異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中濃度近紅外預(yù)測(cè)模型的建立

郭宇飛，石 拓，徐慶陽(yáng)

(1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中濃度近紅外預(yù)測(cè)模型的建立

郭宇飛1，石 拓2，徐慶陽(yáng)2

(1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

利用近紅外分析儀和相關(guān)近紅外軟件，建立谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程中異亮氨酸質(zhì)量濃度的近紅外預(yù)測(cè)模型.結(jié)合偏最小二乘法，在波數(shù)為7 400～9 100 cm-1，減去一條直線作為光譜預(yù)處理的條件下，獲得異亮氨酸質(zhì)量濃度最優(yōu)近紅外預(yù)測(cè)模型.該模預(yù)測(cè)偏差(RPD)為3.36，交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)為1.73 g/L，決定系數(shù)(R2)為0.997.通過(guò)外部驗(yàn)證，該模型能夠較好地檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中異亮氨酸的質(zhì)量濃度.

近紅外；預(yù)測(cè)模型；異亮氨酸；谷氨酸棒桿菌

在發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)中，實(shí)時(shí)了解發(fā)酵過(guò)程中目的產(chǎn)物、底物、菌體濃度以及副產(chǎn)物的信息，對(duì)于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程控制來(lái)說(shuō)具有極其重要的意義，這不僅能夠在發(fā)酵過(guò)程中穩(wěn)定每批次目的產(chǎn)物產(chǎn)量，而且還能夠提高每批次發(fā)酵產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)器的利用率[1].另外，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物會(huì)降低目的產(chǎn)物的合成，而使得目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率降低，造成能源的浪費(fèi).再者，在發(fā)酵過(guò)程中由于溶氧電極、pH電極等設(shè)備發(fā)生異常后，造成發(fā)酵參數(shù)改變，很難實(shí)時(shí)了解發(fā)酵過(guò)程情況，可能會(huì)出現(xiàn)目的產(chǎn)物減少、副產(chǎn)物增加，甚至導(dǎo)致發(fā)酵失敗的情況.建立一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中各組分含量的方法，對(duì)于實(shí)現(xiàn)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)控制是非常必要的[2].

近紅外光譜檢測(cè)具有對(duì)樣品無(wú)損傷、快速、安全和無(wú)需前處理等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物、化工和礦業(yè)等領(lǐng)域.另外，作為一種二級(jí)分析方法，近紅外光譜結(jié)合多元校正模型可以實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)測(cè)定，因此在發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)和自動(dòng)控制方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[3-4].為了更有效地提取近紅外光譜包含的信息，必須對(duì)光譜進(jìn)行相應(yīng)的處理以消除或減少噪音的影響.常用的光譜預(yù)處理方法包括一階導(dǎo)數(shù)(First derivative，1st)、二階導(dǎo)數(shù)(Second derivative，2nd)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(Standard normal variate，SNV)、多元散色校正(Multivariate scatter correction，MSC)、小波變換(Wavelet transform，WT)和傅里葉變換(Fourier transform，F(xiàn)T)等[5-6].

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Tensor 37近紅外分析儀，德國(guó)Bruker儀器公司；OPUS 7.0近紅外分析軟件，德國(guó)Bruker儀器公司；高效液相色譜，日本島津公司(SHIMADZU, LC-20AT).

1.2 菌 株

L-異亮氨酸產(chǎn)生菌WYJ1，由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院代謝工程研究室篩選并保藏.

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌時(shí)間20 min.

1.3.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L，玉米漿40 mL/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，VH0.5 mg/L，VB10.2 mg/L，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌15 min.

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g/L，玉米漿20 mL/L，豆餅水解液20 mL/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·H2O 30 mg/L，K2HPO43 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 30 mg/L，VH0.3 mg/L，VB10.3 mg/L，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌15 min.

1.3.4 種子培養(yǎng)條件

從培養(yǎng)一定時(shí)間的含有異亮氨酸生產(chǎn)菌的斜面上刮一滿環(huán)菌苔，分別接種于3 瓶1 000 mL的三角瓶中(每瓶含100 mL種子培養(yǎng)基)，在32 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)14 h.

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件

將3 個(gè)三角瓶中的種子培養(yǎng)液按照體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入到5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中總體積為3 L.發(fā)酵溫度為32 ℃，以體積分?jǐn)?shù)25%的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的pH值，控制pH值在7.0左右，發(fā)酵周期為40 h.

1.4 發(fā)酵液中氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

發(fā)酵液中異亮氨酸質(zhì)量濃度用高效液相色譜進(jìn)行分析測(cè)定.色譜的分離條件：Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，衍生劑為2,4-二硝基氟苯，衍生方法為柱前衍生，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)50%的乙腈(去離子水配制)和4.1 g/L的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流動(dòng)相流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm.

