HPLC-MS/MS法在骨髓移植患者全血CSA及AM1濃度測定中的應(yīng)用

王 磊，劉紅星，孫文利

(河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院臨床藥理室，河北廊坊 065201)

·技術(shù)與方法·

HPLC-MS/MS法在骨髓移植患者全血CSA及AM1濃度測定中的應(yīng)用

王 磊，劉紅星△，孫文利

(河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院臨床藥理室，河北廊坊 065201)

目的 建立同時測定骨髓移植患者全血環(huán)孢素A(CSA)及AM1濃度的HPLC-MS/MS法，探索CSA及其主要代謝產(chǎn)物AM1在個體內(nèi)及個體間的關(guān)系，為臨床合理選用CSA血藥濃度監(jiān)測方法提供可靠依據(jù)。方法 采用環(huán)孢素D(CSD)作內(nèi)標(biāo)，全血樣品經(jīng)含內(nèi)標(biāo)甲醇沉淀蛋白處理。色譜柱為Ultimate XB-C18，柱溫65 ℃，流動相為含0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨的水和含0.1%甲酸的甲醇，梯度洗脫。質(zhì)譜檢測方式為電噴霧離子阱正離子模式，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描，監(jiān)測CSA 1 219.9～1 203.1 m/z，AM1 1 236.1～1 219.1 m/z，CSD 1 234.0～1 217.0 m/z。結(jié)果 CSA濃度在16～1 600 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=0.014 3X+0.021 3(r=0.997 6)；AM1濃度在10～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=0.003 63X-0.005 28(r=0.997 3)。CSA與AM1個體間比率(AM1/CSA)范圍為32%～356%；CSA與AM1個體內(nèi)比率(AM1/CSA)范圍為27%～147%。結(jié)論 建立了同時檢測CSA及AM1的HPLC-MS/MS法；CSA在骨髓移植患者個體間及個體內(nèi)代謝存在變異；HPLC-MS/MS法可用于臨床骨髓移植患者全血CSA濃度的監(jiān)測。

環(huán)孢素A；AM1；液質(zhì)聯(lián)用；藥物監(jiān)測

環(huán)孢素A(cyclosporine,CSA)是由11個氨基酸組成的環(huán)狀多肽，其相對分子質(zhì)量為1 203.63×103，主要與體內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶(多基因親環(huán)蛋白)結(jié)合，發(fā)揮免疫抑制活性，廣泛應(yīng)用于骨髓移植患者。在體內(nèi)通過氧化和結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生至少30種代謝產(chǎn)物[1-3]，其代謝產(chǎn)物總體活性小于CSA活性的14%；AM1為CSA在體內(nèi)代謝的第一代代謝產(chǎn)物，也是其主要的代謝產(chǎn)物，其活性至少比CSA活性低30倍；AM1C及AM1A為其次生代謝產(chǎn)物及半合成產(chǎn)物；AM1在個體間的變異較大，在個體內(nèi)的變異目前尚無詳細(xì)數(shù)據(jù)可查，對其研究就顯得尤為必要[4-7]。使用CSA治療需要監(jiān)測血藥濃度，其劑量調(diào)整取決于血藥濃度水平及移植后間隔時間。由于CSA治療窗窄，其口服制劑具有很高的變異率，臨床主要通過監(jiān)測其血藥濃度谷值來調(diào)整患者給藥劑量，達(dá)到較好的免疫抑制效果[8-9]。

目前CSA血藥濃度監(jiān)測方法較多，主要有EMIT、RIA、FPIA、HPLC、Elecsys、CMIA及HPLC-MS/MS。EMIT、RIA、FPIA、Elecsys及CMIA為免疫法，均存在免疫交叉反應(yīng)，只是免疫交叉反應(yīng)強弱不同[10-12]；而HPLC和HPLC-MS/MS法不存在免疫交叉反應(yīng)，其只檢測CSA母體藥物本身[10-15]。由于HPLC法檢測CSA血藥濃度需要分離CSA的各種代謝產(chǎn)物，耗時較長，同時其檢測靈敏度較低，不利于臨床快速、準(zhǔn)確地檢測CSA血藥濃度；而HPLC-MS/MS法是根據(jù)待測物分子量的不同而實行檢測，不需分離CSA各種代謝產(chǎn)物，其檢測耗時較短，靈敏度較高，可滿足臨床快速、準(zhǔn)確檢測CSA血藥濃度的需要[13-15]。本文建立同時測定CSA和AM1在全血中濃度的HPLC-MS/MS法，同時對CSA在骨髓移植患者體內(nèi)代謝進行研究，進而為臨床選用CSA血藥濃度檢測方法提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1) CSA與AM1個體間代謝研究：選擇前來本科室監(jiān)測CSA血藥濃度的骨髓移植患者20例，其中男12例，女8例，患者年齡3～45歲，平均22.5歲，骨髓移植后時間未知。每位患者于清晨8：00服藥前，抽取靜脈血2 mL，應(yīng)用專用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管進行抗凝，應(yīng)用HPLC-MS/MS法進行全血CSA及AM1濃度檢測。(2)CSA與AM1個體內(nèi)代謝研究：選擇前來本科室監(jiān)測CSA血藥濃度的骨髓移植患者潘某，女，年齡5歲，診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，共收集其用于監(jiān)測CSA血藥濃度全血標(biāo)本16份，同時用HPLC-MS/MS方法進行全血CSA及AM1濃度檢測。

