應(yīng)用噬菌體生物擴(kuò)增法對HIV/TB雙重感染患者抗結(jié)核藥耐藥性分析研究

何茂銳,向明確△,羅 誼,廖 兵,萬榮珍,龍泉鑫,陳作芬，邱 嬡

(1.重慶市第九人民醫(yī)院感染科 400700；2.重慶市第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 400700；3.重慶醫(yī)科大學(xué) 400016)

應(yīng)用噬菌體生物擴(kuò)增法對HIV/TB雙重感染患者抗結(jié)核藥耐藥性分析研究

何茂銳1,向明確1△,羅 誼2,廖 兵2,萬榮珍1,龍泉鑫3,陳作芬1，邱 嬡1

(1.重慶市第九人民醫(yī)院感染科 400700；2.重慶市第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 400700；3.重慶醫(yī)科大學(xué) 400016)

目的 利用噬菌體生物擴(kuò)增法(PhaB)分析人類免疫缺陷病毒(HIV)合并結(jié)核病(TB)雙重感染患者的結(jié)核分枝桿菌的耐藥狀況，優(yōu)化防治對策。方法 運(yùn)用PhaB法對重慶市第九人民醫(yī)院收治的112例HIV/TB雙重感染患者(HIV/TB組)做TB菌的藥敏檢測，并與208例單純肺結(jié)核患者(單純TB組)的藥敏檢測做對比分析。結(jié)果 HIV/TB組的抗TB藥耐藥率要比單純TB組低，HIV/TB雙重感染患者5種常見抗TB藥物的耐藥率分別為異煙肼(INH)7.14%、吡嗪酰胺(PZA)7.14%、利福平(RFP)5.36%、鏈霉素(SM)5.36%、乙胺丁醇(EMB)4.46%，與單純TB組患者比較(RFP 17.31%、INH 13.46%、PZA 11.54%、EMB 10.58%、SM 9.62%)，HIV/TB組RFP的耐藥率低于單純TB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他4種抗TB藥耐藥率與單純TB組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與絕對濃度法結(jié)果符合率分別為INH 96.4%、RFP 98.2%、PZA 96.4%、EMB 93.8%和SM 96.4%。結(jié)論 本地區(qū)HIV/TB雙重感染患者結(jié)核分枝桿菌對RFP耐藥率較普通肺結(jié)核患者低，與該類患者良好的服藥依從性相關(guān)。PhaB測定所需時(shí)間短，操作簡便，不需特殊儀器設(shè)備，可作為結(jié)核分枝桿菌耐藥性的快速篩選方法。

分枝桿菌噬菌體；獲得性免疫缺陷綜合征；結(jié)核；雙重感染；耐藥

我國是一個(gè)結(jié)核病(tuberculosis,TB)高發(fā)國家，嚴(yán)重威脅人民生命健康，而TB又是HIV/AIDS較常見和先發(fā)生的機(jī)會(huì)性感染。我國TB病疫情的卷土重來，其中一個(gè)重要的原因就是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的流行，TB病加重人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者的病程發(fā)展，AIDS的流行促進(jìn)了TB菌的傳播，因此，HIV和TB的雙重感染被認(rèn)為是一種致死性的結(jié)合模式，已經(jīng)成為我國公共衛(wèi)生的重大問題[1-2]。同時(shí)耐藥結(jié)核分枝桿菌株特別是耐多藥結(jié)核分枝桿菌[至少同時(shí)耐異煙肼(INH)和利福平(RFP)]的逐漸增多使得TB的全球傳播變得更加難以防控。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,結(jié)核分枝桿菌快速檢測、耐藥性篩查及新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)是TB病防治的關(guān)鍵。然而，常規(guī)耐藥性檢測方法耗時(shí)過久，嚴(yán)重影響臨床治療的實(shí)際需要；快速培養(yǎng)測定系統(tǒng)雖然可明顯減少時(shí)間，但仍需4～8 d，且儀器設(shè)備及檢測試劑昂貴；分子生物學(xué)檢測技術(shù)雖然準(zhǔn)確、靈敏，但操作復(fù)雜、對操作者技術(shù)要求高，臨床推廣應(yīng)用較困難。而近年來逐漸開展的噬菌體生物擴(kuò)增法(PhaB)具備操作簡單、快速，不需特殊儀器設(shè)備、對環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)，2～3 d即可獲得結(jié)果，又有較高的敏感度和特異度，非常適合我國中小醫(yī)院及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。

