老年漢族人群KL基因G-395A多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及胱抑素C水平的相關(guān)性分析

劉 瑋,張韶英,徐慧敏,管斯斯

(湖北省武漢市中心醫(yī)院老年科 430014)

老年漢族人群KL基因G-395A多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及胱抑素C水平的相關(guān)性分析

劉 瑋,張韶英△,徐慧敏,管斯斯

(湖北省武漢市中心醫(yī)院老年科 430014)

目的 研究華中地區(qū)老年漢族人群Klotho(KL) 基因的G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱冠心病)及胱抑素C(Cys-C)水平的相關(guān)性。方法 選取該院老年科(年齡大于或等于60歲)漢族冠心病患者138例(冠心病組)，無(wú)冠心病老年人140例(對(duì)照組)作為研究對(duì)象，用TaqMan基因探針?lè)ǚ謩e檢測(cè)兩組KL基因G-395A位點(diǎn)的基因型，并分析該位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠心病及血清Cys-C水平的相關(guān)性。結(jié)果 與對(duì)照組相比，冠心病組KL基因的G-395A位點(diǎn)GG基因型頻率明顯增高(P<0.05)，AA基因型和AG基因型的頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。無(wú)論在對(duì)照組還是冠心病組，GG基因型的人Cys-C水平均高于AA和AG基因型。結(jié)論 在華中地區(qū)老年漢族人群中，KL基因的G-395A位點(diǎn)為GG基因型的人患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)較高。KL基因G-395A位點(diǎn)的基因突變可能通過(guò)影響血Cys-C水平，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

Klotho基因；多態(tài)性,單核苷酸；半胱氨酸蛋白酶抑制劑；冠心??；老年人

KL基因是于1997年在小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的能抑制衰老及各種衰老相關(guān)表現(xiàn)(如壽命縮短、骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈硬化、軟組織鈣化、皮膚萎縮、肺氣腫等)的基因[1]。研究表明，KL基因敲除(KL-/-)的小鼠在出生不久后就開始出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的征象(如內(nèi)膜增厚、主動(dòng)脈鈣化等)，并隨著增齡逐漸加重[1]。而把外源性的KL cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入KL-/-的小鼠體內(nèi)后，其動(dòng)脈粥樣硬化的程度能夠得到顯著的改善[2]。上述研究成果表明，KL基因與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。然而，KL基因參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，血清胱抑素C(cystaint,Cys-C)參與了炎性反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱冠心病)的發(fā)生、發(fā)展有十分密切的關(guān)系[3-4]。本研究擬通過(guò)對(duì)KL基因G-395A多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，探討KL基因的G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與華中地區(qū)老年漢族人群冠心病發(fā)病的相關(guān)性，同時(shí)通過(guò)對(duì)血清Cys-C水平的檢測(cè)，探討KL基因多態(tài)性參與冠心病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3-11月在本院老年科病房住院的患者，隨機(jī)選取老年(≥60歲)住院患者278例(其中男136 例，女142 例，年齡60～97歲)。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于或等于60歲，無(wú)血緣相關(guān)關(guān)系的、愿意參加項(xiàng)目研究者。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有參加的研究對(duì)象均簽署知情同意書。病例分組：根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影和(或)冠狀動(dòng)脈非創(chuàng)傷性血管成像技術(shù)(CTA)結(jié)果將入選對(duì)象分為冠心病組(138例)和對(duì)照組(無(wú)冠心病)。冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)按照J(rèn)udkin′s法：根據(jù)1975年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)分段分類法的標(biāo)準(zhǔn)將冠狀動(dòng)脈進(jìn)行分段，至少在兩個(gè)以上的X線片投影位置能看到冠狀動(dòng)脈的分支段狹窄大于或等于50%的可以診斷為冠心病。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有對(duì)象于清晨空腹抽取肘正中靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,用DNA抽提試劑盒提取DNA(中國(guó)大連寶生物工程技術(shù)有限公司)。