1.5 異亮氨酸質(zhì)量濃度近紅外預(yù)測(cè)模型的建立

1.5.1 樣品采集

在谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)異亮氨酸過(guò)程中，從發(fā)酵4 h時(shí)開(kāi)始，每30 min用10 mL EP管收集發(fā)酵液樣品，并將收集好的樣品于-80 ℃下保存，用于異亮氨酸質(zhì)量濃度的檢測(cè)和近紅外光譜的掃描.

1.5.2 近紅外光譜掃描

將1 mL發(fā)酵液樣品加入2 mm的石英比色杯中，利用Tensor 37近紅外掃描儀在波數(shù)4 000～12 000 cm-1處對(duì)發(fā)酵液樣品進(jìn)行掃描(在掃描過(guò)程中，以去離子水作為掃描背景，掃描次數(shù)為64 次).

1.5.3 近紅外光譜前處理

對(duì)采集得到的發(fā)酵液樣品近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，利用OPUS 7.0軟件進(jìn)行分析預(yù)處理，光譜的預(yù)處理方法主要包括以下幾種：一階導(dǎo)數(shù)(Firstderivative，1st)、二階導(dǎo)數(shù)(Second derivative，2nd)、矢量歸一化(Vector normalization，SNV)、多元散射校正(Multiplicative scatter correction，MSC)、最小-最大歸一化(Min-max normalization)、減去一條直線(Straight line subtraction)、1st+SNV、1st+MSC和1st+減去一條直線等[7-9].

1.5.4 近紅外校正模型的建立[10]

采用偏最小二乘(Partial least-squares，PLS)的方法建立谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程中異亮氨酸質(zhì)量濃度的校正模型.以交叉檢驗(yàn)(Cross-validation)的方法作為模型的檢驗(yàn)方法，此種檢驗(yàn)方法適用于樣品數(shù)量較少或適中的樣品模型的建立.在OPUS 7.0分析軟件中，按照一定比例將發(fā)酵液樣品分為校正集和檢驗(yàn)集，且校正集的樣品數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于檢驗(yàn)集的樣品數(shù)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 異亮氨酸原始近紅外光譜

發(fā)酵過(guò)程中選取的發(fā)酵液樣品(共180 個(gè))采用Tensor 37 Bruker近紅外分析儀在4 000～12 000 cm-1處掃描后采集的原始光譜如圖1所示.從整體光譜圖來(lái)看：發(fā)酵液樣品在7 400～9 100 cm-1處光譜較為平整且穩(wěn)定，能夠充分體現(xiàn)樣品間差異，有利于提取光譜和濃度相關(guān)性的有效信息；雖然4 000～7 400 cm-1和7 400～10 500 cm-1也有吸收峰，但是吸收峰不穩(wěn)定且沒(méi)有規(guī)律，有效信息提取比較困難，特征光譜變量也難以利用，不適合建立校正模型.因此首選在7 400～9 100 cm-1建立校正模型.

2.2 樣品的劃分

采用軟件OPUS 7.0對(duì)180 個(gè)樣品進(jìn)行分析，分為校正集(134 個(gè))和檢驗(yàn)集(46 個(gè))，見(jiàn)表1.校正集和檢驗(yàn)集的樣品濃度范圍、平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)評(píng)價(jià)校正模型的可靠性和準(zhǔn)確性非常重要.一般要求校正集范圍應(yīng)包括檢驗(yàn)集范圍，但不能超過(guò)校正模型預(yù)測(cè)范圍.本論文校正集異亮氨酸質(zhì)量濃度為0.84～35.12 g/L，檢驗(yàn)集為0.98～33.46 g/L，符合要求.另外，校正集和檢驗(yàn)集的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)該比較接近，保證所選樣品均勻分布，此處選擇的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差差別較小.

圖1 異亮氨酸原始近紅外光譜Fig.1 Original NIR spectra of isoleucine

樣品分類樣品數(shù)/個(gè)質(zhì)量濃度/(g·L-1)平均數(shù)/(g·L-1)標(biāo)準(zhǔn)差/(g·L-1)模型校正集(Calibrationset)1340．84～35．1212．656．46外部檢驗(yàn)集(Validationset)460．98～33．4611．927．44

2.3 異亮氨酸質(zhì)量濃度近紅外預(yù)測(cè)模型的建立

采用近紅外分析軟件OPUS 7.0，分別在全波長(zhǎng)和7 400～9100 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)選擇原始光譜和不同光譜預(yù)處理的方法建立異亮氨酸質(zhì)量濃度PLS最優(yōu)校正模型，模型各參數(shù)結(jié)果如表2所示.結(jié)果表明：在相同光譜預(yù)處理?xiàng)l件下7 400～9 100 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)所建立模型RMSECV值均小于全波長(zhǎng)，這說(shuō)明全波長(zhǎng)可能存在一些噪音，噪音對(duì)模型預(yù)測(cè)效果有一定的影響.當(dāng)光譜預(yù)處理為減去一條直線時(shí)，相比其他預(yù)處理RMSECV值最小為1.73 g/L，決定系數(shù)達(dá)到0.997，選擇該模型為優(yōu)化后的校正模型.

