25]。

表 2 溫度對(duì)群體和單細(xì)胞微囊藻細(xì)胞死亡率的影響Tab. 2 The effects of different temperatures on the mortality rates (%) of colonial and single-celled Microcystis

3.2 不同溫度對(duì)兩種形態(tài)微囊藻PSII的影響

溫度是影響藍(lán)藻生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子, 影響藻細(xì)胞的酶活性及生長(zhǎng)代謝速率。黃仿等[26]研究了熱脅迫對(duì)等鞭藻的作用機(jī)制, 結(jié)果表明熱脅迫能導(dǎo)致Fv/Fm、Fv/2的值明顯下降, 說(shuō)明PSII中心電子傳遞受阻。微囊藻光合作用對(duì)高溫比較敏感, 高溫可使類囊體膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[27], 本研究發(fā)現(xiàn): 在10℃時(shí), 6種微囊藻的Fv/Fm中, 單細(xì)胞和大群體下降, 單細(xì)胞與大群體之間差異顯著(圖 2)。Fv/Fm值下降說(shuō)明微囊藻受到低溫脅迫, 在一定溫度范圍內(nèi),溫度較低時(shí), 細(xì)胞膜的運(yùn)輸和呼吸代謝功能都會(huì)受到影響[28]。為了應(yīng)對(duì)脅迫微囊藻可能通過(guò)降低代謝活動(dòng)以維持群體機(jī)體活動(dòng)抵御不良環(huán)境。在35℃時(shí), 微囊藻大部分呈上升趨勢(shì), 單細(xì)胞和小群體上升, 大群體呈下降趨勢(shì), 單細(xì)胞與大部分群體差異顯著(圖 2)。Sayed和El-shahed[29]的研究中表明: 當(dāng)溫度為25—35℃, 小球藻(Chlorella vulgaris)的Fv/Fm、Fv/2值均隨溫度的升高而增大, 在35—40℃時(shí)達(dá)到最大隨后開(kāi)始下降。Fv/Fm值隨試驗(yàn)溫度的升高而增加, 說(shuō)明溫度升高對(duì)微囊藻的PSII電子傳遞起到促了進(jìn)作用, 而高溫也可能對(duì)光和系統(tǒng)的酶活性起到抑制作用, 出現(xiàn)不同程度的下降, 亦或高溫對(duì)類囊體膜結(jié)構(gòu)有損傷, 具體原因還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。單細(xì)胞和小群體的熒光值上升, 表明了其電子傳遞受到促進(jìn), 能量消耗增加, 不利于其長(zhǎng)期的生長(zhǎng)和繁殖[24]。

3.3 兩種形態(tài)微囊藻對(duì)不同溫度的響應(yīng)

3.4 不同溫度對(duì)兩種形態(tài)微囊藻存活率的變化

本研究對(duì)群體和單細(xì)胞微囊藻的存活率進(jìn)行了比較(表 2), 發(fā)現(xiàn)短期不同溫度處理后, 微囊藻細(xì)胞的存活率仍然較高, 群體和單細(xì)胞之間差異顯著;在35℃下微囊藻活力并未被破壞或抑制, 進(jìn)一步證實(shí)了微囊藻能耐受較高的溫度。與單細(xì)胞相比, 大小群體微囊藻細(xì)胞表現(xiàn)出較低的死亡率, 其原因可能是由于群體微囊藻能產(chǎn)生大量的SOD和CAT來(lái)清除高溫造成的損傷, 亦或是群體微囊藻, 特別是大群體通過(guò)降低自身代謝活性來(lái)應(yīng)對(duì)短期高溫。水華發(fā)生與微囊藻細(xì)胞在水體表層的聚集有很大的關(guān)系。通過(guò)自身的浮力, 來(lái)獲取光能, 得到充足的營(yíng)養(yǎng)鹽, 使得它們?cè)谂c其他藻類競(jìng)爭(zhēng)時(shí)具有明顯的優(yōu)勢(shì)[31,32]。Yamamoto等[33]通過(guò)實(shí)際湖泊調(diào)查認(rèn)為, 大群體在水華形成過(guò)程中起著非常重要的作用。在大量聚集的情況下形成群體形態(tài)更易于使其保持漂浮狀態(tài), 從而造成水華暴發(fā)。在本實(shí)驗(yàn)中,在面對(duì)不同溫度變化時(shí), 群體表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。這也與野外觀測(cè)相符。

綜上所述, 微囊藻能耐受較高的溫度, 單細(xì)胞微囊藻的葉綠素更耐高溫, 群體高溫死亡率低, 較單細(xì)胞有更大的生存優(yōu)勢(shì), 這種優(yōu)勢(shì)與水華生消可能具有一定的相關(guān)性, 水華發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程, 并不是單一因素的效應(yīng), 還需進(jìn)一步的研究。

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THE PHYSIOLOGICAL RESPONSE OF COLONIAL AND SINGLE-CELLED FORM OF MICROCYSTIS TO SHORT-TERM TEMPERATURE CHANGES

FU Xiao-Li, XIANG Rong, DONG Cong-Cong, ZHANG Hong-Bo, SHI Jun-Qiong and WU Zhong-Xing
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region (Ministry of Education), Chongqing Key Laboratory of Plant Ecology and Resources Research in Three Gorges Reservoir Region, Southwest University, Chongqing 400715, China)

To investigate the effect of short-term temperature changes on the colonial and single-cell Microcysis forms, physiological responses were determined after it was cultured at 10℃, 25℃, and 35℃. The results demonstrated that a decline in chlorophyll-a and an increase in superoxide dismutase (SOD) and mortality rates were found when Microcystis was cultured at 10℃ when compared to those cultured at 25℃. Significant decreases in chlorophyll-a and Fv/Fmwere observed in the Microcystis single-cell form in contrast to the colonial form, while SOD activity significantly increased when Microcystis was inoculated at 10℃. After culturing at 35℃, chlorophyll-a, mortality rate, and SOD levels significantly increased in single-cell Microcystis, however, a significant decrease in chlorophyll-a and mortality rates and a significant increase in catalase activity was found in colonial Microcystis. The results suggested that short-term temperature stress could affect physiological mechanisms in colonial and single-cell Microcystis. However, colonial Microcystis showed more advantages in adapting to short-term temperature stress than the single-cell form.

Colonial and single-celled Microcysis; Temperature; Physiological response; Cyanobacterial bloom

Q178.1

A

1000-3207(2017)05-1091-06

10.7541/2017.136

2016-10-31;

2017-02-14

中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(XDJK2016C111); 西南大學(xué)博士基金(SWU110065)資助 [Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016C111); Doctoral Found Project of China SWU (SWU110065)]

付小麗(1989—), 女, 甘肅慶陽(yáng)人; 碩士研究生; 主要從事藻類生理學(xué)研究。E-mail: FUxlxd@163.com

吳忠興(1975—), 男, 教授; 主要從事藻類生理生態(tài)及分子系統(tǒng)性學(xué)研究。E-mail: wuzhx@swu.edu.cn