1.2 儀器設(shè)備 島津20A高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，配有AB Sciex 4000Qtrap質(zhì)譜儀，Analyst V1.5.2工作站(美國AB公司)；其林貝爾渦旋混合器(上海坤肯生物化工有限公司)，全自動高速冷凍離心機(Thermo Fisher公司)。

1.3 試劑 甲醇(HPLC級,美國Fisher公司)，屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏有限公司)；甲酸、乙酸銨(HPLC 級,MREDA Technology有限公司)；CSA(HPLC 級,美國Sigma公司)；AM1、環(huán)孢素D(Cyclosporin D,HPLC級,加拿大Toronto Research公司)。

1.4 方法

1.4.1 液相色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×150.0 mm,5 μm)，柱溫65 ℃；流速：0.8 mL/min；流動相：2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液(B)-0.1%甲酸甲醇溶液(A)，進樣量5 μL；洗脫方式：梯度洗脫，其中0.01～0.50 min，A相濃度從50%～100%，保持3.5～4.4 min，A相濃度從100%～50%，保持3.6 min。

表1 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)；離子極性：正離子模式；監(jiān)測模式為MRM；離子噴射電壓：5 000 V；溫度：325 ℃；GS1：60；GS2：55；Curtain gas：20；碰撞氣壓力：Medium；用于定量分析的離子反應(yīng)：CSA 1 219.9～1 203.1 m/z，AM1 1 236.1～1 219.1 m/z，CSD 1 234.0～1 217.0 m/z；各種質(zhì)譜條件參數(shù)如表1

1.4.2 樣品處理方法 精密量取樣本全血100 μL置于1.5 mL EP管中，然后加入100 mol/L硫酸鋅溶液100 μL，渦旋振蕩0.5 min，再加入25 ng/mL CSD 300 μL，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液150 μL置于自動進樣器。

1.4.3 專屬性 在上述色譜質(zhì)譜條件下，CSA、CSD及AM1的保留時間分別為3.70、3.82和3.82 min。血樣中的內(nèi)源性物質(zhì)對CSA、CSD及AM1的測定無干擾?？疾炝?份不同的空白全血，結(jié)果表明，流動相和空白全血中的雜質(zhì)均不干擾樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰，且峰形良好。見圖2。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別在7個1.5 mL EP管中加入空白全血90 μL，并加入10 μL CSA和AM1各系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到CSA為16、40、80、160、400、800、1 600 ng/mL和AM1為10、25、50、100、250、500、1 000 ng/mL系列質(zhì)量濃度。按“1.4.2”項下樣品處理方法處理后進樣測定，以CSA峰面積與CSD峰面積比值為(Y)對CSA濃度(X)進行線性回歸，擬合方式為加權(quán)最小二乘法，得CSA標(biāo)準(zhǔn)曲線；以AM1峰面積與CSD峰面積比值為(Y)對AM1濃度(X)進行線性回歸，擬合方式為加權(quán)最小二乘法，得AM1標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗 分別在18個1.5 mL EP管中加入空白全血90 μL，并加入含有CSA和AM1 2、3、5號系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各10 μL，得CSA對照品各濃度為40、80、400 ng/mL；AM1對照品各濃度為25、50、250 ng/mL，每個系列濃度6份樣品。每個濃度樣品各取3份按“1.4.2”項下血樣處理方法處理后置于4 ℃冰箱中，于放置時間72 h測定各樣品的濃度；其余樣品于4 ℃冰箱中放置72 h后取出放至室溫，按“1.4.2”項下樣品處理方法處理后進樣測定，考察其穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 色譜質(zhì)譜行為 在“1.4.1”項下的色譜質(zhì)譜條件下，測得CSA、AM1、CSD二級碎片離子質(zhì)譜圖，見圖1；CSA、AM1、CSD質(zhì)譜色譜圖見圖2。由圖2可見，CSA、AM1、CSD各個峰型良好，無雜質(zhì)峰干擾，專屬性較好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 分別以CSD為內(nèi)標(biāo)，CSA峰面積與CSD峰面積比值為(Y)對CSA濃度(X)進行線性回歸，得CSA的回歸方程：Y=0.014 3X+0.021 3(r=0.997 6)，表明CSA在16～1 600 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，可用于定量，其最低檢測限為0.4 ng/mL；AM1峰面積與CSD峰面積比值為(Y)對AM1濃度(X)進行線性回歸，得AM1的回歸方程：Y=0.003 63X-0.005 28(r=0.997 3)，表明AM1在10～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，可用于定量,其最低檢測限為0.1 ng/mL。