表2 不同光譜預(yù)處理的異亮氨酸質(zhì)量濃度模型

異亮氨酸模型校正集和檢驗(yàn)集各參數(shù)見(jiàn)表3.用偏最小二乘法建模時(shí)，要注意維數(shù)的選擇，維數(shù)過(guò)多將導(dǎo)致過(guò)擬合現(xiàn)象；反之，維數(shù)過(guò)少將導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力差.如圖2所示，隨著維數(shù)的增加，RMSECV值逐漸降低；當(dāng)維數(shù)為9時(shí)，RMSECV值為1.73 g/L；當(dāng)維數(shù)進(jìn)一步增大時(shí)，RMSECV雖有所降低，但是降低幅度小.因此模型校正集的維數(shù)確定為9.

表3 異亮氨酸質(zhì)量濃度的PLS校正模型

圖2 異亮氨酸質(zhì)量濃度模型維數(shù)與RMSECV關(guān)系Fig.2 Relationship of the number of latent variables and RMSECV in the isoleucine concentration model

在PLS模型的樣品校正集和檢驗(yàn)集中，異亮氨酸質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)值與實(shí)際值比較如圖3所示.其中校正集的RMSECV為1.73 g/L，擬合方程：y=0.997 2x+0.015 6，R2=0.997，偏移量為0.147；檢驗(yàn)集RMSEP為1.82 g/L，其擬合方程為y=0.986 8x+0.045 1，R2=0.992，偏移量為0.241.表3中異亮氨酸PLS模型校正集的RPD值為3.36.以上都說(shuō)明該P(yáng)LS模型具有很好的預(yù)測(cè)能力.

2.4 異亮氨酸質(zhì)量濃度近紅外預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建模型的預(yù)測(cè)能力，以谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)異亮氨酸的發(fā)酵液作為該模型的外部檢驗(yàn)對(duì)所建模型進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示.雖然預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間存在著一定誤差，但從異亮氨酸近紅外模型對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的預(yù)測(cè)情況分析，所得預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的總體趨勢(shì)基本相同，可用于檢驗(yàn)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程中異亮氨酸質(zhì)量濃度的變化.

圖3 校正集和檢驗(yàn)集中異亮氨酸質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)值和實(shí)際值 Fig.3 Predicted and experimental concentration of isoleucine in calibration and validation set

圖4 谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程中異亮氨酸質(zhì)量濃度曲線Fig.4 Concentration curve of isoleucine in Corynebacterium glutamicun fermentation

3 結(jié) 論

對(duì)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)異亮氨酸過(guò)程中異亮氨酸質(zhì)量濃度進(jìn)行近紅外分析，成功建立了谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)異亮氨酸質(zhì)量濃度的近紅外模型.通過(guò)外部檢驗(yàn)，驗(yàn)證了所建模型的準(zhǔn)確性.說(shuō)明該模型可以用于預(yù)測(cè)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程中異亮氨酸的質(zhì)量濃度變化，同時(shí)為谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程控制提供了理論依據(jù).筆者建立的異亮氨酸質(zhì)量濃度近紅外預(yù)測(cè)模型是基于5 L發(fā)酵罐發(fā)酵中的異亮氨酸質(zhì)量濃度，所選樣品數(shù)量有限，之后的研究可以進(jìn)一步增加樣品數(shù)，從而完善預(yù)測(cè)模型，使所建模型更加準(zhǔn)確.發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物濃度近紅外預(yù)測(cè)模型的建立對(duì)于發(fā)酵過(guò)程控制有著重要意義，尤其是多種產(chǎn)物濃度近紅外模型的建立，將大大提高產(chǎn)物的檢測(cè)效率，為發(fā)酵過(guò)程的自動(dòng)化控制提供有力幫助.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Establishment of near-infrared prediction model of concentration in the isoleucine fermentation

GUO Yufei1, SHI Tuo2, XU Qingyang2

(1.Tianjin Modern Vocational Technology College, Tianjin 300350, China; 2.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The near-infrared spectrum scanning analysis was carried out using near infrared analyzer and related software, and the optimal prediction model for isoleucine concentration was established using near-infrared spectroscopy combining with partial least squares method under conditions of a straight line minus at wavenumber between 7 400 cm-1and 9 100 cm-1. The value of root mean square error of cross validation (RMSECV), determination coefficient (R2) and residual prediction error (RPD) was 1.73 g/L, 0.997 and 3.36, respectively. Through external validation, the model could well predict the concentration of isoleucine in the fermentation process.

near-infrared; prediction model; isoleucine;Corynebacteriumglutamicun

2017-04-24

郭宇飛(1962—)，女，江蘇連云港人，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)榉治鰴z測(cè)，E-mail：yufeiguo@sina.com.通信作者：徐慶陽(yáng)副研究員，E-mail: xuqingyang@tust.edu.cn.

TQ922

A

1674-2214(2017)03-0138-05