本研究采用PhaB法檢測HIV/TB雙重感染患者痰標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌對常見抗結(jié)核藥物耐藥狀況，為防止該類患者耐藥結(jié)核分枝桿菌的發(fā)生及臨床治療優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將重慶市第九人民醫(yī)院2011-2015年收治的112例HIV/TB雙重感染患者痰標(biāo)本所做的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測與同期208例TB患者的痰標(biāo)本TB耐藥檢測做對比分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 重慶市第九人民醫(yī)院2011-2015年門診和住院收治的HIV/TB雙重感染患者112例，其中男89例，女23例，年齡平均39.2歲(17～72歲)；普通TB患者208例，其中男152例，女56例，平均年齡45.6歲(19～75歲)?；颊咧饕獊碜灾貞c市北碚區(qū)、合川區(qū)、渝北區(qū)、四川省廣安市等地區(qū)。

1.2 試劑 無淀粉改良羅氏培養(yǎng)基購于青島海博生物科技有限公司。INH、RFP、吡嗪酰胺(PZA)購于上海信宜藥廠。鏈霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)購于西南藥業(yè)公司。Middlebrook 7H9培養(yǎng)基購于BD公司。恥垢分枝桿菌(ATCC607)購于國家菌種保藏中心。硫酸亞鐵胺購于Sigma公司。分枝桿菌噬菌體D29由上海肺科醫(yī)院贈(zèng)送。

1.3 研究對象分組方案

1.3.1 入組患者按我國AIDS防治指南(2005版)及肺結(jié)核診療指南(2013版)制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)納入，并按試驗(yàn)要求分組如下：HIV/TB組(痰涂片陽性)112例；單純TB組(痰涂片陽性)208例。

1.3.2 抗結(jié)核藥物耐藥分類標(biāo)準(zhǔn) 初始性耐藥：既往未進(jìn)行過抗結(jié)核治療或接受抗結(jié)核治療不滿1個(gè)月發(fā)生的抗藥物耐藥。獲得性耐藥：既往進(jìn)行抗結(jié)核治療1個(gè)月以上發(fā)生的抗結(jié)核藥物耐藥。多重耐藥：同一標(biāo)本出現(xiàn)2種或2種以上抗結(jié)核藥物耐藥。

1.4 檢測方法

1.4.1 PhaB法 取0.1 mL噬菌體與待檢菌液混勻作用約1 h，然后加入 0.1 mL殺毒劑，混勻，室溫作用約10 min，再加入5 mL改良羅氏培養(yǎng)基和1 mL指示細(xì)胞，混勻后與等量熔化瓊脂混合澆注平板，冷卻、成形后置 37 ℃培養(yǎng)18～24 h，最后觀察平板有無出現(xiàn)噬菌斑并計(jì)數(shù)。每次檢測均設(shè)噬菌體對照、殺毒劑對照、陰性及陽性對照。結(jié)果觀察：肉眼觀察，數(shù)出平板上的噬菌斑，同一平板上的噬菌斑數(shù)至少經(jīng)過2人確認(rèn)。耐藥性判斷：計(jì)算每個(gè)菌株的加藥管與對照管的噬菌斑減少率(加藥管噬菌斑個(gè)數(shù)/對照管噬菌斑個(gè)數(shù)×100%)，敏感為噬菌斑減少率大于或等于95%，反之為耐藥。