1.2.2 KL基因G-395A 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè) 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心的Gene-Bank獲取KL基因序列及G-395A位點(diǎn)的SNP 信息(rs1207568)。由美國(guó)ABI公司合成TaqMan 引物和探針，采用2×TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒(ABI公司，貨號(hào)4351379，批號(hào)P130715-008E09)進(jìn)行試驗(yàn)，在熒光定量PCR儀(ABI Stepone plus型)上進(jìn)行擴(kuò)增。探針1:(VIC)-AGT CGG GAA AAG T-(MGB)；探針2:(FAM)-CAA GTC GGG GAA AG-(MGB)；上游引物：5′-TAG GGC CCG GCA GGA T-3＇；下游引物：5′-CCT GGA GCG GCT TCG TC-3＇；反應(yīng)體系為：40×引物和TaqMan探針混合物0.5 μL，2×TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL，共20 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸各1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 血清Cys-C水平檢測(cè) 對(duì)所有入選的病例進(jìn)行清晨空腹肘正中靜脈采血，使用北京利德曼生化股份有限公司提供的血清測(cè)定試劑盒,由專人使用北京利德曼生化分析儀采用顆粒增強(qiáng)散射免疫比濁法測(cè)定血清中Cys-C水平。血清中Cys-C水平參考范圍為0.63～1.25 mg/L。

1.2.4 一般資料及生化指標(biāo)錄入 記錄入選病例的年齡，吸煙史、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血壓、清晨空腹血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。(1)每天吸煙超過(guò)1支，吸煙時(shí)間超過(guò)1年的記錄為有吸煙史；(2)已經(jīng)接受降壓藥物治療，或者非同日兩次以上測(cè)量收縮壓(SBP)≥140 mm Hg或舒張壓(DBP)≥90 mm Hg記錄為高血壓；(3)已經(jīng)接受降糖藥物治療或者空腹血糖大于或等于7.0 mmol/L、或者餐后血糖大于或等于11.1 mmol/L記錄為糖尿病；(4)已經(jīng)接受降脂藥物治療或TC>5.7 mmol/L或TG>2.3 mmol/L或LDL>3.7 mmol/L均記錄為高血脂。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與對(duì)照組的臨床資料分析 冠心病組和對(duì)照組的年齡、DBP、TC、TG、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；冠心病組血糖、SBP、LDL、HDL水平、男性比例及吸煙比例明顯高于對(duì)照組，而HDL水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 冠心病組與對(duì)照組的KL基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性分布 KL基因型的分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合HaIdy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。與對(duì)照組比較，冠心病組GG基因型明顯升高，AA基因型及AG基因型與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；G等位基因頻率明顯升高，A等位基因頻率明顯降低。見表2。

2.3 KL基因G-395A位點(diǎn)GG基因型與老年冠心病的相關(guān)性 在調(diào)整年齡、性別、吸煙史、高血壓、高血脂和高血糖等因素并經(jīng)多元Logistic回歸分析后，GG基因型與老年冠心病存在相關(guān)性，GG基因型為老年冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，見表3。

2.4 KL基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與血清Cys-C的關(guān)系 無(wú)論在對(duì)照組還是冠心病組，GG基因型的Cys-C水平均高于AA基因型和AG基因型。AA基因型和AG基因型的Cys-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表1 兩組基本資料比較

表2 KL基因 G-395A 的多態(tài)性分布[n(%)]

表3 多元Logistic回歸分析KL基因G-395A位點(diǎn)GG基因型與老年冠心病的關(guān)系

表4 KL基因 G-395A 多態(tài)性與Cys-C水平的相關(guān)性

a：P< 0.05，與同組GG基因型比較比較

3 討 論

研究證實(shí)，人類KL基因G-395A位點(diǎn)的多態(tài)性與心源性腦卒中、冠心病、原發(fā)性高血壓等心血管系統(tǒng)疾病關(guān)系密切[5-7]。然而，國(guó)內(nèi)外研究對(duì)KL基因G-395A位點(diǎn)的多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性有不同的結(jié)論。Rhee等[7]發(fā)現(xiàn)在韓國(guó)60歲以上的人群中，KL基因G-395A位點(diǎn)A等位基因?qū)谛牟【哂斜Ｗo(hù)作用。而在Imamura等[5]對(duì)日本人群KL基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)，A等位基因攜帶者其冠心病患病率較高。國(guó)內(nèi)在對(duì)重慶地區(qū)的漢族人群G-395A位點(diǎn)多態(tài)性的研究中，發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶頻率與動(dòng)脈硬化呈負(fù)相關(guān)[8]。因此推測(cè)上述不同的研究結(jié)論產(chǎn)生的可能原因?yàn)镵L基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的關(guān)系可能存在著某些種族、地域和年齡效應(yīng)，且與樣本量的大小有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在華中地區(qū)60歲以上的老年漢族人群中，A等位基因攜帶者其冠心病患病率較低，這與韓國(guó)和重慶地區(qū)的相關(guān)研究結(jié)果相符[9]。在調(diào)整年齡、性別、吸煙史、高血壓、高血脂和高血糖等傳統(tǒng)的冠心病危險(xiǎn)因素并經(jīng)多元Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，GG基因型與老年冠心病存在相關(guān)性，GG基因型為老年冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。本研究為探討KL基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性補(bǔ)充了一部分華中地區(qū)老年人群的數(shù)據(jù)庫(kù)信息。然而，本研究?jī)H限于單位點(diǎn)、單種族、單年齡段且樣本量有限，KL基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系有待于多位點(diǎn)突變的發(fā)現(xiàn)和多地域、多民族廣泛深入的協(xié)同研究。