A:CSA;B:AM1;C:CSD質(zhì)譜圖

圖1 CSA、AMI、CSD質(zhì)譜圖

A:空白全血;B:空白全血+AM1+CSA+CSD;C:患者血樣+CSD

圖2 CSA,AM1和CSD色譜圖

2.3 回收率和精密度試驗結(jié)果 CSA和AM1的回收率和日內(nèi)、日間精密度測定結(jié)果如表2。CSA和AM1相對回收率為95.26%～106.35%，絕對回收率79.84%～90.35%，絕對回收率比相對回收率低，存在基質(zhì)效應(yīng)，但回收率都大于70%，均符合藥典分析定量要求，該方法可用于定量分析。同時，日內(nèi)及日間精密度均小于5%，說明該方法重現(xiàn)及重復(fù)性好，較穩(wěn)定。

表2 CSA和AM1精密度和回收率結(jié)果(n=3)

2.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果 由表3可知，在4 ℃條件下，血中CSA和AM1放置72 h濃度稍微下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；血樣經(jīng)過處理后，在4 ℃條件下，放置72 h CSA和AM1濃度基本保持不變。由此可以得出，在此條件下測定血中CSA和AM1濃度的穩(wěn)定性良好，能保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于CSA為多肽類藥物，本身性質(zhì)較穩(wěn)定，不易降解，又由于臨床血藥濃度監(jiān)測的及時性，故本實驗只研究了4 ℃條件下的72 h穩(wěn)定性，可滿足臨床標(biāo)本的檢測。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果

2.5 CSA與AM1個體間代謝檢測結(jié)果 20例患者全血標(biāo)本進行HPLC-MS/MS檢測，對數(shù)據(jù)進行散點分析，結(jié)果如圖3；以個體內(nèi)AM1/CSA為研究對象進行比率分析，結(jié)果如圖4、5。由圖3、4可知，AM1與CSA在個體間的代謝無相關(guān)性；由圖5可見AM1/CSA的比率范圍為32%～356%，平均值為147%。表明CSA在骨髓移植患者個體間代謝存在差異，代謝產(chǎn)物的量和比例不定，造成用免疫法檢測CSA濃度時，不同患者的免疫交叉反應(yīng)程度不同，質(zhì)譜法檢測結(jié)果與免疫法檢測結(jié)果差別較大，二者無固定的換算系數(shù)。

2.6 CSA與AM1個體內(nèi)代謝檢測結(jié)果 對2016年3月11日至2016年4月10日潘某的CSA全血標(biāo)本進行回顧性檢測分析，對其檢測結(jié)果進行比率分析和散點分析，結(jié)果如圖6、7。由圖6、7可見，AM1/CSA比率范圍為27%～147%，波動較大，表明CSA在骨髓移植患者個體內(nèi)代謝存在差異，代謝產(chǎn)物的量和比例不確定，造成用免疫法檢測CSA濃度時，同一患者的免疫交叉反應(yīng)程度不同，質(zhì)譜法檢測結(jié)果與免疫法檢測結(jié)果存在較大差別，二者無固定的換算系數(shù)。

圖3 AM1和CSA離散分析(n=20)