1.4.2 絕對濃度法 參照中國防癆協(xié)會(huì)制訂的操作規(guī)程[2],用pH值約為5．5的改良羅氏固體培養(yǎng)基，進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌的絕對濃度法5種抗結(jié)核藥物耐藥性檢測，藥物終濃度分別為INH 1 μg/mL，RFP 50 μg/mL，PZA 100 μg/mL，EMB 5 μg/mL，SM 10 μg/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對所有檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PhaB檢測5種抗結(jié)核藥耐藥性結(jié)果 HIV/TB組與單純TB組5種抗結(jié)核藥的耐藥率：HIV/TB耐藥率分別為INH 7.14%、PZA 7.14%、RFP 5.36%、SM 5.36%、EMB 4.46%。單純TB組耐藥分別為RFP 17.31%、INH 13.46%、PZA 11.54%、EMB 10.58%、SM9.62%。其中RFP的耐藥率低于單純TB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，其余4種抗結(jié)核藥耐藥率與單純TB組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 TB/HIV和單純TB的耐藥率比較

表2 TB/HIV和單純TB患者的初始、獲得、多重及總耐藥率比較[n/n(%)]

表3 208例單純TB患者PhaB法與絕對濃度法5種抗結(jié)核藥物耐藥性檢測結(jié)果比較

表4 112例HIV/TB患者PhaB法與絕對濃度法5種抗結(jié)核藥耐藥性檢測結(jié)果比較

2.2 2組患者初始、獲得與總耐藥率 HIV/TB組初始耐藥率為22.99%，獲得耐藥率為28.00%，多重耐藥率為3.57%，總耐藥率為24.11%；單純TB組初始耐藥率、獲得耐藥率、多重耐藥率、總耐藥率分別為29.63%、46.58%、19.71%、35.58%。兩組比較其中多重耐藥率、總耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 PhaB檢測單純TB組患者5種抗結(jié)核藥物耐藥性結(jié)果和絕對濃度法檢測結(jié)果對比 分別用PhaB法和絕對濃度法檢測208份單純TB患者痰標(biāo)本5種抗結(jié)核藥物耐藥性。以絕對濃度法檢測結(jié)果為檢測標(biāo)準(zhǔn)，則PhaB法對5種抗結(jié)核藥耐藥性檢測的敏感度、特異度和準(zhǔn)確率分別為：INH 92.9%、99.4%、98.6%，RFP 91.7%、99.4%、98.1%，PZA 79.2%、97.8%、95.7%，EMB 90.9%、97.3%、96.6%、SM，78.9%、97.4%、95.6%，提示PhaB法檢測結(jié)果和經(jīng)典的絕對濃度法高度一致，見表3。

2.4 PhaB檢測HIV/TB組患者5種抗結(jié)核藥物耐藥性結(jié)果和絕對濃度法檢測結(jié)果對比 分別用PhaB法和絕對濃度法檢測112份HIV/TB患者痰標(biāo)本5種抗結(jié)核藥耐藥性。以絕對濃度法檢測結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)。則PhaB法對5種抗結(jié)核藥耐藥性檢測的敏感度、特異度和準(zhǔn)確率分別為INH 71.4%、98.1%、96.4%，RFP 83.3%。99.1%。98.2%，PZA 57.1%、99%、96.4%，EMB 60%、95.3%、93.8%，SM 66.7%、98.1%、96.4%，見表4。