目前認(rèn)為冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和發(fā)展過(guò)程與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重構(gòu)及冠狀動(dòng)脈血管壁重塑有密切聯(lián)系[10-11]。Cys-C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員之一，Cys-C通過(guò)調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶活性，參與ECM產(chǎn)生和降解的動(dòng)態(tài)平衡，還可能通過(guò)影響粒細(xì)胞的吞噬與趨化功能，參與炎癥過(guò)程，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[12-14]，是預(yù)測(cè)冠心病患者發(fā)生心臟事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在華中地區(qū)60歲以上的老年人群中，KL基因G-395A位點(diǎn)野生型攜帶者(GG基因型)血清Cys-C水平無(wú)論在對(duì)照組和冠心病組均明顯高于突變型攜帶者(GA基因型和AA基因型)?；虬l(fā)生突變可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄決定蛋白質(zhì)合成的氨基酸序列的改變，引起Cys-C合成和分泌量的降低，對(duì)半胱氨酸蛋白酶活性的抑制也可能減弱，減輕ECM的沉積及炎性反應(yīng)，從而延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。KL基因G-395A位點(diǎn)的G-A突變可能通過(guò)降低血Cys-C水平，減輕ECM的重構(gòu)及冠狀動(dòng)脈血管壁重塑，從而抑制冠心病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，筆者認(rèn)為在華中地區(qū)老年漢族人群中，KL基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的發(fā)病相關(guān)，A等位基因攜帶者其冠心病患病率較低，GG基因型為老年冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。KL基因G-395A位點(diǎn)的基因突變可能通過(guò)影響血Cys-C水平，抑制冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

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Association of KL gene G-395A polymorphisms with coronary heart disease and serum cystatin C level in the elderly Chinese Han population in central China*

LiuWei，ZhangShaoying△，XuHuimin，GuanSisi

(DepartmentofGeriatrics，theCentralHospitalofWuhancity,Wuhan,Hubei430014,China)

Objective To investigate the single nucleotide polymorphism at G-395A site of the Klotho (KL) gene and to analyze its correlation with the coronary heart disease(CHD) and serum Cystatin C(Cys-C) level in the elderly Chinese Han population in central China.Methods A case-control study was conducted in 278 elderly Chinese Han population in this department,who were divided into CHD group(138 cases)and control group(140 cases) according to bear angiography coronary or not.G-395A polymorphism of KL gene was determined by TaqMan Gene probe method,and the relationship between G-395A polymorphism and coronary heart disease and serum Cys-C level was analyzed.Results Compared with the control group,the frequency of GG genotype of G-395A in CHD group was significantly higher,and the frequency of AA genotype and AG genotype was not statistically significant.The levels of Cys-C in the GG genotype were higher than those in the AA and AG genotypes both in the control group and coronary heart disease group.Conclusion In the elderly Han population in central China,the risk of suffering coronary heart disease is higher among the GG genotype of the G-395A locus of the KL gene.KL gene G-395A site gene mutation may affect the development of atherosclerosis by affecting blood Cys-C levels.

Klotho gene；polymorphism,single nucleotide；cysteine proteinase inhibitors；Atherosclerosis；aged

湖北省武漢市科技局資助課題(201260523187-4)；湖北省武漢市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研計(jì)劃資助項(xiàng)目(WX12C04)。

劉瑋(1981-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事衰老及動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究。

△通信作者，E-mail：5622788@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.012

R543．3

A

1671-8348(2017)23-3206-03

2017-01-24

2017-03-15)

論著·臨床研究