圖4 AM1/CSA相關(guān)性分析

圖5 AM1/CSA比率分析

圖6 AM1和CSA比率分析

圖7 AM1和CSA離散分析

3 討 論

CSA廣泛應(yīng)用于骨髓移植患者，由于CSA治療窗窄，其濃度受移植后時間和其他藥物代謝的影響顯著，并且患者需長期服藥，CSA血藥濃度監(jiān)測就顯得尤為重要。同時，CSA口服生物利用度約為30%，主要經(jīng)肝臟代謝，代謝產(chǎn)物種類眾多、比例各異，決定了臨床醫(yī)師對CSA血藥濃度檢測方法的選擇。CSA濃度檢測方法較多，有HPLC、RIA、FPIA、CMIA和HPLC-MS/MS法等，不同的CSA血藥濃度檢測方法所測得的CSA血藥濃度水平不同，影響臨床醫(yī)師和臨床藥師對CSA結(jié)果的解讀，進而影響患者的治療，因此臨床醫(yī)師和臨床藥師在分析CSA結(jié)果時應(yīng)該注意檢測方法，各實驗室在發(fā)放檢測結(jié)果時也應(yīng)注明檢測方法，利于臨床對結(jié)果進行分析，準(zhǔn)確調(diào)整患者藥物劑量，使骨髓移植患者應(yīng)用CSA劑量更為合理，降低毒性反應(yīng)和排斥反應(yīng)的發(fā)生，提高患者的生存率。

本實驗建立同時測定骨髓移植患者CSA及AM1血藥濃度的HPLC-MS/MS法，能快速、準(zhǔn)確及高靈敏地檢測全血中CSA及AM1濃度。采用CSD作內(nèi)標(biāo)，通過七水硫酸鋅裂解紅細(xì)胞，用甲醇沉淀蛋白處理樣品，線性良好，適于臨床應(yīng)用血藥濃度監(jiān)測。同時，該處理方法簡單，易操作和重復(fù)，用于CSA和AM1母體藥物測定準(zhǔn)確度高，特異性強。

AM1為CSA眾多代謝產(chǎn)物中含量較多的一種代謝產(chǎn)物，通過檢測AM1與CSA在個體間及個體內(nèi)的變化，可為CSA血藥濃度監(jiān)測方法的選擇提供依據(jù)。由本文可知，AM1與CSA在骨髓移植患者個體間及個體內(nèi)比例各異，進一步推測可知CSA代謝產(chǎn)物的比例在個體間及個體內(nèi)代謝存在偏倚，并且CSA代謝產(chǎn)物的活性各異，免疫法如RIA、FPIA、CMIA均存在不同程度的免疫交叉反應(yīng)，使CSA測量結(jié)果偏高，偏高的程度與CSA代謝產(chǎn)物的種類和量有關(guān)。因此，CSA母體藥物的準(zhǔn)確檢測就顯得非常必要，而HPLC-MS/MS不僅能準(zhǔn)確檢測CSA母體藥物含量而且耗時較短，能滿足臨床快速檢測的需求。

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The application of HPLC-MS/MS method in the determination of whole blood concentration of Cyclosporine A and AM1 in bone marrow transplant patient

WangLei,LiuHongxing△,SunWenli

(ClinicalPharmacologyLaboratory,HebeiYandaLuDaopeiHospital,Langfang,Hebei065201,China)

Objective To develop a HPLC-MS/MS method for determination of cyclosporin A(CSA)and AM1 in bone marrow transplant patient,and explore the relationship of CSA and its main metabolite AM1 within individual and between individuals,and provide reliable basis for clinical rational use of monitoring in CSA blood drug concentration.Methods CSD was used as internal standard,and whole blood samples were treated with internal standard methanol precipitated protein.The column was Ultimate XB-C18 with a column temperature of 65 ℃ and the mobile phase was eluted with 0.1% of formic acid and 2 mmol/L ammonium acetate in water and methanol containing 0.1% formic acid.The mass spectrometry was detected by electrospray ion trap positive ion mode,MRM scanning,monitoring CSA 1 219.9 to 1 203.1 m/z,AM1 1 236.1 to 1 219.1 m/z,CSD 1 234.0 to 1 217.0 m/z.Results The concentration of CSA was linear in the range of 16 to 1 600 ng/mL,Y=0.014 3X+0.021 3(r=0.997 6).The concentration of AM1 was linear in the range of 10～1 000 ng/mL,Y=0.003 63X-0.005 28(r=0.997 3).The ratio of CSA to AM1 (AM1/CSA) between individual ranged from 32% to 356%.The ratio of CSA to AM1 within indiviolual(AM1/CSA) ranged from 27% to 147%.Conclusion HPLC-MS/MS method for the simultaneous detection of CSA and AM1 was established.The variation of CSA exists in the bone marrow transplant patient between individuals and within individual;the HPLC-MS/MS method can be used for monitoring of whole blood concentration of CSA in bone marrow transplant patients.

cyclosporin A;AM1;HPLC-MS/MS;drug monitoring

王磊(1984-)，執(zhí)業(yè)藥師，碩士，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究工作。

△通信作者，E-mail:lhongxing@outlook.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.021

R699.2

A

1671-8348(2017)23-3234-04

2016-04-09

2017-05-09)