3 討 論

目前我國TB發(fā)病人數(shù)僅次于印度居世界的第2位，疫情十分嚴(yán)峻。同時(shí)隨著AIDS在我國的逐漸流行，該類患者細(xì)胞免疫功能低，HIV病毒破壞機(jī)體的CD4+T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的正常免疫功能，可導(dǎo)致感染者發(fā)生內(nèi)源或外源性的TB菌感染，從而導(dǎo)致AIDS合并TB患者逐漸增多，有研究顯示，HIV感染可使TB的發(fā)病率增加30倍[3]。反之，結(jié)核分枝桿菌感染可激活CD4+T淋巴細(xì)胞，為HIV病毒復(fù)制提供更多宿主細(xì)胞，加速AIDS病情進(jìn)展。因此，AIDS的流行已成為我國TB死灰復(fù)燃的主要原因。國內(nèi)外有學(xué)者調(diào)查顯示HIV/TB感染者對抗結(jié)核藥物的耐藥性高于HIV陰性者，其中以RFP和INH最為突出,Yoshiyama等[4]于1996-1998年的25個(gè)月期間在泰國北部的ChiangRai省，Haar等[5]于1993-2001年間在荷蘭調(diào)查HIV/TB的耐藥情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIV陽性患者TB獲得性耐藥發(fā)病率高于HIV陰性者。鄭獻(xiàn)民[6]對河南省某AIDS高發(fā)地區(qū)HIV感染合并耐多藥肺結(jié)核的成因進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯于24例HIV(+)合并耐多藥患者均為獲得性耐多藥。而本研究顯示本地區(qū)TB/HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌對INH、RFP、SM、PZA、EMB耐藥率比單純TB患者低，且其中對RFP的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究還顯示HIV/TB雙重感染者多重耐藥率、總耐藥率也低于單純TB患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此本研究結(jié)果考慮與如下因素有關(guān)：(1)與依從性的教育差別有關(guān)：筆者在TB/HIV雙重感染者初次就診時(shí)即重視服藥依從性教育，絕大多數(shù)TB/HIV雙重感染者服藥依從性可達(dá)到90%以上，良好的服藥依從性是TB/HIV雙重感染者耐藥率降低的主要原因，而單純TB患者因?qū)膊”旧碇匾暡蛔愕仍驅(qū)е路幰缽男暂^差，提示要降低普通TB患者的耐藥率需要加強(qiáng)對患者的依從性教育。(2)HIV感染者出現(xiàn)肺外TB可能性較高，有學(xué)者統(tǒng)計(jì)其發(fā)生率達(dá)54．8%[7]，如果肺外TB按普通TB治療，常因?yàn)榀煶滩蛔銓?dǎo)致復(fù)發(fā)，進(jìn)而誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生，而TB/HIV雙重感染者往往抗結(jié)核治療療程足，因此耐藥率較低。(3)早期診斷的重要性：本院對于TB或HIV患者均進(jìn)行HIV和結(jié)核的篩查，這樣對于無明顯癥狀的HIV/TB患者可早期診斷，盡早治療，從而減少耐藥的發(fā)生。(4)AIDS規(guī)范化治療對TB治療的影響：目前，我國對AIDS患者進(jìn)行免費(fèi)HARRT治療，要求患者在?？漆t(yī)生指導(dǎo)下規(guī)律用藥，全程監(jiān)管，這對于合并TB的患者進(jìn)行抗TB治療亦有一定作用。因此，對于TB/HIV雙重感染者，應(yīng)在有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)務(wù)人員按照抗結(jié)核治療用藥原則即早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、全程指導(dǎo)下進(jìn)行治療，整個(gè)治療期間重視依從性教育，減少耐藥性的產(chǎn)生。

PhaB是一種操作簡單、費(fèi)用低廉、快速地檢測結(jié)核耐藥的新方法，與常規(guī)結(jié)核耐藥性檢測結(jié)果符合率高，目前認(rèn)為這是一種極具發(fā)展前景的新方法[8]。其基本原理是：對于生長緩慢的結(jié)核分枝桿菌和快速生長的恥垢分枝桿菌，分枝桿菌噬菌體D29均能感染。當(dāng)抗結(jié)核藥物與結(jié)核桿菌作用一定時(shí)間后，敏感株因被抗結(jié)核藥物殺死，而耐藥菌能繼續(xù)生長，并被隨后加入的噬菌體所感染，隨后加入殺毒劑殺死未能感染結(jié)核分枝桿菌的噬菌體。而進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響，從而在菌體內(nèi)大量繁殖，并將結(jié)核分枝桿菌裂解，釋放出的噬菌體可立即感染隨后加入的恥垢分枝桿菌(指示菌)并使其裂解，由于指示菌繁殖迅速，所以24h觀察到在培養(yǎng)皿上會(huì)出現(xiàn)明顯噬菌斑。因此，只要根據(jù)噬菌斑的有無及數(shù)量的多少即可判斷待檢菌株的耐藥性[9]。目前，國內(nèi)尚未見用該方法對HIV/TB雙重感染者進(jìn)行耐藥性檢測研究的報(bào)道。本研究顯示：PhaB法具有較高的敏感度、特異度，與Sharma等[10]研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果與常規(guī)絕對濃度法比較，所需的時(shí)間僅為3 d，大大快于常規(guī)檢測方法，且成本較低，操作簡單。由于條件限制，本研究未對兩種方法結(jié)果不符的標(biāo)本進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)和基因芯片方法檢測。同時(shí)該方法可簡便、快速獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果[11]，能基本滿足臨床診治要求，肉眼即可觀察結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備，成本低廉，便于在中小醫(yī)院及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用[12]。對及時(shí)篩查耐藥的肺結(jié)核患者有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。此外，利用該法進(jìn)行檢測中耐藥菌株被完全裂解，不易造成院內(nèi)感染和環(huán)境污染，對耐藥結(jié)核分枝桿菌預(yù)防和控制極為有利。

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Study on antimicrobial resistance of anti-tuberculosis drugs in patients with double infection of HIV/TB using phage bio-amplification method

HeMaorui1,XiangMingque1△,LuoYi2,LiaoBing2,WanRongzhen1,LongQuanxin3,ChenZuofen1,QiuYuan1

(1.DepartmentofInfection，ChongqingNinthPeople′sHospital,Chongqing400700,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingNinthPeople′sHosptial,Chongqing400700,China;3.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To analyze the drug resistance status of mycobacterium tuberculosis in patients with double immunization of human immunodeficiency virus (HIV) and tuberculosis (TB) by phage bioassay (PhaB),and to optimize the control strategy.Methods One hundred and twelve cases of HIV/TB infected patients in Chongqing Ninth People ′s Hospital were treated with PhaB method,and the drug susceptibility testing results were compared with 208 cases of simple pulmonary tuberculosis patients.Results The anti-tuberculosis drug resistance rate of HIV/TB patients was lower than that of simple pulmonary tuberculosis patients.The resistance rates of 5 common anti-tuberculosis drugs in HIV/TB patients were 7.14% of isoniazid (INH),7.14% of pyrazinamide (PZA),5.36% of rifampicin(RFP)streptomycin(SM),and 4.46% of ethambutol (EMB),compared with simple pulmonary tuberculosis(resistance rates of RFP were 17.31%,INH 13.46%,PZA 11.54%,EMB 10.58%,SM 9.62%),RFP resistance rate of HIV/TB infected patients was lower(P<0.05).There was no significant difference between two groups in the other four anti-tuberculosis drug(P>0.05).The coincidence rate with the absolute concentration method were INH 96.4%,RFP 98.2%,PZA 96.4%,EMB 93.8% and SM 96.4%,respectively.Conclusion The resistance rate of mycobacterium tuberculosis to RFP in patients with HIV/TB infection in this region is lower than that in patients with common pulmonary tuberculosis,which is related to the good medication compliance of these patients.PhaB has the characteristic of fast,simple,without special equipment,it can be used as a rapid screening of mycobacterium tuberculosis drug resistance method.

mycobacterium tuberculosis;acquired immunodeficiency syndrome;tuberculosis;double infection;drug resistance

重慶市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(渝衛(wèi)科技2011-2-398)。

何茂銳(1979-) ，副主任醫(yī)師，主要從事艾滋病防治研究。

△通信作者，E-mail:mqxiang@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.016

R516

A

1671-8348(2017)23-3219-03

2017-02-02

2017-03-23)

論著·臨床研究